Extracción y análisis de cortisol de Derechos Humanos y de mono de pelo

Summary

El cortisol (CORT) se acumula en el eje del pelo cada vez mayor de los seres humanos y los primates no humanos. Se describen métodos para la extracción y el análisis de CORT cabello con alta precisión y sensibilidad. Medición de pelo CORT está particularmente bien adaptado para la evaluación de estrés crónico durante períodos de semanas a meses.

Abstract

La hormona del estrés cortisol (CORT) se incorpora lentamente en el eje del pelo que crece de los seres humanos, primates no humanos, y otros mamíferos. Hemos desarrollado y validado un método para la extracción y el análisis de CORT pelo de mono rhesus y posteriormente adaptado este método para su uso con el pelo del cuero cabelludo humano. En contraste con CORT "muestras puntuales" obtenidos a partir de plasma o saliva, pelo CORT proporciona una medida integrada de la actividad del sistema hipotálamo-pituitaria-adrenocortical (HPA), y por lo tanto el estrés fisiológico, durante el período de incorporación de la hormona. Dado que el cabello del cuero cabelludo humano crece a una tasa promedio de 1 cm / mes, los niveles de CORT obtenidos a partir de segmentos de cabello varias cm de longitud potencialmente pueden servir como un biomarcador de estrés experimentado durante varios meses.

En nuestro método, cada muestra de cabello se lava primero dos veces en isopropanol para eliminar cualquier Cort de la parte exterior del eje del pelo que se ha depositado por el sudor o el sebo. Después del secado, lala muestra se muele a un polvo fino para romper la matriz de proteína del cabello y aumentar el área de superficie para la extracción. CORT desde el interior del eje del pelo se extrajo en metanol, el metanol se evaporó, y el extracto se reconstituyó en tampón de ensayo. Extraídas Cort, junto con los estándares y controles de calidad, se analiza a continuación, por medio de un inmunoensayo enzimático disponible comercialmente sensible y específica (EIA) del kit. Lectura de la EIA se convierte a CORT pg por mg de peso de pelo en polvo. Este método se ha utilizado en nuestro laboratorio para analizar CORT cabello en los seres humanos, varias especies de monos macacos, monos tití, perros y osos polares. Muchos estudios, tanto de nuestro laboratorio y de otros grupos de investigación han demostrado la amplia aplicabilidad de CORT pelo para evaluar la exposición al estrés crónico en natural, así como la configuración de laboratorio.

Introduction

Medición de CORT en el plasma, la saliva, o de vez en cuando en la orina o las heces se ha utilizado como un índice de estrés fisiológico desde el descubrimiento de Selye de la función del eje HPA en el estrés ^1. Aunque numerosos trabajos se han publicado en relación actividad HPA a situaciones de estrés agudo, el campo se ha visto obstaculizado por la falta de un índice simple y fiable de estrés fisiológico crónica. Este problema surge porque el plasma y saliva tanto rendimiento estima "punto" de la actividad HPA que están sujetos a variación circadiana y puede ser confundida por las perturbaciones ambientales. Muestras urinarias y fecales producen mediciones de CORT y / o eliminación de los metabolitos que abarcan un número de horas hasta un día completo en algunos casos. Colección de muestras múltiples utilizando cualquiera de estas matrices puede proporcionar un índice compuesto en bruto de los niveles de CORT lo largo del tiempo, sin embargo, ninguno de estos enfoques proporciona un índice verdaderamente a largo plazo de la actividad HPA y la capacidad de respuesta de este SYdetener a los factores estresantes crónicos.

Medición de CORT en el cabello ha comenzado a llenar esta importante necesidad en la literatura estrés. Los estudios iniciales realizados por varios laboratorios demostraron la presencia de CORT en el cabello humano, pero no investigaron si los niveles de CORT pelo cambian en función de la tensión ^2. A medida que nuestro laboratorio ha estado interesado desde hace muchos años en la regulación del eje HPA mono rhesus por diversos factores sociales y de comportamiento ^3, nos propusimos establecer y validar métodos para la extracción y el análisis de pelo de mono rhesus ^4. Basado en la premisa de que CORT transmisión sanguínea se incorpora lentamente y de forma continua en el crecimiento del cabello, el propósito de este nuevo método era utilizar niveles de CORT derivado del pelo como un índice integrado de la actividad HPA durante períodos de semanas o meses.

Se han encontrado varios problemas metodológicos en la elaboración del presente protocolo. En primer lugar, los estudios anteriores habían demostrado que pequeñas cantidades of circulantes CORT se excretan en el sudor y el sebo, por lo que podría cubrir el exterior del eje del pelo ^2. A fin de eliminar este potencial factor de confusión, hemos desarrollado un procedimiento de lavado suave que aparece para eliminar CORT externo mientras que tiene un efecto mínimo en CORT presente dentro del eje del pelo que crece. Por lo tanto, el pelo mono sometido a este procedimiento (es decir, de dos lavados de 3 minutos con isopropanol) perdió aproximadamente 7-8% del contenido total de CORT pelo, y un tercio de lavado elimina menos de 1% más esteroides de la muestra ^4. No parece haber más CORT externa en el cabello humano, ya que el mismo procedimiento elimina un promedio de 27% de contenido total de Cort de las muestras (K. Rosenberg y J. Meyer, no publicado). Al igual que el pelo de mono, sin embargo, un lavado adicional contenía mucho menos CORT (alrededor del 7%) que los dos primeros lavados. Por lo tanto, los resultados de ambos mono y el cabello humano apoyan el argumento de que la mayoría (si no todos) CORT externa se puede quitar mientras se mantiene una fracción importanteción de CORT dentro de la matriz del pelo interno. En segundo lugar, nuestros estudios piloto mostraron también que la molienda del pelo antes de la extracción aumentado significativamente la recuperación Cort de la muestra, presumiblemente mediante la ruptura abierta la compleja matriz proteínica del eje del pelo, así como aumentar el área de superficie disponible para la penetración de disolvente. Dos métodos de molienda se desarrollaron diferentes, cada uno con ventajas y desventajas. Método 1, que utiliza un molino de bolas, tiene la ventaja de producir el polvo más fino. Sin embargo, un molino de bolas es un elemento de un equipo relativamente caro y, si se usa con recipientes de molienda y bolas estándar, que es capaz de moler sólo dos muestras a la vez. Las muestras pequeñas también son difíciles de procesar usando un molino de bolas con recipientes de molienda estándar. Método 2, que utiliza un BeadBeater, es menos eficaz en su capacidad de molienda. Como resultado, la recuperación media CORT es de aproximadamente 10% inferior utilizando este método en comparación con el molino de bolas (datos no publicados). Por otro lado, un BeadBeateres considerablemente menos caro que un molino de bolas, 16-24 muestras se pueden moler a la vez, dependiendo del modelo, y el método es muy adecuado para muestras pequeñas. Debido a la recuperación diferencial mencionado anteriormente, es aconsejable utilizar el mismo método de molienda para todas las muestras dentro de un estudio particular.

Una vez que se han procesado las muestras de cabello, que se extraen con metanol y CORT en los extractos se analizaron por medio de un kit de EIA comercial sensible y específica originalmente diseñado para medir CORT salival. Los procedimientos de extracción y ensayo fueron validados en parte mediante la demostración de que las diluciones seriadas de los extractos de las muestras de pelo de mono produjeron lecturas paralelas a EIA de cerca las lecturas obtenidas de los estándares CORT auténticos. A continuación, mostramos que CORT pelo (además de plasma y CORT salival) fue sensible a la importante factor estresante vida de una reubicación administrativamente mandato de los monos a los nuevos cuartos de vivienda ^4,5. La present documento ofrece una descripción detallada de los métodos que se utilizan de forma rutinaria en nuestro laboratorio para procesar las muestras de cabello humano y del mono y extraer y analizar CORT de tales muestras.

Protocol

1. Recogida y almacenamiento Pelo humano Asegure toda la longitud del cabello a ser muestreada (hasta un lápiz de ancho de diámetro) con una banda de goma o clip. Cortar el pelo tan cerca del cuero cabelludo como sea posible (teniendo cuidado de no cortar la piel) con unas tijeras limpias. Nota: El área de muestreo estándar es el vértice posterior del cráneo. Algunos investigadores han informado de una disminución en los niveles de CORT cabello humanos con la distancia desde el cuero…

Representative Results

La figura 1 muestra la copia impresa de un conjunto representativo de muestras de cabello humano (varón adulto y sujetos humanos femeninos) procesado utilizando el método 2 de molienda y extracción. Los programas informáticos se utilizó para generar la salida de datos y para adaptarse a una curva sigmoidal de 4 parámetros a los estándares Cort (Figura 2). Los CV entre pocillos de esta placa variaron desde 0,01 hasta 5,73%, con un promedio de CV intraensayo de 1.34%. El CV inter-e…

Discussion

El procedimiento CORT cabello descrito anteriormente es fácil de realizar, es relativamente barata, hace uso de productos químicos fácilmente disponibles, reactivos y suministros, y se necesita un equipo que, con una excepción, es probable que esté presente en un laboratorio de análisis típico. La excepción es un aparato de trituración tal como un molino de bolas o mini-BeadBeater. Tomamos nota de que algunos grupos de investigación pelos en muestras de cabello en fragmentos pequeños de aproximadamente 1 mm d…

Materials

HPLC-grade isopropanol	Fisher	A451
HPLC-grade methanol	Fisher	A452
Salivary cortisol assay kits	Salimetrics	1-3002	See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity
15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes	Max Scientific	10-9151
1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Fisher	05-402-25
2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Fisher	05-402-7
2.0-ml XXTuff reinforced microvials	BioSpec	330TX	Use with mini-beadbeater
3.2-mm chrome-steel beads	BioSpec	11079132c	Use with mini-beadbeater
10-ml stainless steel grinding jars	Retsch	02.462.0061	Use with mixer mill
12-mm stainless steel grinding balls	Retsch	05.368.0037	Use with mixer mill
Savant activated carbon cartridge	Fisher	DTK120R	Use with Savant chemical trap
Name of Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rotator for 15-ml centrifuge tubes	Fisher	S02135
Rotator for microcentrifuge tubes	Fisher	NC9854190
Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes	Fisher	13-100-675
MM 200 mixer mill	Retsch	20.746.0001
Mini-Beadbeater 16	BioSpec	607
Savant DNA Speedvac	Fisher	DNA120-115
Savant refrigerated vapor trap	Fisher	RVT400-115
Savant chemical trap	Fisher	SCT120	Alternative to refrigerated vapor trap
Microplate reader
Microplate washer
Microplate mixer
Multichannel pipetter
Analytical balance