Extração e Análise de Cortisol de cabelo humano e do macaco

Summary

O cortisol (CORT) acumula-se no eixo do crescimento de cabelo de humanos e primatas não-humanos. Nós descrevemos métodos para extrair e analisar CORT cabelo com alta precisão e sensibilidade. Medição de cabelo CORT é particularmente bem adequado para a avaliação de stress crónico durante períodos de semanas a meses.

Abstract

O hormônio do estresse cortisol (CORT) está lentamente incorporado no eixo do cabelo crescente de seres humanos, primatas não-humanos e outros mamíferos. Temos desenvolvido e validado um método para extração e análise de CORT cabelo macaco rhesus e, posteriormente adaptado este método para uso com cabelo do couro cabeludo humano. Em contraste com CORT "amostras pontuais" obtidos a partir de plasma ou saliva, cabelo CORT fornece uma medida integrada da atividade do sistema hipotalâmico-pituitário-adrenal (HPA), e, assim, o estresse fisiológico, durante o período de hormônio de incorporação. Porque o cabelo do couro cabeludo humano cresce a uma taxa média de 1 cm / mês, os níveis de CORT obtidos a partir de segmentos de cabelo várias cm de comprimento pode potencialmente servir como um biomarcador de estresse experimentado ao longo de vários meses.

No nosso método, cada amostra de cabelo é lavado primeiro duas vezes em isopropanol, para remover qualquer CORT a partir do exterior da haste do cabelo que foi depositada a partir de suor ou de sebo. Após a secagem, oamostra é moída a um pó fino, para quebrar a proteína da matriz do cabelo e aumentar a área de superfície para a extracção. CORT a partir do interior da haste do cabelo é extraído em metanol, o metanol é evaporado, e o extracto é reconstituída em tampão de ensaio. Extraído CORT, juntamente com padrões de qualidade e, em seguida, é analisada por meio de um imunoensaio de enzima disponível comercialmente sensível e específico kit (EIA). Leitura do EIA é convertido em CORT pg por mg de peso cabelo em pó. Este método tem sido utilizado em nosso laboratório para analisar CORT cabelo em humanos, várias espécies de macacos, sagüis, cães e ursos polares. Muitos estudos, tanto do nosso laboratório e de outros grupos de pesquisa demonstraram a ampla aplicabilidade da CORT cabelo para avaliar a exposição ao estresse crônico no natural, bem como as configurações de laboratório.

Introduction

Medição de CORT no plasma, saliva, ou, ocasionalmente, na urina ou fezes tem sido utilizada como um índice de stress fisiológico desde a descoberta do papel do eixo HPA em tensão ¹ de Selye. Embora inúmeros artigos têm sido publicados relativos atividade HPA a situações estressantes de forma aguda, o campo tem sido dificultada pela falta de um índice simples e confiável de estresse fisiológico crônica. Este problema surge porque plasma e saliva tanto rendimento "Ponto" estimativas da actividade HPA que estão sujeitas a variação circadiana e podem ser confundidos por distúrbios ambientais. Amostras urinária e fecal produzir medidas de CORT e / ou eliminação de metabolito que abrangem um número de horas até um dia inteiro em alguns casos. Recolha de amostras múltiplas, utilizando qualquer uma destas matrizes podem fornecer um índice composto bruto de níveis CORT ao longo do tempo, no entanto, nenhuma destas abordagens fornece um índice verdadeiramente de longa duração de actividade HPA e a capacidade de resposta deste sydeter a estressores crônicos.

Medindo CORT no cabelo começou a preencher esta necessidade importante na literatura stress. Estudos iniciais por vários laboratórios demonstrou a presença de CORT em cabelo humano, mas não se investigar se os níveis de CORT cabelo alterado como uma função da tensão ^2. Como o nosso laboratório tem se interessado por muitos anos na regulação do eixo HPA macaco rhesus por vários fatores sociais e comportamentais ^3, nos propusemos a estabelecer e validar métodos para extração e análise de cabelo macaco rhesus ^4. Com base na premissa de que CORT proveniente do sangue é lenta e continuamente incorporadas no crescimento do cabelo, o objectivo deste novo método é a utilização dos níveis de CORT derivado de cabelo como um índice de actividade HPA integrada ao longo de períodos de semanas a meses.

Vários desafios metodológicos foram encontrados no desenvolvimento do presente protocolo. Em primeiro lugar, os estudos anteriores tinham mostrado que as pequenas quantidades of circulando CORT são excretados no suor e sebo e, portanto, poderia revestir a parte externa do fio de cabelo ^2. A fim de eliminar este confundir potencial, desenvolvemos um procedimento de lavagem suave que aparece para remover CORT externo, tendo um efeito mínimo sobre CORT presentes na crescente eixo do cabelo. Assim, o cabelo macaco submetidos a este procedimento (ou seja, duas lavagens de 3 min, com o isopropanol) perdeu cerca de 7-8% do teor total de CORT cabelo, e uma terceira lavagem removido menos de 1% a mais de esteróides a partir da amostra ^4. Parece haver CORT mais externo em cabelo humano, uma vez que o mesmo procedimento removeu uma média do conteúdo total CORT 27% das amostras (K. Rosenberg e J. Meyer, ainda não publicados). Como o cabelo macaco, no entanto, uma lavagem adicional contido muito menos CORT (cerca de 7%) do que as duas primeiras lavagens. Portanto, os resultados de ambos macaco e cabelo humano apoiar a afirmação de que a maioria (se não todos) CORT externo pode ser removido, mantendo uma grande fracção de CORT dentro da matriz do cabelo interna. Em segundo lugar, os nossos estudos piloto também mostraram que a moagem do cabelo antes da extracção aumentou significativamente a recuperação CORT a partir da amostra, presumivelmente ao romper a matriz proteica complexa do eixo do cabelo, bem como aumentando a área de superfície disponível para a penetração do solvente. Foram desenvolvidos dois métodos de moagem diferentes, cada um deles com vantagens e desvantagens. Método 1, que utiliza um moinho de bolas, tem a vantagem de produzir o pó fino. Contudo, num moinho de esferas é um item de equipamento relativamente dispendioso e, se utilizado com frascos de moagem convencionais e as esferas, que é capaz de moer somente duas amostras de cada vez. As amostras pequenas são também difíceis de processar utilizando um moinho de bolas com frascos de moagem convencionais. Método 2, que utiliza uma beadbeater, é menos eficaz na sua capacidade de moagem. Como resultado, a recuperação média CORT é aproximadamente 10% menor usando este método em comparação com o moinho de bolas (dados não publicados). Por outro lado, um beadbeateré consideravelmente menos dispendiosa do que um moinho de bolas, 16-24 amostras podem ser moídos em uma vez, dependendo do modelo, e o método é adequado para pequenas amostras. Devido à recuperação diferencial acima mencionado, é aconselhável utilizar o mesmo método de moagem para todas as amostras de um determinado estudo.

Uma vez que as amostras de cabelo foram processados, eles são extraídos com metanol e CORT nos extractos são analisados ​​por meio de um kit comercial de EIA sensível e específico originalmente concebido para medir CORT salivar. Os procedimentos de extração e ensaio foram validados em parte, demonstrando que diluições em série de extratos de amostras de cabelo macaco rendeu leituras de AIA que se assemelhavam de perto as leituras obtidas a partir de padrões de CORT autênticos. Em seguida, mostrou que CORT cabelo (além de plasma e saliva CORT) foi sensível à grande estressor vida de uma deslocalização administrativamente mandato dos macacos para novos bairros habitacionais ^4,5. O present documento fornece uma descrição detalhada dos métodos utilizados rotineiramente em nosso laboratório para processar amostras de cabelo humano e de macaco e extrair e analisar CORT de tais amostras.

Protocol

1. Coleta de Amostras e Armazenamento Cabelo humano Fixar a todo o comprimento do cabelo a ser amostrado (até um lápis de largura em diâmetro) com uma faixa de borracha ou clipe. Cortar o cabelo o mais próximo possível do couro cabeludo possível (tomando cuidado para não cortar a pele) com um pano limpo tesoura. Nota: A área de amostragem padrão é o vértice posterior do crânio. Alguns investigadores relataram um declínio nos níveis de CORT cabelos humanos com a distância do c…

Representative Results

A Figura 1 mostra a impressão a partir de um conjunto representativo de amostras de cabelo humano (adulto masculino e feminino) sujeitos humanos processados ​​usando o método 2 de moagem e extração. O software de computador foi utilizada para gerar a saída de dados e para se ajustar uma curva sigmoidal de quatro parâmetros para os padrões CORT (Figura 2). Os entre-bem currículos deste prato variou 0,01-5,73%, com um intra-ensaio média de 1,34%. O CV inter-ensaio determinada…

Discussion

O procedimento CORT cabelo acima descrito é simples de realizar, é relativamente barato, faz uso de produtos químicos facilmente disponíveis, reagentes e material, e requer equipamento que, com uma excepção, é provável que esteja presente em um laboratório analítico típico. A excepção é um aparelho de moagem tal como um moinho de bolas ou um mini-beadbeater. Notamos que alguns grupos de pesquisa mediu amostras de cabelo em pequenos fragmentos de aproximadamente 1 mm de comprimento ^12, mas com ba…

Materials

HPLC-grade isopropanol	Fisher	A451
HPLC-grade methanol	Fisher	A452
Salivary cortisol assay kits	Salimetrics	1-3002	See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity
15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes	Max Scientific	10-9151
1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Fisher	05-402-25
2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Fisher	05-402-7
2.0-ml XXTuff reinforced microvials	BioSpec	330TX	Use with mini-beadbeater
3.2-mm chrome-steel beads	BioSpec	11079132c	Use with mini-beadbeater
10-ml stainless steel grinding jars	Retsch	02.462.0061	Use with mixer mill
12-mm stainless steel grinding balls	Retsch	05.368.0037	Use with mixer mill
Savant activated carbon cartridge	Fisher	DTK120R	Use with Savant chemical trap
Name of Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rotator for 15-ml centrifuge tubes	Fisher	S02135
Rotator for microcentrifuge tubes	Fisher	NC9854190
Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes	Fisher	13-100-675
MM 200 mixer mill	Retsch	20.746.0001
Mini-Beadbeater 16	BioSpec	607
Savant DNA Speedvac	Fisher	DNA120-115
Savant refrigerated vapor trap	Fisher	RVT400-115
Savant chemical trap	Fisher	SCT120	Alternative to refrigerated vapor trap
Microplate reader
Microplate washer
Microplate mixer
Multichannel pipetter
Analytical balance