Ekstraksiyon ve İnsan ve Maymun Saç gelen Kortizol Analizi
Summary
Kortizol (CORT) insanlarda ve primatlarda artan saç gövdesine birikir. Biz yüksek hassasiyet ve duyarlılığı ile saç Cort çıkarma ve analiz yöntemleri açıklanmaktadır. Saç CORT ölçülmesi özellikle aya haftalık dönemler boyunca kronik stres değerlendirmek için çok uygundur.
Abstract
Stres hormonu kortizol (CORT) yavaş yavaş insanlarda, insan olmayan primatlar ve diğer memeliler artan saç gövdesine dahil edilir. Biz, geliştirilmiş ve geçerli al yanaklı maymun saçtan CORT ekstraksiyonu ve analizi için bir yöntem ve daha sonra insan derisi saç ile kullanılmak için bu yöntemi uyarlanmıştır. Plazma veya tükürük elde CORT "nokta örneklerinin" aksine, saç CORT hormon esas döneminde, bir hipotalamus-hipofiz-adrenal (HPA) sistem etkinliğinin entegre ölçü ve böylece fizyolojik stres sağlar. Insan saç derisi 1 cm / ay ortalama bir hızda büyür, çünkü, saç kesimleri elde CORT seviyeleri uzunluğu birkaç cm potansiyel ay bir dizi üzerinde yaşanan stres bir biyolojik belirteç olarak hizmet verebilir.
Bizim bir yöntemde, her bir saç örnek ilk ter veya terden de tevdi edilmiştir saç gövdesinin dışından herhangi bir Cort çıkarmak için izopropanol içinde iki kere yıkanmıştır. Kurutma işleminden sonra,örnek kıl protein matrisi parçalamak ve çıkarılması için yüzey alanını arttırmak için ince bir toz halinde öğütülür. Saç gövdesinin iç kısmından CORT metanol içine ekstrakte edildi, metanol buharlaştırıldı, ve ekstre deney tamponu içinde yeniden edilir. Çıkarılan CORT, standartlar ve kalite kontrol ile birlikte, o zaman duyarlı ve spesifik bir ticari olarak temin edilebilen bir enzim immunoassay (EIA) kiti vasıtasıyla analiz edilir. EIA okuma mg toz saç ağırlığı başına pg CORT dönüştürülür. Bu yöntem, insanlarda saç Cort analiz laboratuvarımızda kullanılmakta olan, makak maymunları, marmosets, köpekler, ve kutup ayıları birkaç tür. Laboratuvardan ve diğer araştırma grupları hem de birçok çalışma doğal kronik stres maruziyeti değerlendirmek yanı sıra laboratuar ayarları için saç CORT geniş uygulanabilirliğini göstermiştir.
Introduction
Plazma, tükürük, idrar ya da zaman zaman ya da dışkılar in CORT ölçümü stres 1 HPA ekseninin rolünün Selye keşfi tarihi, fizyolojik stres göstergesi olarak kullanılmıştır. Çok sayıda kağıtları akut stresli durumlarla HPA aktivitesini ilgili yayınlanmış olmasına rağmen, alan kronik fizyolojik stres basit ve güvenilir bir indeks eksikliği engel olmuştur. Bu sorun ortaya çıkar sirkadiyen varyasyon tabidir ve çevresel bozukluklar tarafından eleştirilmiştir olabilir HPA aktivitesinin plazma ve tükürük verim hem de "nokta" tahminleri çünkü. İdrar ve dışkı örnekleri bazı durumlarda tam bir gün kadar sonrası bir dizi yayılma CORT ve / veya metabolit boşaltım ölçümleri elde edildi. Ancak bu yaklaşımların hiçbiri HPA aktivite gerçekten, uzun vadeli bir dizin ve bu sy yanıt sağlar, bu matrisler her zaman CORT seviyeleri kaba bir bileşik dizini sağlayabilir kullanarak birden fazla örneklerinin toplanmasıKronik stres kaynaklanıyor.
Saç Cort Ölçme stres literatürde bu önemli ihtiyacı doldurmak başladı. Birkaç laboratuvarlar tarafından yapılan ilk çalışmalar, insan saç CORT varlığını gösterdi ama saç CORT seviyeleri stres 2 bir fonksiyonu olarak değiştirilmiş olup olmadığını araştırmak değildi. Bizim laboratuvar çeşitli sosyal ve davranışsal faktörler 3 ile al yanaklı maymun HPA ekseninin düzenlenmesinde yıllardır ilgi olmuştur, biz al yanaklı maymun saç 4 çıkarılması ve analizi için yöntemler kurmak ve doğrulamak için yola çıktı. Kan kaynaklı CORT yavaş yavaş ve sürekli olarak artan saç içine dahil edilen öncül göre, bu yeni yöntemin amacı aya haftalık dönemler boyunca HPA aktivitesinin bir göstergesi olarak entegre bir saç türetilmiş CORT seviyelerini kullanmaktı.
Çeşitli metodolojik zorluklar mevcut protokolünü gelişmekte rastlanmıştır. İlk olarak, önceki çalışmalarda bu küçük miktarlar o göstermiştif ter ve sebum atılır Cort dolaşan ve bu nedenle kat saç milinin 2 dışında olabilir. Bu potansiyel şaşırtmak ortadan kaldırmak için, biz büyüyen saç şaft içinde mevcut CORT üzerinde minimal bir etkiye sahip ise dış Cort kaldırmak için görünen hafif bir yıkama prosedürü geliştirmiştir. Bu durumda, bu prosedürün (izopropanol yani iki adet 3-dakikalık yıkama) tâbi maymun saç toplam saç CORT içeriğinin yaklaşık olarak% 7-8 kayıp, ve üçüncü bir yıkama örnek 4 en az% 1 daha fazla steroid kaldırıldı. Aynı prosedür (yayınlanmamış K. Rosenberg ve J. Meyer) örneklerinde% 27, toplam CORT içeriğinin ortalama kaldırıldı yana, insan saçı daha fazla dış CORT var gibi görünüyor. Maymun saç gibi, ancak ek bir yıkama ilk iki yıkamadan çok daha az Cort (yaklaşık% 7) ihtiva etmiştir. Bu nedenle, Maymun ve insan saç hem de sonuçları büyük bir frac muhafaza ederken en (hepsi değilse), dış CORT kaldırılabilir iddiasını destekleyenDahili saç matris içinde CORT of tion. İkinci olarak, pilot çalışmalar da göstermiştir ki, muhtemelen saç gövdesinin kompleks matris proteinli açık kırma hem de çözücü olarak nüfuz etmesi için mevcut olan yüzey alanını arttırarak, numuneden önemli ölçüde artmıştır CORT kurtarma ekstraksiyon için saç önceden öğütme. İki farklı öğütme yöntemleri, avantajları ve dezavantajları ile her geliştirilmiştir. Bir top değirmen kullanarak Yöntem 1, en iyi toz üretme avantajına sahiptir. Ancak, bilyalı değirmen nispeten pahalı bir ekipman öğedir ve standart taşlama kavanoz ve topları ile kullanıldığında, bir defada sadece iki numune öğütme kapasitesine sahiptir. Küçük numuneler aynı zamanda standart öğütme kavanoz bir bilyalı değirmen kullanılarak işlenmesi zordur. Bir beadbeater kullanır Yöntem 2, kendi öğütme yeteneği daha az etkilidir. Sonuç olarak, ortalama iyileşme CORT bilyalı değirmen (yayınlanmamış veriler) ile karşılaştırıldığında, bu metodun kullanımı ile yaklaşık% 10 daha düşüktür. Öte yandan, bir beadbeaterönemli ölçüde daha az pahalı bir bilyalı değirmen daha 16-24 örnekleri bir kez modele bağlı olarak öğütülebilir ve yöntem, küçük örnekler için uygundur. Çünkü yukarıda bahsedilen ayırıcı toparlanma, belirli bir çalışma içinde, bütün numuneler için aynı öğütme yöntemi kullanmak tavsiye edilir.
Saç örneklerinde işlendikten sonra, bu başlangıçta tükürük Cort ölçmek için tasarlanmış bir hassas ve özel ticari EIA kiti vasıtasıyla analiz edilir ekstrelerinde metanol ve CORT ile ekstre edilmiştir. Ekstraksiyon ve tahlil prosedürleri maymun saç örneklerinden özleri seri seyreltileri yakın özgün CORT standartları elde edilen okuma paralel EIA okumaları elde gösteren kısmen doğrulanmıştır. Daha sonra (plazma ve tükürük CORT ek olarak) saç CORT yeni konut çeyrek 4,5 üzere maymunların bir idari zorunlu yer değiştirme büyük yaşam stres duyarlı olduğunu gösterdi. Present kağıt, insan ve maymun saç örnekleri işleyen ve bu numunelerden Cort ayıklamak ve analiz etmek bizim laboratuvarda rutin kullanılan yöntemlerin ayrıntılı bir hesap sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıda tarif edilmiş olan saç CORT prosedürü gerçekleştirmek için basit, nispeten ucuz olan, kolaylıkla temin kimyasallar, reaktifler ve malzemeleri kullanır ve bir istisna ile, tipik bir analitik laboratuar içinde mevcut olması muhtemel olduğundan, ekipman gerektirir. Özel bir bilyeli değirmen ya da mini beadbeater olarak bir öğütme aletidir. Bazı araştırma grupları küçük parçalara uzunluğunda 12 kabaca 1 mm içine saç örneklerini sakınmadan unutmayın, ama biz taşlama perfor…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bu çalışmada analiz insan saç örneklerini sağlamak için Kymberlee O'Brien, Celia Moore ve Edward Tronick (Psikoloji Bölümü, Massachusetts, Boston Üniversitesi) teşekkür ederim, ve Stephen Suomi ve Amanda Dettmer (Karşılaştırmalı litoloji, NICHD Laboratuvarı) için al yanaklı maymun saç örnekleri sağlar. Ilk gelişim ve bu yöntemin devam etmeniz MAN NIH RR11122 tarafından desteklenmiştir
Materials
| HPLC-grade isopropanol | Fisher | A451 | |
| HPLC-grade methanol | Fisher | A452 | |
| Salivary cortisol assay kits | Salimetrics | 1-3002 | See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity |
| 15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-25 | |
| 2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-7 | |
| 2.0-ml XXTuff reinforced microvials | BioSpec | 330TX | Use with mini-beadbeater |
| 3.2-mm chrome-steel beads | BioSpec | 11079132c | Use with mini-beadbeater |
| 10-ml stainless steel grinding jars | Retsch | 02.462.0061 | Use with mixer mill |
| 12-mm stainless steel grinding balls | Retsch | 05.368.0037 | Use with mixer mill |
| Savant activated carbon cartridge | Fisher | DTK120R | Use with Savant chemical trap |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rotator for 15-ml centrifuge tubes | Fisher | S02135 | |
| Rotator for microcentrifuge tubes | Fisher | NC9854190 | |
| Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 mixer mill | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac | Fisher | DNA120-115 | |
| Savant refrigerated vapor trap | Fisher | RVT400-115 | |
| Savant chemical trap | Fisher | SCT120 | Alternative to refrigerated vapor trap |
| Microplate reader | |||
| Microplate washer | |||
| Microplate mixer | |||
| Multichannel pipetter | |||
| Analytical balance |
Referências
- Selye, H. Stress and the general adaptation syndrome. Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model. Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).
- Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function. Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).
- Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. Hair as a retrospective calendar of cortisol production – Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy. Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).
- Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations. Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).
- Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. Evaluation of a method to measure long term cortisol levels. Steroids. 76, 1032-1036 (2011).
- Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing’s syndrome. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).
- LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair. Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).
- Dolnick, E. H., Montagna, W., Dobson, R. L. Variability of hair growth in Macaca mulatta. Adv. Biol. Skin. IX, 121-128 (1969).
- Sauvé, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. a. n., H, S. Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure. Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).
- Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications. Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).
- Bechshøft, T. &. #. 2. 1. 6. ;., Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears. Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).
- Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair. Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).
- Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol. FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).
- Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions. Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).
- Stalder, T., Kirschbaum, C. Analysis of cortisol in hair – State of the art and future directions. Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).
- Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review. Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).
