ヒトおよびサル毛髪から抽出およびコルチゾールの分析
Summary
コルチゾール（CORT）は、ヒトとヒト以外の霊長類の成長毛幹に蓄積する。我々は、高精度と感度で髪のCORTを抽出して分析するための方法が記載されている。毛髪CORTの測定は、数週間から数ヶ月の期間にわたって慢性ストレスを評価するために特に適している。
Abstract
ストレスホルモンのコルチゾール（CORT）をゆっくりヒト、非ヒト霊長類、および他の哺乳動物の毛髪成長軸に組み込まれる。私たちは、開発および検証アカゲザル髪からCORT抽出および分析のための方法を、その後、人間の頭髪で使用するためにこの方法を適応。血漿または唾液から得CORT「サンプル点」、毛髪CORTは、視床下部 – 下垂体 – 副腎皮質の統合された尺度を提供する（HPA）系活性、およびホルモンの取り込み期間中にこのようにして生理的ストレスとは対照的である。人間の頭髪が1cm /月の平均速度で成長しているので、長さが数センチ髪のセグメントから得CORTレベルは、潜在的に数ヶ月もかけて経験したストレスのバイオマーカーとして機能することができます。
本手法では、それぞれの毛髪サンプルは、第汗や皮脂から堆積された毛幹の外側から任意CORTを除去し、イソプロパノールで2回洗浄する。乾燥させた後、試料は、毛髪のタンパク質基質を破壊し、抽出のための表面積を増加させるために微細な粉末に粉砕される。毛幹の内部からCORTをメタノール中に抽出し、メタノールを蒸発させ、抽出物をアッセイ緩衝液中で再構成されている。抽出CORT、標準および品質管理と共に、次いで高感度かつ特異的な市販の酵素イムノアッセイ（EIA）キットを用いて分析される。 EIAからの読み出しはmgの粉末状毛髪重量当たりの視聴のCORTに変換される。この方法は、ヒトでマカクザル、マーモセット、イヌ、およびホッキョクグマのいくつかの種を髪のCORTを分析するために我々の研究室で使用されてきた。私たちの研究室から他の研究グループからの両方の多くの研究では、自然の中で慢性的ストレス曝露を評価するだけでなく、実験室の設定のためのヘアCORTの幅広い適用性を実証している。
Introduction
血漿、唾液、または時々尿や糞中におけるCORTの測定は、ストレス1におけるHPA系の役割のセリエの発見以来、生理的ストレスの指標として用いられてきた。多くの論文が、急性ストレスの多い状況にHPA活性を関連する公開されているが、フィールドは、慢性生理的ストレスの簡単で信頼性の高い指標の欠如によって妨げられてきた。この問題は、日内変動を受けやすく、環境障害により混乱することができ、HPA活動の血漿および唾液降伏両方「点」の見積りために生じる。尿と糞便サンプルは、場合によっては一日までの時間数をまたがるCORTおよび/または代謝物の排泄を測定した結果を得ることができます。これらの行列のいずれかを使用して、複数のサンプルの収集経時CORTレベルの大まかな複合インデックスを提供することができるが、これらのアプローチのいずれも、HPA活性の真の長期的なインデックスと、このSYの応答性を提供しない慢性的なストレス要因に由来する。
髪にCORTを測定することは、ストレスの文献でこの重要なニーズを満たすために始めている。いくつかの研究室による初期の研究では、ヒトの毛髪CORTの存在を示したが、毛CORTレベルはストレス2の関数として変更されたかどうか調査していませんでした。私たちの研究室では、様々な社会的、行動要因3でアカゲザルHPA系の調節に何年も前から興味があったように、我々は、アカゲザルの毛4の抽出と分析のための方法を確立し、検証するために設定してください。血液媒介CORTをゆっくりと連続的に成長する毛に組み込まれていることを前提とし、この新たな方法の目的は、数週間から数ヶ月の期間にわたってHPA活性の指標として統合された毛髪由来CORTのレベルを使用することであった。
いくつかの方法論的な課題を、本プロトコールを開発する際に遭遇した。まず、これまでの研究では、その少量Oを示していたF汗や皮脂中に排泄されるCORT循環ので、コートの毛軸2の外側を可能性があります。この潜在的な交絡を排除するために、我々は成長している毛幹内に存在CORTにはほとんど影響を持ちながら、外部CORTを取り除くように見える穏やかな洗浄手順を開発しました。このように、この手順（イソプロパノールすなわち 2つの3分間の洗浄）を行うサルの毛は、総毛CORTコンテンツの約7から8パーセントを失い、3回目の洗浄は、サンプル4から1％未満、よりステロイドを削除しました。同じ手順で（未発表K.ローゼンバーグとJ.マイヤー、）サンプルから27％、総CORTコンテンツの平均を削除するので、ヒトの毛髪の外部CORTがあるように見える。サルの毛と同様に、しかしながら、付加的な洗浄が最初の2回の洗浄よりもはるかに少ないCORT（約7％）を含有した。そのため、サルと人間の髪の毛の両方から得られた結果は、主要なFRACを維持しながら、ほとんどの（すべてではない）外部のCORTを取り外すことができるという主張を支持内部毛母内CORTのTiONから。第二に、我々の予備的研究はまた、前に有意に抽出し、髪を研削すると、おそらく毛幹の複雑なタンパク質性マトリックスをこじ開け、ならびに溶媒の浸透のために利用可能な表面積を増加させることにより、試料からCORT回復を増加することを示した。二つの異なる研削方法は、利点と欠点とをそれぞれ開発された。ボールミルを用いる方法1は、最高の粉末を生成するという利点を有する。しかしながら、ボールミル、比較的高価な装備アイテムであり、標準的な研削ジャー及びボールを使用する場合には、一度に二つの試料を粉砕することができる。少量の試料は、標準粉砕ジャーとをボールミルを用いて処理することは困難である。ビードビーターを用いる方法2は、その研削能力があまり効果的である。その結果、平均CORTの回復はボールミル（未発表データ）と比較してこの方法を使用して約10％低い。一方、ビードビーター試料16〜24は、モデルに応じて、一度に粉砕することができ、この方法は少量の試料に適している、ボールミルよりもかなり安価である。そのため、上記の差動回復するのではなく、特定の研究内のすべてのサンプルで同じ粉砕方法を使用することをお勧めします。
毛髪サンプルが処理されると、それらはもともと唾液CORTを測定するように設計され高感度で特異的な商業的EIAキットにより分析される抽出物中のメタノールおよびCORTで抽出する。抽出と分析手順は、猿の毛のサンプルからの抽出物の段階希釈が密接に本物のCORT標準から得た測定値を並列EIAの測定値が得られていることを実証することによって部分的に検証された。次に、（血漿および唾液CORTに加えて）ヘアCORTは新設住宅四半期4,5にサルの管理上義務付けられた移転の主要な生活ストレスに敏感であることを示した。 PRESENTペーパーは、ヒトとサルの毛髪試料を処理するために、そのようなサンプルからCORTを抽出し、分析するために、我々の研究室で日常的に使用される方法の詳細な説明を提供しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
上述の毛髪CORT手順、実行が簡単であり、比較的安価であり、容易に入手可能な化学物質、試薬および消耗品を利用して、1つの例外を除いて、典型的な分析実験室に存在する可能性が高い、装置を必要とする。例外は、例えばボールミルまたはミニビードビーターのような研削装置である。我々はいくつかの研究グループは、長さ12内のおよそ1ミリメートルの小さな断片に毛髪サンプ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、この研究で分析し、人間の毛髪試料を提供するためのKymberleeオブライエン、セリア·ムーア、エドワードTronick（心理学科、マサチューセッツ州、ボストン大学）に感謝し、スティーブン·スオミとアマンダDettmer（比較動物行動学、NICHDの研究室）のためのアカゲザルの毛のサンプルを提供。この方法の最初の開発と継続的な使用は、人類にNIH RR11122によってサポートされています
Materials
| HPLC-grade isopropanol | Fisher | A451 | |
| HPLC-grade methanol | Fisher | A452 | |
| Salivary cortisol assay kits | Salimetrics | 1-3002 | See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity |
| 15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-25 | |
| 2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-7 | |
| 2.0-ml XXTuff reinforced microvials | BioSpec | 330TX | Use with mini-beadbeater |
| 3.2-mm chrome-steel beads | BioSpec | 11079132c | Use with mini-beadbeater |
| 10-ml stainless steel grinding jars | Retsch | 02.462.0061 | Use with mixer mill |
| 12-mm stainless steel grinding balls | Retsch | 05.368.0037 | Use with mixer mill |
| Savant activated carbon cartridge | Fisher | DTK120R | Use with Savant chemical trap |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rotator for 15-ml centrifuge tubes | Fisher | S02135 | |
| Rotator for microcentrifuge tubes | Fisher | NC9854190 | |
| Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 mixer mill | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac | Fisher | DNA120-115 | |
| Savant refrigerated vapor trap | Fisher | RVT400-115 | |
| Savant chemical trap | Fisher | SCT120 | Alternative to refrigerated vapor trap |
| Microplate reader | |||
| Microplate washer | |||
| Microplate mixer | |||
| Multichannel pipetter | |||
| Analytical balance |
Referências
- Selye, H. Stress and the general adaptation syndrome. Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model. Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).
- Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function. Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).
- Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. Hair as a retrospective calendar of cortisol production – Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy. Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).
- Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations. Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).
- Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. Evaluation of a method to measure long term cortisol levels. Steroids. 76, 1032-1036 (2011).
- Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing’s syndrome. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).
- LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair. Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).
- Dolnick, E. H., Montagna, W., Dobson, R. L. Variability of hair growth in Macaca mulatta. Adv. Biol. Skin. IX, 121-128 (1969).
- Sauvé, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. a. n., H, S. Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure. Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).
- Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications. Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).
- Bechshøft, T. &. #. 2. 1. 6. ;., Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears. Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).
- Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair. Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).
- Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol. FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).
- Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions. Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).
- Stalder, T., Kirschbaum, C. Analysis of cortisol in hair – State of the art and future directions. Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).
- Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review. Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).
