추출 및 인간과 원숭이의 머리에서 코르티솔 분석
Summary
코르티솔 (CORT)은 인간과 인간이 아닌 영장류의 성장 머리 갱구에 축적. 우리는 높은 정밀도 및 감도로 머리 CORT를 추출하고 분석하는 방법을 설명합니다. 머리 CORT의 측정은 특히 개월 주 기간 동안 만성 스트레스를 평가하기에 적합합니다.
Abstract
스트레스 호르몬 코르티솔 (CORT)은 서서히 인간, 비인간 영장류, 그리고 다른 포유 동물의 성장 머리 샤프트에 통합됩니다. 우리는 개발과 검증 된 붉은 털 원숭이의 머리에서 CORT 추출 및 분석하는 방법을 연속적으로 인간의 두피 모발에 사용하기 위해이 방법을 적용. 플라즈마 또는 침에서 얻은 CORT "포인트 샘플"대조적으로, 머리 CORT 호르몬 결합의 기간 동안, 시상 하부 – 뇌하수체 – 부 신피질 (HPA) 시스템 활동의 통합 측정, 따라서 생리적 인 스트레스를 제공합니다. 사람의 두피에 머리가 1cm / 월의 평균 속도로 성장하고 있기 때문에, 머리 부분에서 얻은 CORT 수준의 길이는 몇 cm 잠재적 개월 수에 대한 경험이 스트레스의 바이오 마커 역할을 할 수 있습니다.
우리의 방법에서, 각 모발 샘플은 제 땀과 피지에서 증착 된 머리 샤프트의 외부로부터 어떠한 CORT 제거 이소프로판올에 두 번 세척한다. 건조 후,샘플은 모발 단백질의 행렬을 분해 및 추출을위한 표면적을 증가시키는 미세 분말로 분쇄된다. 모간의 내부로부터 CORT 메탄올로 추출하고, 메탄올을 증류 제거하고, 추출액을 분석 완충액에서 재구성된다. 추출 CORT, 표준 및 품질 관리와 함께, 다음 민감하고 특정 시판 효소 면역 측정법 (EIA) 도구에 의해 분석된다. EIA의 판독은 MG 분말 머리 무게 당 PG의 CORT으로 변환됩니다. 이 방법은 인간의 머리 CORT을 분석하기 위해 실험실에서 사용 된, 짧은 꼬리 원숭이, 명주 원숭이, 개, 그리고 북극곰의 몇몇 종. 우리가 실험실에서와 다른 연구 그룹 모두에서 많은 연구가 자연에 만성 스트레스에 노출을 평가뿐만 아니라 실험실 설정에 대한 머리 CORT의 광범위한 적용 가능성을 증명하고있다.
Introduction
혈장, 타액, 또는 때때로 소변이나 대변의 CORT 측정 스트레스 1 HPA 축의 역할 Selye 디스커버리시기 생리적 스트레스의 지표로서 사용되었다. 수많은 논문이 급성 스트레스 상황에 HPA 활동과 관련된 발행되었지만, 필드는 만성 생리적 스트레스 간단하고 신뢰성 지수의 부족에 의해 방해되었다. 이 문제가 발생주기 차이가있을 수있는 환경 교란에 의해 혼동 될 수 HPA 활동의 플라즈마 침 수율 모두 "포인트"예상하기 때문이다. 오줌과 배설물 샘플 어떤 경우에는 하루 종일까지 시간의 숫자에 걸쳐 CORT 및 / 또는 대사 산물의 배설의 측정 값을 얻을 수 있습니다. 그러나, 이들 접근법 중 어느 것도 HPA 활성의 진정한 장기 인덱스 및이 싸이의 응답 성을 제공하지 않는다; 이러한 행렬들의 임의 시간 경과 CORT 레벨의 거친 지수를 제공 할 수있다하여 여러 샘플의 컬렉션만성 스트레스에 줄기.
머리에 CORT를 측정하는 것은 스트레스 문학이 중요한 필요를 채우기 위해 시작했다. 여러 실험실에 의한 초기 연구는 인간의 머리에 CORT의 존재를 증명하지만, 머리 CORT 수준이 스트레스 2의 함수로 변경 여부를 조사하지 않았다. 우리 연구실은 다양한 사회 및 행동 요인 (3)에 의해 붉은 털 원숭이 HPA 축 조절에 몇 년 동안 관심이있다, 우리는 붉은 털 원숭이 머리 4의 추출 및 분석을위한 방법을 설정하고 확인하기 위해 밖으로 설정합니다. 혈액 유래 CORT 천천히 연속적으로 성장하는 모발에 혼입되는 것을 전제로,이 새로운 방법의 목적은 개월 주내 걸쳐서 HPA 활성의 통합 지표로서 헤어 유래 CORT 수준을 사용하는 것이었다.
몇 가지 방법 론적 문제는 본 프로토콜 개발에 발견되었습니다. 첫째, 이전의 연구는 적은 양의 O를 표시했다F 땀과 피지에 배설 CORT을 순환하기 때문에 코트 머리 축 (2)의 외부를 할 수 있습니다. 이러한 잠재적 혼동을 제거하기 위해, 우리는 성장 모간 내에 존재 CORT에 최소한의 효과를 가지면서 외부 CORT 제거 나타나는 온화한 세척 과정을 개발 하였다. 따라서,이 절차 (이소프로판올, 즉 두 개의 3 분 세척) 실시 원숭이 머리 전체 머리 CORT 내용의 약 ~ 8 %를 손실 및 제 3 세척 샘플 4에서 1 % 미만의 더 많은 스테로이드를 제거했습니다. 같은 절차 (게시되지 않은 K. 로젠버그와 J. 마이어) 샘플에서 27 % 총 CORT 콘텐츠의 평균을 제거하기 때문에, 사람의 모발에 더 많은 외부 CORT이있을 나타납니다. 원숭이 머리를 좋아하지만, 추가 세척은 처음 두 세척보다 훨씬 적은 CORT (약 7 %)가 포함되어 있습니다. 따라서, 원숭이 및 사람의 모발 양의 결과가 주요 골절을 유지하면서, 대부분 (전부는 아니더라도) 외부 CORT가 제거 될 수 있다는 논쟁을 지원내부 헤어 매트릭스 내에서 CORT의 기. 둘째, 우리의 파일럿 연구는 또한 보여 주었다 아마도 모간의 복합 단백질 성 매트릭스를 오픈 침입뿐만 아니라 용매의 침투 가능한 표면 면적을 증가시킴으로써, 샘플에서 유의하게 증가 CORT 회수를 추출하여 모발 전에 연삭. 두 개의 서로 다른 연삭 방법은 장점과 단점을 각각 개발되었다. 볼 밀을 사용하여 방법 1, 각종 분말을 제조하는 장점을 갖는다. 그러나, 볼 밀은 비교적 고가의 장비 아이템이며 표준 연삭 항아리와 볼을 사용하는 경우, 한 번에 두 개의 시료를 분쇄 할 수있다. 작은 샘플도 표준 연삭 항아리와 볼 밀을 사용하여 처리하기가 어렵습니다. beadbeater을 사용하는 방법 2, 그것의 분쇄 능력에 덜 효과적이다. 결과적으로, 보통 CORT 복구는 볼밀 (미공개 데이터)와 비교하여이 방법을 사용하여 약 10 % 낮다. 한편, beadbeater상당히 저렴 볼밀보다, 16-24 번 샘플은 모델에 따라에서 접지 될 수 있고, 상기 방법은 작은 샘플에 매우 적합하다. 때문에 상기 차동 회복, 그것은 특정 연구 내 모든 샘플에 대해 동일한 연삭 방법을 사용하는 것이 바람직하다.
모발 샘플을 처리 한 후, 그들은 원래 타액 CORT을 측정하기위한 민감하고 특정 상용 EIA 키트에 의해 분석된다 추출한 메탄올 CORT로 추출된다. 추출 및 분석 절차는 원숭이의 머리 샘플에서 추출의 시리얼 희석 밀접 본격적인 CORT 표준에서 얻은 측정 값을 병렬 EIA 수치를 산출 시연에 의해 부분적으로 확인되었다. 우리는 그 (플라즈마 및 타액 CORT) 외에도 헤어 CORT 새로운 주택 분기 4,5 원숭이의 관리 상 의무 재배치의 주요 생활 스트레스에 민감한 것으로 나타났다. 프리젠T 종이는 인간과 원숭이의 머리 샘플을 처리하고 이러한 샘플에서 CORT를 추출하고 분석하기 위해 실험실에서 일상적으로 사용되는 방법에 대한 자세한 계정을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전술 한 헤어 CORT 절차 수행하도록 심플 상대적으로 저렴하고, 쉽게 이용할 화학 시약 및 소모품의 사용을하게하고, 한 가지 예외 전형적인 분석 실험실에 존재할 가능성이 있다고, 장비를 필요로한다. 예외는 볼밀 미니 beadbeater 같은 연마 장치이다. 우리는 몇 가지 연구 그룹은 작은 조각 길이 12 대략 1mm에 머리 샘플을 말하다 있습니다,하지만 우리는 연삭 수행하는 대신 가능하면 닦지 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 연구에서 분석 사람의 모발 샘플을 제공 Kymberlee 오브라이언, 셀리아 무어, 에드워드 Tronick 씨 (심리학과, 매사 추세 츠, 보스턴 대학교) 감사, 스티븐 개가 아만다 Dettmer (비교 행동학, NICHD의 실험)에 대한 붉은 털 원숭이의 머리 샘플을 제공한다. 초기 개발 및이 방법을 계속 사용 MAN에 NIH RR11122에 의해 지원 된
Materials
| HPLC-grade isopropanol | Fisher | A451 | |
| HPLC-grade methanol | Fisher | A452 | |
| Salivary cortisol assay kits | Salimetrics | 1-3002 | See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity |
| 15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-25 | |
| 2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-7 | |
| 2.0-ml XXTuff reinforced microvials | BioSpec | 330TX | Use with mini-beadbeater |
| 3.2-mm chrome-steel beads | BioSpec | 11079132c | Use with mini-beadbeater |
| 10-ml stainless steel grinding jars | Retsch | 02.462.0061 | Use with mixer mill |
| 12-mm stainless steel grinding balls | Retsch | 05.368.0037 | Use with mixer mill |
| Savant activated carbon cartridge | Fisher | DTK120R | Use with Savant chemical trap |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rotator for 15-ml centrifuge tubes | Fisher | S02135 | |
| Rotator for microcentrifuge tubes | Fisher | NC9854190 | |
| Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 mixer mill | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac | Fisher | DNA120-115 | |
| Savant refrigerated vapor trap | Fisher | RVT400-115 | |
| Savant chemical trap | Fisher | SCT120 | Alternative to refrigerated vapor trap |
| Microplate reader | |||
| Microplate washer | |||
| Microplate mixer | |||
| Multichannel pipetter | |||
| Analytical balance |
Referências
- Selye, H. Stress and the general adaptation syndrome. Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model. Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).
- Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function. Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).
- Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. Hair as a retrospective calendar of cortisol production – Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy. Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).
- Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations. Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).
- Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. Evaluation of a method to measure long term cortisol levels. Steroids. 76, 1032-1036 (2011).
- Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing’s syndrome. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).
- LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair. Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).
- Dolnick, E. H., Montagna, W., Dobson, R. L. Variability of hair growth in Macaca mulatta. Adv. Biol. Skin. IX, 121-128 (1969).
- Sauvé, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. a. n., H, S. Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure. Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).
- Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications. Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).
- Bechshøft, T. &. #. 2. 1. 6. ;., Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears. Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).
- Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair. Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).
- Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol. FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).
- Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions. Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).
- Stalder, T., Kirschbaum, C. Analysis of cortisol in hair – State of the art and future directions. Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).
- Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review. Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).
