Extractie en analyse van Cortisol van de mens en de Monkey Hair
Summary
Cortisol (CORT) hoopt zich op in de groeiende haarschacht van mensen en niet-humane primaten. We beschrijven methoden voor de extractie en analyse van haar CORT met hoge precisie en gevoeligheid. Meting van haar CORT is bijzonder geschikt voor het beoordelen van chronische spanning gedurende een periode van weken tot maanden.
Abstract
Het stresshormoon cortisol (CORT) wordt langzaam opgenomen in de groeiende haarschacht van mensen, niet-humane primaten en andere zoogdieren. We ontwikkeld en gevalideerd in een werkwijze voor CORT extractie en analyse van resusaap haar en vervolgens paste deze methode voor gebruik met menselijke hoofdhaar. In tegenstelling tot CORT "point samples" verkregen uit plasma of speeksel, haren CORT biedt een geïntegreerde meting van de hypothalamus-hypofyse-bijnierschors (HPA)-systeem activiteit, en dus fysiologische stress, tijdens de periode van hormoon oprichting. Omdat de menselijke hoofdhaar groeit met een gemiddelde snelheid van 1 cm / maand, CORT niveaus verkregen van haar segmenten enkele cm in lengte kan mogelijk dienen als een biomarker van stress ervaren gedurende een aantal maanden.
In onze methode wordt elke haar monster eerst tweemaal gewassen in isopropanol elk CORT van de buitenkant van de haarschacht, dat is afgegeven door zweet of talg verwijderen. Na droging bevatte demonster wordt gemalen tot een fijn poeder te breken van het haar eiwitmatrix en verhoging van de oppervlakte voor extractie. CORT uit het inwendige van de haarschacht wordt in methanol geëxtraheerd, wordt de methanol afgedampt en het extract wordt opgelost in assaybuffer. Gewonnen CORT, samen met standaarden en kwaliteitscontroles wordt vervolgens geanalyseerd met behulp van een gevoelige en specifieke commercieel beschikbare enzym-immunoassay (EIA) kit. Uitlezing van de EIA wordt omgezet in pg CORT per mg gepoederd haar gewicht. Deze werkwijze is gebruikt in ons laboratorium haren CORT analyseren mensen verschillende soorten makaken, zijdeaapjes, honden en ijsberen. Veel studies zowel vanuit ons lab en van andere onderzoeksgroepen hebben de brede toepasbaarheid van haar CORT voor de beoordeling van chronische blootstelling aan stress in zowel natuurlijke als laboratorium instellingen aangetoond.
Introduction
Meting van CORT in plasma, speeksel, of nu in urine of ontlasting is gebruikt als een index van fysiologische stress sinds ontdekking van de functie van de HPA-as stress 1 Selye's. Hoewel talrijke artikelen gepubliceerd met betrekking HPA activiteit acuut stressvolle situaties, is het gebied belemmerd door het gebrek aan een eenvoudige en betrouwbare index van chronische fysiologische stress. Dit probleem doet zich voor omdat het plasma en speeksel zowel opbrengst "punt" schattingen van HPA activiteit die onderworpen zijn aan circadiane variatie zijn en kan worden verstoord door verstoringen van het milieu. Urine en fecale monsters leveren metingen van CORT en / of metabolietenuitscheiding dat een aantal uren tot een volledige dag in sommige gevallen overspannen. Verzamelen van meerdere monsters met een van deze matrices kunnen een ruwe samengestelde index van CORT niveau leveren; maar geen van deze benaderingen verschaft een werkelijk langdurige index HPA activiteit en de gevoeligheid van deze SYstengel tot chronische stressoren.
Meten CORT in het haar is begonnen om deze belangrijke behoefte te vullen in de stress literatuur. Aanvankelijke studies van verschillende laboratoria toonde de aanwezigheid van CORT in menselijk haar maar niet onderzocht of haar CORT niveaus veranderd als een functie van spanning 2. Aangezien ons laboratorium is geïnteresseerd voor vele jaren in de regulatie van de resusaap HPA-as door verschillende sociale en gedragsmatige factoren 3 hebben we besloten om methoden voor extractie en analyse van resusaap haar 4 vast te stellen en te valideren. Ervan uitgaande dat bloed overgedragen CORT langzaam en continu in groeiend haar wordt opgenomen, de toepassing van deze nieuwe methode was het niveau van haar afgeleide CORT als een geïntegreerde index van HPA activiteit gedurende een periode van weken tot maanden.
Verschillende methodologische problemen werden ondervonden bij het ontwikkelen van het huidige protocol. Eerste, had vorige studies dat kleine hoeveelheden o getoondf circulerende CORT worden uitgescheiden in het zweet en talg en dus kon de vacht van de buitenkant van de haarschacht 2. Om dit potentieel te verwarren elimineren, we een milde wasbeurt procedure die lijkt op externe CORT verwijderen terwijl het hebben van een minimaal effect op CORT aanwezig binnen de groeiende haarschacht ontwikkeld. Aldus aap haar onderworpen aan deze procedure (bijvoorbeeld twee 3-min wassen met isopropanol) verloor ongeveer 7-8% van het totaal haar CORT inhoud, en een derde was verwijderd minder dan 1% meer steroïde uit het monster 4. Er blijkt meer externe CORT in menselijk haar, aangezien dezelfde procedure verwijderd gemiddeld 27% totale CORT inhoud van de monsters (K. Rosenberg J. Meyer, ongepubliceerd). Zoals aap haar echter een aanvullend wassen die minder CORT (ongeveer 7%) dan de eerste twee wasbeurten. Daarom resultaten van beide aap en menselijk haar ondersteunen de stelling dat de meeste (zo niet alle) externe CORT verwijderd kan worden met behoud van een grote fractietie van CORT binnen de interne haarmatrix. Ten tweede, onze pilot-studies toonden ook aan dat het malen van het haar vóór de extractie aanzienlijk toegenomen CORT herstel van het monster, vermoedelijk door het openbreken van het complex eiwitachtige matrix van de haarschacht evenals het verhogen van de beschikbare oppervlakte voor penetratie oplosmiddel. Twee verschillende malen methoden ontwikkeld, elk met voor-en nadelen. Methode 1, die een kogelmolen gebruikt, heeft het voordeel van het produceren van de fijnste poeder. Echter, een kogelmolen is een relatief dure apparatuur item, indien gebruikt met standaard maalpotten en ballen, het kan slijpen slechts twee monsters tegelijk. Kleine monsters zijn ook moeilijk te verwerken met behulp van een kogelmolen met standaard slijpen potten. Methode 2, die een BeadBeater gebruikt, minder effectief in het malen vermogen. Hierdoor gemiddelde CORT herstel ongeveer 10% lager deze methode ten opzichte van de kogelmolen (ongepubliceerde gegevens). Anderzijds, een BeadBeateris aanzienlijk goedkoper dan een kogelmolen, kan 16-24 monsters worden gemalen in een keer, afhankelijk van het model en de methode is zeer geschikt voor kleine steekproeven. Vanwege de bovengenoemde differentiële herstel, is het raadzaam om dezelfde maalwerkwijze gebruiken voor alle monsters binnen een bepaalde studie.
Zodra het haar monsters zijn verwerkt, worden zij geëxtraheerd met methanol en CORT in extracten geanalyseerd door middel van een gevoelige en specifieke commerciële EIA-kit oorspronkelijk ontworpen om speeksel CORT meten. De extractie en analyse procedures zijn gedeeltelijk gevalideerd door aan te tonen dat seriële verdunningen van uittreksels uit de aap haar monsters leverde EIA lezingen die nauw parallel verkregen uit authentieke CORT normen lezingen. Vervolgens bleek dat haar CORT (naast plasma en speeksel CORT) was gevoelig voor grote levensduur stressor een administratief opdracht verplaatsing van de apen nieuwbouw wijken 4,5. De presentatiet papier zorgt voor een gedetailleerd verslag van de routinematig gebruikt in ons laboratorium voor mens en aap haar monsters te verwerken en te extraheren en te analyseren CORT van dergelijke monsters methoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hierboven beschreven haar CORT procedure is eenvoudig uit te voeren, is relatief goedkoop maakt gebruik van gemakkelijk verkrijgbare chemicaliën, reagentia en benodigdheden en vereist apparatuur die, met een uitzondering, waarschijnlijk aanwezig in een typische analytisch laboratorium zijn. De uitzondering is een knarsend apparaat zoals een kogelmolen of mini-BeadBeater. We merken dat sommige onderzoeksgroepen gehakt haar monsters in kleine fragmenten ongeveer 1 mm in lengte 12, maar op basis van onze obs…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Kymberlee O'Brien, Celia Moore, en Edward Tronick (Departement Psychologie, Universiteit van Massachusetts, Boston) voor het verstrekken van de menselijke haar monsters geanalyseerd in deze studie, en Stephen Suomi en Amanda Dettmer (Laboratorium voor Vergelijkende Ethologie, NICHD) voor het verstrekken van de resusaap haarsteekproeven. Initiële ontwikkeling en het verdere gebruik van deze methode werd ondersteund door NIH RR11122 naar MAN
Materials
| HPLC-grade isopropanol | Fisher | A451 | |
| HPLC-grade methanol | Fisher | A452 | |
| Salivary cortisol assay kits | Salimetrics | 1-3002 | See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity |
| 15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-25 | |
| 2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-7 | |
| 2.0-ml XXTuff reinforced microvials | BioSpec | 330TX | Use with mini-beadbeater |
| 3.2-mm chrome-steel beads | BioSpec | 11079132c | Use with mini-beadbeater |
| 10-ml stainless steel grinding jars | Retsch | 02.462.0061 | Use with mixer mill |
| 12-mm stainless steel grinding balls | Retsch | 05.368.0037 | Use with mixer mill |
| Savant activated carbon cartridge | Fisher | DTK120R | Use with Savant chemical trap |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rotator for 15-ml centrifuge tubes | Fisher | S02135 | |
| Rotator for microcentrifuge tubes | Fisher | NC9854190 | |
| Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 mixer mill | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac | Fisher | DNA120-115 | |
| Savant refrigerated vapor trap | Fisher | RVT400-115 | |
| Savant chemical trap | Fisher | SCT120 | Alternative to refrigerated vapor trap |
| Microplate reader | |||
| Microplate washer | |||
| Microplate mixer | |||
| Multichannel pipetter | |||
| Analytical balance |
Referências
- Selye, H. Stress and the general adaptation syndrome. Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model. Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).
- Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function. Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).
- Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. Hair as a retrospective calendar of cortisol production – Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy. Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).
- Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations. Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).
- Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. Evaluation of a method to measure long term cortisol levels. Steroids. 76, 1032-1036 (2011).
- Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing’s syndrome. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).
- LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair. Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).
- Dolnick, E. H., Montagna, W., Dobson, R. L. Variability of hair growth in Macaca mulatta. Adv. Biol. Skin. IX, 121-128 (1969).
- Sauvé, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. a. n., H, S. Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure. Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).
- Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications. Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).
- Bechshøft, T. &. #. 2. 1. 6. ;., Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears. Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).
- Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair. Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).
- Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol. FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).
- Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions. Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).
- Stalder, T., Kirschbaum, C. Analysis of cortisol in hair – State of the art and future directions. Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).
- Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review. Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).
