Estrazione e analisi di cortisolo da umani e Monkey Capelli

Summary

Cortisolo (CORT) si accumula nel fusto del pelo crescente di esseri umani e primati non umani. Descriviamo metodi per l'estrazione e l'analisi dei capelli CORT con alta precisione e sensibilità. Misura di capelli CORT è particolarmente adatto per la valutazione dello stress cronico per periodi di settimane o mesi.

Abstract

Il cortisolo, ormone dello stress (CORT) sta lentamente incorporato nel fusto del capello crescente di esseri umani, primati non umani, e altri mammiferi. Abbiamo sviluppato e validato un metodo per l'estrazione e l'analisi CORT da capelli scimmia rhesus e successivamente adattato questo metodo per l'utilizzo con i capelli del cuoio capelluto umano. In contrasto CORT "campioni point" ottenuti dal plasma o saliva, capelli CORT fornisce una misura integrata di attività del sistema ipotalamo-ipofisi-surrene (HPA), e quindi lo stress fisiologico, durante il periodo di ormone incorporazione. Perché i capelli del cuoio capelluto umano cresce ad un tasso medio di 1 cm / mese, i livelli di CORT ottenuti dai segmenti di capelli diversi cm di lunghezza possono potenzialmente servire come biomarcatore di stress sperimentato un certo numero di mesi.

Nel nostro metodo, ciascun campione di capelli viene prima lavato due volte in isopropanolo per rimuovere eventuali CORT dall'esterno del fusto del capello che è stato depositato dal sudore o sebo. Dopo l'essiccazione, lacampione viene macinato in polvere finissima per rompere matrice proteica del capello e aumentare la superficie per l'estrazione. CORT dall'interno del fusto del capello è estratto in metanolo, il metanolo viene evaporato, e l'estratto viene ricostituito in tampone di saggio. Estratto CORT, con norme e controlli di qualità, viene poi analizzato mediante un enzima disponibile in commercio immunodosaggio sensibile e specifico (EIA) kit. Lettura della VIA viene convertito in pg CORT per mg peso dei capelli in polvere. Questo metodo è stato utilizzato nel nostro laboratorio per analizzare i capelli CORT negli esseri umani, diverse specie di macachi, uistitì, cani e orsi polari. Molti studi sia dal nostro laboratorio e da altri gruppi di ricerca hanno dimostrato la vasta applicabilità di capelli CORT per la valutazione dell'esposizione stress cronico in naturale così come le impostazioni di laboratorio.

Introduction

Misurazione di CORT nel plasma, saliva, o occasionalmente in urina o feci è stato usato come indice di stress fisiologico Dalla scoperta di Selye del ruolo dell'asse HPA stress ^1. Sebbene numerosi articoli sono stati pubblicati relative attività HPA a situazioni di stress acuto, il campo è stato ostacolato dalla mancanza di un indice semplice e affidabile di stress fisiologico cronico. Questo problema si verifica perché al plasma e saliva sia resa "punto" stime di attività HPA che sono soggette a variazione circadiana e possono essere confusi da disturbi ambientali. Campioni urinari e fecali producono misure di CORT e / o metaboliti che si estendono su un numero di ore fino ad un giorno intero in alcuni casi. Raccolta di campioni multipli utilizzando una delle seguenti matrici possono fornire un indice grezzo composito di livelli CORT nel tempo, tuttavia, nessuno di questi approcci fornisce un indice veramente a lungo termine di attività HPA e la reattività di questa systaminali a fattori di stress cronico.

Misurazione CORT nei capelli ha iniziato ad occupare questa esigenza importante nella letteratura stress. Gli studi iniziali di diversi laboratori hanno dimostrato la presenza di CORT in capelli umani, ma non ha verificato se i livelli di capelli CORT modificate in funzione di stress ^2. Come il nostro laboratorio è stato interessato per molti anni nella regolazione dell'asse HPA scimmia rhesus da vari fattori sociali e comportamentali ^3, abbiamo deciso di stabilire e convalidare metodi per l'estrazione e l'analisi di scimmia rhesus capelli ^4. Basato sulla premessa che CORT ematica viene lentamente e continuamente incorporato in crescita dei capelli, lo scopo di questo nuovo metodo è stato quello di utilizzare livelli di CORT-capelli derivato come indice integrato di attività HPA su periodi di settimane o mesi.

Diverse sfide metodologiche sono state incontrate nello sviluppo del presente protocollo. Primo, studi precedenti avevano dimostrato che piccole quantità of circolante CORT sono escreti nel sudore e sebo e quindi potrebbe rivestire l'esterno del fusto del capello ^2. Al fine di eliminare questo potenziale confondere, abbiamo sviluppato un procedimento di lavaggio delicato che appare per rimuovere CORT esterno pur avendo un effetto minimo sulla CORT presente all'interno del fusto del capello crescente. Così, capelli scimmia sottoposti a questa procedura (cioè due 3-min lavaggi con isopropanolo) perso circa il 7-8% del contenuto totale di capelli CORT, ed un terzo lavaggio rimosso meno dell'1% più steroideo del campione ^4. Sembra che ci sia più CORT esterno in capelli umani, dal momento che la stessa procedura rimossa una media di contenuti CORT totale il 27% dei campioni (K. Rosenberg e J. Meyer, non pubblicati). Come capelli scimmia, tuttavia, un lavaggio supplementare conteneva molto meno CORT (circa 7%) rispetto ai primi due lavaggi. Pertanto, i risultati di entrambi scimmia e capelli umani supportano la tesi che la maggior parte (se non tutti) CORT esterno può essere rimosso, pur mantenendo una grande frazionezione CORT all'interno della matrice interna del capello. In secondo luogo, i nostri studi pilota hanno inoltre dimostrato che la macinazione capelli prima dell'estrazione significativamente maggiore recupero CORT dal campione, presumibilmente rompendo aperto matrice proteica complessa del fusto del capello oltre ad aumentare la superficie disponibile per la penetrazione del solvente. Sono stati sviluppati due diversi metodi di rettifica, ognuna con vantaggi e svantaggi. Metodo 1, che utilizza un mulino a sfere, ha il vantaggio di produrre la polvere più fine. Tuttavia, un mulino a sfere è un elemento dell'impianto relativamente costoso e, se utilizzato con giare standard e palle, è in grado di macinare solo due campioni per volta. Piccoli campioni sono anche difficili da trattare utilizzando un mulino a palle con giare standard. Metodo 2, che utilizza un beadbeater, è meno efficace nella sua capacità di macinazione. Come risultato, recupero medio CORT inferiore di circa il 10% utilizzando questo metodo rispetto al mulino a sfere (dati non pubblicati). D'altra parte, un beadbeaterè considerevolmente meno costoso di un mulino a palle, 16-24 campioni possono essere macinati contemporaneamente a seconda del modello, e il metodo è adatto per piccoli campioni. A causa del recupero differenziale suddetto, è consigliabile utilizzare lo stesso metodo di macinazione per tutti i campioni all'interno di un particolare studio.

Una volta che i campioni di capelli sono stati elaborati, vengono estratti con metanolo e CORT negli estratti viene analizzato mediante un kit EIA commerciale sensibile e specifico originariamente progettato per misurare CORT salivare. Le procedure di estrazione e di analisi sono stati convalidati in parte dimostrando che diluizioni seriali di estratti di campioni di capelli scimmia ha prodotto letture EIA che strettamente parallela alla letture ottenute dagli standard CORT autentici. Abbiamo poi dimostrato che CORT capelli (in aggiunta al plasma e salivare CORT) era sensibile alla importante fattore di stress vita di un trasferimento amministrativo incaricato delle scimmie a nuovi quartieri abitativi ^4,5. La presentazionecarta t fornisce un resoconto dettagliato dei metodi utilizzati di routine nel nostro laboratorio per elaborare campioni di capelli umani e scimmie e per estrarre e analizzare CORT da tali campioni.

Protocol

1. Raccolta dei campioni e conservazione Capelli umani Fissare l'intera lunghezza dei capelli da campionare (fino a una matita larghezza di diametro) con un elastico o clip. Tagli capelli vicino al cuoio capelluto il più possibile (facendo attenzione a non intaccare la pelle), con un paio di forbici pulite. Nota: L'area di campionamento standard è il vertice posteriore del cranio. Alcuni ricercatori hanno segnalato una diminuzione dei livelli di CORT capelli umani con la distanza …

Representative Results

La Figura 1 mostra la stampa da una serie rappresentativa di campioni di capelli umani (maschi adulti e soggetti umani femmine) trattati con il metodo 2 macinazione ed estrazione. Il software è stato utilizzato per generare l'uscita dei dati e per adattarsi a 4 parametri curva sigmoidale agli standard CORT (Figura 2). I tra-ben CV di questa piastra variava 0,01-5,73%, con una media di CV intra-saggio del 1,34%. Il CV inter-assay determinato utilizzando i valori di QC da nove recent…

Discussion

La procedura capelli CORT sopra descritto è semplice da eseguire, è relativamente poco costoso, fa uso di prodotti chimici facilmente disponibili, reagenti e materiali di consumo, e richiede attrezzature che, con una sola eccezione, è probabile che sia presente in un tipico laboratorio di analisi. L'eccezione è un apparecchio di macinazione come un mulino a sfere o mini-beadbeater. Notiamo che alcuni gruppi di ricerca tritare campioni di capelli in piccoli frammenti di circa 1 millimetro di lunghezza ^12,</s…

Materials

HPLC-grade isopropanol	Fisher	A451
HPLC-grade methanol	Fisher	A452
Salivary cortisol assay kits	Salimetrics	1-3002	See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity
15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes	Max Scientific	10-9151
1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Fisher	05-402-25
2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Fisher	05-402-7
2.0-ml XXTuff reinforced microvials	BioSpec	330TX	Use with mini-beadbeater
3.2-mm chrome-steel beads	BioSpec	11079132c	Use with mini-beadbeater
10-ml stainless steel grinding jars	Retsch	02.462.0061	Use with mixer mill
12-mm stainless steel grinding balls	Retsch	05.368.0037	Use with mixer mill
Savant activated carbon cartridge	Fisher	DTK120R	Use with Savant chemical trap
Name of Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rotator for 15-ml centrifuge tubes	Fisher	S02135
Rotator for microcentrifuge tubes	Fisher	NC9854190
Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes	Fisher	13-100-675
MM 200 mixer mill	Retsch	20.746.0001
Mini-Beadbeater 16	BioSpec	607
Savant DNA Speedvac	Fisher	DNA120-115
Savant refrigerated vapor trap	Fisher	RVT400-115
Savant chemical trap	Fisher	SCT120	Alternative to refrigerated vapor trap
Microplate reader
Microplate washer
Microplate mixer
Multichannel pipetter
Analytical balance