निष्कर्षण और मानव और बंदर बालों से कोर्टिसोल का विश्लेषण
Summary
कोर्टिसोल (CORT) मानव और nonhuman primates की बढ़ती बाल शाफ्ट में जम जाता है. हम उच्च परिशुद्धता और संवेदनशीलता के साथ बाल CORT निकालने और विश्लेषण करने के लिए विधियों का वर्णन. बाल CORT का मापन विशेष रूप से महीने के लिए सप्ताह की अवधि में पुराने तनाव का आकलन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है.
Abstract
तनाव हार्मोन कोर्टिसोल (CORT) धीरे धीरे मनुष्यों, nonhuman primates, और अन्य स्तनधारियों की बढ़ती बाल शाफ्ट में शामिल किया है. हम विकसित और पुष्टि रीसस बंदर बालों से CORT निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए एक विधि है और बाद में मानव खोपड़ी बालों के साथ प्रयोग के लिए इस विधि का रूपांतरित किया. प्लाज्मा या लार से प्राप्त CORT "बिंदु नमूने" के विपरीत, बाल CORT हार्मोन समावेश की अवधि के दौरान, एक hypothalamic-पीयूषिका adrenocortical (एचपीए) प्रणाली गतिविधि की एकीकृत उपाय, और इस प्रकार शारीरिक तनाव प्रदान करता है. मानव खोपड़ी बाल 1 सेमी / माह की औसत दर से बढ़ता है, बाल क्षेत्रों से प्राप्त CORT स्तरों लंबाई में कई सेमी संभावित महीने की एक संख्या से अधिक का अनुभव तनाव का एक biomarker के रूप में सेवा कर सकते हैं.
हमारे विधि में, एक बाल नमूना पहले पसीना या sebum से जमा किया गया है कि बाल शाफ्ट के बाहर से किसी भी CORT दूर करने के लिए isopropanol में दो बार धोया जाता है. सूखने के बाद,नमूना बाल प्रोटीन मैट्रिक्स को तोड़ने और निकासी के लिए सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए एक ठीक पाउडर के लिए जमीन है. बाल शाफ्ट के इंटीरियर से CORT मेथनॉल में निकाला जाता है, मेथनॉल सुखाया जाता है, और निकालने परख बफर में पुनर्गठित किया जाता है. निकाले Cort, मानकों और गुणवत्ता नियंत्रण के साथ, तो एक संवेदनशील और विशिष्ट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंजाइम प्रतिरक्षा (ईआईए) किट के माध्यम से विश्लेषण किया है. ईआईए से readout मिलीग्राम पाउडर हेयर वजन प्रति पीजी CORT में बदल जाती है. इस विधि से मानव में बाल CORT का विश्लेषण करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया गया है, मकाक बंदरों, marmosets, कुत्तों, और ध्रुवीय भालू की कई प्रजातियों. हमारी प्रयोगशाला से और अन्य अनुसंधान समूहों से दोनों कई अध्ययनों से प्राकृतिक में पुराने तनाव जोखिम का आकलन करने के साथ ही प्रयोगशाला सेटिंग्स के लिए बाल CORT की व्यापक प्रयोज्यता दिखा दिया है.
Introduction
प्लाज्मा, लार, या कभी कभी मूत्र या मल में में CORT का मापन तनाव 1 में एचपीए धुरी की भूमिका की Selye की खोज के बाद से शारीरिक तनाव का एक सूचकांक के रूप में इस्तेमाल किया गया है. कई पत्र तीव्रता से तनावपूर्ण स्थितियों को एचपीए गतिविधि से संबंधित प्रकाशित किया गया है, क्षेत्र पुरानी शारीरिक तनाव का एक सरल और विश्वसनीय सूचकांक के अभाव के कारण बाधा उत्पन्न किया गया. यह समस्या पैदा होती है circadian परिवर्तन के अधीन हैं और पर्यावरण गड़बड़ी से चकित किया जा सकता है कि एचपीए गतिविधि के प्लाज्मा और लार उपज दोनों "बिंदु" का अनुमान है. मूत्र और मल के नमूने कुछ मामलों में एक पूरा दिन तक घंटे की एक संख्या है कि अवधि CORT और / या metabolite उत्सर्जन के माप उपज. हालांकि, इन तरीकों में से कोई भी एचपीए गतिविधि के लिए वास्तव में एक लंबे समय तक सूचकांक और इस एसवाई की जवाबदेही प्रदान करता है, इन matrices के किसी भी समय के साथ CORT स्तर की एक किसी न किसी कम्पोजिट सूचकांक प्रदान कर सकता का उपयोग कर कई नमूने का संग्रहजीर्ण तनाव के लिए स्टेम.
बालों में CORT मापने तनाव साहित्य में इस महत्वपूर्ण जरूरत को भरने के लिए शुरू हो गया है. कई प्रयोगशालाओं द्वारा प्रारंभिक अध्ययन मानव बालों में CORT की उपस्थिति का प्रदर्शन किया लेकिन बाल CORT स्तरों तनाव 2 के एक समारोह के रूप में बदल गया कि जांच नहीं की थी. हमारी प्रयोगशाला में विभिन्न सामाजिक और व्यवहार कारकों द्वारा 3 रीसस बंदर HPA अक्ष के नियमन में कई वर्षों के लिए दिलचस्पी किया गया है, हम रीसस बंदर बाल 4 की निकासी और विश्लेषण के लिए तरीकों की स्थापना और मान्य करने के लिए निकल पड़े. रक्त जनित CORT धीरे धीरे और लगातार बढ़ रही बाल में शामिल किया गया है जो इस तथ्य पर आधारित है, इस नई विधि के उद्देश्य महीने के लिए सप्ताह की अवधि में एचपीए गतिविधि का एक एकीकृत सूचकांक के रूप में बाल व्युत्पन्न CORT के स्तर का उपयोग करने के लिए था.
कई methodological चुनौतियों मौजूद प्रोटोकॉल विकसित करने में सामना करना पड़ा था. सबसे पहले, पिछले अध्ययनों कि थोड़ी मात्रा ओ दिखाया गया थाच पसीना और sebum में उत्सर्जित कर रहे हैं CORT परिसंचारी और इसलिए कोट बाल शाफ्ट 2 के बाहर कर सकता है. इस संभावित उलझाना को खत्म करने के लिए, हम बढ़ रही बाल शाफ्ट के भीतर मौजूद CORT पर एक न्यूनतम प्रभाव रहा, जबकि बाहरी CORT दूर करने के लिए प्रकट होता है कि एक हल्के धोने की प्रक्रिया विकसित की है. इस प्रकार, इस प्रक्रिया (isopropanol साथ यानी दो 3 मिनट washes) के अधीन बंदर बाल कुल बाल CORT सामग्री की लगभग 7-8% खो दिया है, और एक तिहाई धोने नमूना 4 से कम से कम 1% अधिक स्टेरॉयड हटा दिया. उसी प्रक्रिया (अप्रकाशित लालकृष्ण रोसेनबर्ग और जे मेयेर,) के नमूनों से 27% कुल CORT सामग्री की एक औसत हटा के बाद से, मानव बाल में अधिक बाहरी CORT ऐसा प्रतीत होता है. बंदर बालों की तरह, तथापि, एक अतिरिक्त धोने पहले दो washes की तुलना में काफी कम CORT (लगभग 7%) निहित. इसलिए, बंदर और मानव बाल दोनों से परिणाम एक प्रमुख इन्हीं को बनाए रखते हुए सबसे (यदि सभी नहीं) बाह्य CORT हटाया जा सकता है कि विवाद का समर्थनआंतरिक बाल मैट्रिक्स के भीतर CORT की tion. दूसरा, हमारे पायलट अध्ययनों से यह भी पता चला है कि संभवतः बाल शाफ्ट के जटिल प्रोटीन मैट्रिक्स खुला तोड़ने के साथ ही विलायक प्रवेश के लिए उपलब्ध सतह क्षेत्र को बढ़ाने के द्वारा, नमूना से काफी वृद्धि हुई CORT वसूली निकासी के लिए बाल पूर्व पीस. दो अलग पीस तरीकों, फायदे और नुकसान के साथ प्रत्येक विकसित किए गए. एक गेंद मिल का उपयोग करता है जो विधि 1,, बेहतरीन पाउडर उत्पादन का लाभ दिया है. हालांकि, एक गेंद मिल एक अपेक्षाकृत महंगे उपकरण मद और मानक पीस जार और गेंदों के साथ प्रयोग किया जाता है, तो यह एक समय में केवल दो नमूने पीस में सक्षम है. छोटे नमूने भी मानक पीस जार के साथ एक गेंद मिल का उपयोग कर प्रक्रिया को मुश्किल कर रहे हैं. एक beadbeater का उपयोग करता है जो विधि 2, अपने पीस क्षमता में कम प्रभावी है. नतीजतन, औसत CORT वसूली गेंद चक्की (अप्रकाशित डेटा) की तुलना में इस पद्धति का उपयोग करके लगभग 10% कम है. दूसरी ओर, एक beadbeaterकाफी कम खर्चीला एक गेंद मिल से है, 16-24 नमूने एक बार मॉडल के आधार पर जमीन की जा सकती है, और विधि छोटे नमूने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है. क्योंकि ऊपर उल्लेख अंतर वसूली की, यह एक विशेष अध्ययन के भीतर सभी नमूनों के लिए एक ही पीस विधि का उपयोग करने की सलाह दी जाती है.
बालों के नमूने संसाधित किया गया है एक बार, वे मूल रूप से लार CORT को मापने के लिए बनाया गया एक संवेदनशील और विशिष्ट व्यावसायिक ईआईए किट के माध्यम से विश्लेषण किया है निष्कर्षों में मेथनॉल और CORT साथ निकाले जाते हैं. निष्कर्षण और परख प्रक्रियाओं बंदर बाल के नमूने से अर्क के धारावाहिक dilutions बारीकी से प्रामाणिक CORT मानकों से प्राप्त रीडिंग paralleled कि ईआईए रीडिंग झुकेंगे कि प्रदर्शन में हिस्सा द्वारा मान्य किया गया. हम तो (प्लाज्मा और लार CORT के अलावा) बाल CORT नए आवास तिमाहियों 4,5 करने के लिए बंदरों का एक प्रशासकीय अनिवार्य स्थानांतरण की प्रमुख जीवन तनाव के प्रति संवेदनशील था कि पता चला है. presenटी कागज मानव और बंदर बाल के नमूने पर कार्रवाई करने के लिए और इस तरह के नमूनों से CORT निकालने के लिए और विश्लेषण करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में नियमित रूप से इस्तेमाल के तरीकों का एक विस्तृत ब्यौरा उपलब्ध कराता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊपर वर्णित बाल CORT प्रक्रिया, प्रदर्शन करने के लिए सरल है अपेक्षाकृत सस्ती है, आसानी से उपलब्ध रसायन, अभिकर्मकों, और आपूर्ति का उपयोग करता है, और एक अपवाद के साथ, एक ठेठ विश्लेषणात्मक प्रयोगशाला में उपस्थ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस अध्ययन में विश्लेषण मानव बाल के नमूने उपलब्ध कराने के लिए Kymberlee ओ 'ब्रायन, सेलिया मूर, और एडवर्ड Tronick (मनोविज्ञान विभाग, मैसाचुसेट्स, बोस्टन विश्वविद्यालय) धन्यवाद, और स्टीफन फिनिश और अमांडा DETTMER (तुलनात्मक ethology, NICHD की प्रयोगशाला) के लिए रीसस बंदर बाल के नमूने उपलब्ध कराने. प्रारंभिक विकास और इस विधि का उपयोग जारी रखना आदमी के लिए एनआईएच RR11122 द्वारा समर्थित किया गया है
Materials
| HPLC-grade isopropanol | Fisher | A451 | |
| HPLC-grade methanol | Fisher | A452 | |
| Salivary cortisol assay kits | Salimetrics | 1-3002 | See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity |
| 15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-25 | |
| 2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-7 | |
| 2.0-ml XXTuff reinforced microvials | BioSpec | 330TX | Use with mini-beadbeater |
| 3.2-mm chrome-steel beads | BioSpec | 11079132c | Use with mini-beadbeater |
| 10-ml stainless steel grinding jars | Retsch | 02.462.0061 | Use with mixer mill |
| 12-mm stainless steel grinding balls | Retsch | 05.368.0037 | Use with mixer mill |
| Savant activated carbon cartridge | Fisher | DTK120R | Use with Savant chemical trap |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rotator for 15-ml centrifuge tubes | Fisher | S02135 | |
| Rotator for microcentrifuge tubes | Fisher | NC9854190 | |
| Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 mixer mill | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac | Fisher | DNA120-115 | |
| Savant refrigerated vapor trap | Fisher | RVT400-115 | |
| Savant chemical trap | Fisher | SCT120 | Alternative to refrigerated vapor trap |
| Microplate reader | |||
| Microplate washer | |||
| Microplate mixer | |||
| Multichannel pipetter | |||
| Analytical balance |
Referências
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