Summary
Nous décrivons la dissection et la culture ex vivo de peau embryonnaire de la souris. Le système de culture maintient une interface air-liquide sur la surface du tissu et permet une imagerie sur un microscope inversé. Mélanoblastes, une composante de la peau en développement, sont marqué par fluorescence permettant leur comportement à observer par microscopie confocale.
Abstract
Mélanoblastes sont la crête neurale précurseurs de mélanocytes dérivés; les cellules responsables de la production du pigment dans la peau et les cheveux. Mélanoblastes migrent à travers l'épiderme de l'embryon où elles colonisent ensuite le développement de follicules de cheveux de 1,2. La migration des cellules de la crête neurale est largement étudiée in vitro, mais les méthodes in vivo ne sont pas encore bien développée, surtout dans les systèmes mammifères. Une alternative est d'utiliser culture ex vivo organotypique 3-6. Culture de peau embryonnaire de la souris nécessite le maintien d'une interface air-liquide (ALI) à travers la surface du tissu de 3,6. Haute résolution live-imagerie de la peau embryonnaire de la souris a été entravée par l'absence d'une bonne méthode qui maintient non seulement ce ALI mais permet aussi la culture à être inversée et donc compatible avec courte distance de travail lentilles de l'objectif et des microscopes les plus confocale. Cet article décrit les améliorations récentes à une méthod qui utilise une membrane perméable aux gaz pour surmonter ces problèmes et de permettre à haute résolution de l'imagerie confocale peau embryonnaire en culture ex vivo 6. En utilisant un mélanoblaste Cre recombinase spécifique exprimant lignée de souris combinée avec la ligne de reporter R26YFPR nous sommes en mesure de marquer par fluorescence la population mélanoblaste dans ces cultures de la peau. Cette technique permet de live-imagerie de mélanoblastes et l'observation de leur comportement et les interactions avec le tissu dans lequel elles se développent. Les résultats représentatifs sont inclus pour démontrer la capacité de vivre-image 6 cultures en parallèle.
Introduction
Traditionnellement peau embryonnaire a été cultivée en disséquant de l'embryon de souris et de montage sur une membrane en polycarbonate Nuclepore. La membrane est ensuite introduit sur un milieu de culture, en maintenant ainsi une interface air-liquide sur la surface du tissu en développement 3,4. Cette technique a été utilisée pour analyser le comportement mélanoblaste en fixant le tissu et l'évaluation de la distribution en utilisant mélanoblaste β-galactosidase en tant que marqueur 7. Nous avons développé une méthode qui permet mélanoblastes live-imagerie de fluorescence marqués en culture ex vivo de la peau 6. Ici, nous décrivons la méthode en détail de dissection, de configuration, de vivre l'imagerie confocale et incluons certaines améliorations récentes.
Mélanoblastes sont les précurseurs embryonnaires des mélanocytes, les cellules qui produisent le pigment dans les cheveux et la peau. Mélanoblastes se posent dans la crête neurale à côté du tube neural pendant la journée autour embryonnaire 9 (E9) chez la souris e développementmbryo. Par la suite, ils migrent le long d'une voie dorsolatéral entre l'ectoderme et les somites développement. A E12.5 ils se déplacent du derme à l'épiderme où ils prolifèrent et continuent leur migration. Le motif de follicule pileux primaire commence à se former dans l'épiderme à E14.5 et E15.5 par mélanoblastes sont à localiser ces follicules. Pour une analyse de l'évolution mélanoblaste / mélanocytes voir Thomas & Erickson (2008) 1. Afin de marquer la population mélanoblaste nous avons combiné Tyr :: CREB animaux qui expriment la Cre-recombinase dirigée par le promoteur de la tyrosinase de la souris avec 8 animaux R26YFPR qui expriment la protéine fluorescente jaune (YFP), conditionnellement à partir du locus ROSA26 9.
Nous décrivons un procédé de culture d'embryons images de la peau et de saisie à l'aide d'un microscope confocal inversé. Il est adapté sous forme de la méthode originale décrite dans Mort et al. (2010) 6. La présenteméthode permet l'imagerie dans un format de 6 puits et élimine le recours à des membranes Nuclepore et sur matrigel à soutenir la culture. Au lieu de cela à l'aide d'un petit bloc d'agarose à 1% pour stabiliser la peau embryonnaire. Retrait de la dépendance à l'égard matrigel est particulièrement important dans les cas où la réponse de la peau embryonnaire à des facteurs de croissance solubles est l'objet d'étude. Notre méthode originale a déjà été utilisé pour acquérir de nouvelles connaissances dans le développement de mélanoblaste 10-13 et nous prévoyons que les améliorations que nous décrivons ici, il sera plus puissant qu'une technique expérimentale en particulier lorsque plusieurs cultures parallèles sont une exigence.
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Protocol
Tous les travaux des animaux a été effectuée conformément aux directives institutionnelles sous licence par le Home Office du Royaume-Uni (numéro de licence du projet PPL 60/3785 et 60/4424).
1. Préparation
- Étiqueter les mélanoblastes dans la peau en développement en combinant une ligne appropriée recombinase Cre exprimant la souris avec une lignée de souris rapporteur fluorescent. Tyr :: CreA, Tyr :: CREB 8 et Wnt1 :: Cre 14 ont été utilisés avec succès comme lignes Cre-exprimant et R26YFPR 9 en tant que ligne de reporter.
- Préparer le milieu de culture dans une hotte à flux laminaire; compléter milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec (1% v / v de pénicilline / streptomycine), à 10% v / v de sérum de veau foetal et 0,584 g / L de L-glutamine.
- Appareil d'imagerie en temps réel est décrit sur la figure 1 Stériliser la base de la chambre de formation d'image par l'essuyant avec 70% d'éthanol. Stériliser les inserts, des clips d'imagerie, et les joints toriques par trempage overnight dans 70% d'éthanol. Utilisation d'un couvercle stérile à partir d'une plaque à 6 puits en tant que le couvercle de la chambre.
- La surface inférieure de la chambre d'imagerie est constitué d'une membrane de lourdaud maintenu en place par un joint torique (Figure 1). Commencez avec un plat de lourdaud de 35 mm de gaz perméable. Placer le plat sur la chambre de l'imagerie et de découper la membrane perméable au gaz avec une seule lame de rasoir tranchant. Pousser le joint torique au-dessus de la membrane pour le fixer à la chambre d'imagerie.
- Les clips d'imagerie (6 au total) pince la peau embryonnaire en place (figure 1) avant de l'utiliser, ils doivent être remplis avec 1% d'agarose. Préparer une solution à 2% d'agarose avec dH 2 O stérile par micro-ondes et le refroidissement à 60 ° C. Mix 1:1 avec 10 ml de milieu de culture (voir étape 2) préchauffé à 60 ° C. Placez les clips d'imagerie 6 dans une plaque à 6 puits stérile. Goutte à goutte la solution d'agarose à 1% dans le centre de chaque clip à l'aide d'une amende pastette et laisser refroidir. Ajouter 1 ml de PBS froid stérile à chaque puits pour empêcher l'ungarose de se dessécher. Les séquences d'imagerie peuvent être stockés pendant plusieurs heures dans du PBS.
- Pour effectuer la séparation délicate de la peau embryonnaire et de manipuler le tissu disséqué utiliser la «méthode de bâton de cheveux" comme décrit dans Kashiwagi et al. 3 Au lieu d'utiliser une baguette une pique de brochette de bambou peut être utilisé. Faire une petite fente dans la partie plate de la brochette en utilisant une seule lame de rasoir tranchant et insérer une brosse à dents à poils doux. Couper la brochette de sorte qu'il est d'environ 15 cm de longueur.
- Utiliser un microscope confocal avec une chambre environnementale complète ou organiser chambre supérieure offrant 5% de CO 2 dans l'air. Préchauffer la platine du microscope à 37 ° C pendant au moins 1 heure avant l'imagerie. Cela permet d'éviter la dérive échantillon causée par la dilatation des composants de l'étage comme ils se réchauffent.
- Préparer un ensemble multi-position à l'aide du logiciel de contrôle du microscope de sorte que l'on peut rapidement et facilement centrer sur le milieu de chaque culture à mettre en place une expérimentationt.
2. Procédure
- Compagnon de la souris et désigner le premier jour après le coït comme 0,5 ME de jour. A E14.5 jour, abattre la femelle par dislocation cervicale et exposer la cavité du corps en faisant une petite incision médiane, écartant la peau vers la tête et la queue, puis couper le péritoine sous-jacent et peler dos de chaque côté du corps. Disséquer l'utérus en froid PBS stérile en tenant fermement avec une pince et coupant le long de la mésomètre l'aide de ciseaux chirurgicaux. Gardez l'utérus sur la glace jusqu'à ce que nécessaire. Pour une description détaillée, voir Shea et al. (2007) 15.
- Disséquer les embryons de l'utérus par la première coupe de la longueur de la paroi de l'utérus avec des ciseaux chirurgicaux pour libérer la caduque et la dissection des embryons de la caduque par les séparant avec deux paires de pinces fines. Écran pour l'expression de rapporteur fluorescent (si nécessaire).
- Abattre embryons par décapitation avant la dissection. Subsenlever equently la queue et postérieurs membres, puis les pattes avant en utilisant une seule lame de rasoir tranchant. Conserver le tissu pour le génotypage si nécessaire.
- Faire une incision dans la ventrale près de la ligne médiane dans une direction rostro-caudale. Utilisation des bâtons de cheveux décrites à l'étape 1.6, à une distance de démêler soigneusement la peau à partir du tissu conjonctif sous-jacent l'embryon tournant en même temps. Ne pas enlever la peau complètement, mais plutôt laisser attaché le long du bord le plus ventrale de la première incision.
- Il est important de ne pas laisser la peau se foiré car il est alors très difficile à monter. Pour éviter cela, aplatir la peau en utilisant des bâtons de cheveux (côté cutanée de plus) sur la surface d'une boîte de Pétri sec, puis couper le tronc de l'embryon en utilisant une seule lame de rasoir tranchant. Le côté dermique peut être distinguée à partir du côté de l'épiderme par une observation attentive de la jonction entre le tissu disséqué et l'embryon avant la peau est enlevée. La surface du tissu disséqué estenviron 0,5 mm 2 en disséquant un embryon E14.5.
- Placer un clip de formation d'image sur le dessus de la peau de sorte que l'agarose est en contact avec la face dermique du tissu. Laisser reposer pendant 60 secondes et ensuite soigneusement taquiner les bords du tissu sur les côtés de la pince. Inversez le clip et utiliser les cheveux colle à aplatir la peau et enlever les bulles d'air, en prenant soin de toucher la surface du tissu (dans la zone qui sera imagée) aussi peu que possible.
- Utilisez du fil de suture de soie pour lier la peau pour le clip d'imagerie utilisant deux noeuds de pouce simples de chaque côté du clip d'imagerie afin qu'ils resserrent et tirer la peau dans la rainure près du sommet du clip. Inversez le clip, pousser à l'intérieur de l'insert d'imagerie et le lieu de la base. Remplissez l'insert avec ~ 5 ml de milieu de culture (voir l'étape 1.2). Figure 1 présente l'ensemble de la chambre de l'imagerie.
- Répétez protocole pour les 5 échantillons restants.
3. VivreImagerie
- La chambre d'imagerie a les mêmes dimensions que la plaque à 6 puits standard. Utilisation d'un insert de plaque approprié pour monter la chambre sur la platine du microscope confocal.
- Une étape automatisée est nécessaire à l'image des cultures en parallèle. Définir les six positions de l'image dans le logiciel confocal. Les paramètres exacts dépendent de la capacité du microscope utilisé. Typiquement, une petite pile z (z 3-5 positions pour tenir compte de toute dérive de phase) est utilisé dans chacune des six positions et un z-pile est saisie toutes les 2 min pendant 18 à 24 h. Pour les applications live-imagerie, il est généralement avantageux d'utiliser un cadre plus large que sténopé optique optimale pour réduire la puissance du laser et le nombre de z-sections requises.
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Representative Results
La figure 2 montre des résultats représentatifs d'une expérience de laps de temps à l'aide de la peau embryonnaire de Tyr :: CREB x embryons R26YFPR à E14.5. 6 cultures embryonnaires de la peau ont été imagées par microscopie confocale toutes les 2 min pendant 18 heures. Le progiciel d'analyse d'image ImageJ freeware a été utilisé pour analyser le comportement des mélanoblastes YFP marqués dans les 6 films. Les mélanoblastes étaient détectés automatiquement en utilisant le plugin wrMTrck développé par Jesper Pedersen Søndergaard ( http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html ) les résultats de suivi sont présentés à la figure 2. Films 1-3 sont représentatifs de l'expérience et correspondent aux panneaux A et G. Ils montrent la lumière transmise, YFP et des vues composites respectivement. La population mélanoblaste migration est extraordinairement actif. Cellules se déplacent presque constamment et ne s'arrêtent quand ils sont sur le point de diviser par kmtose. Il est également possible d'observer le développement de la structure primaire du follicule pileux au cours de la période de culture dans le canal de lumière transmise (figures 3A-3X et le film 1).
.. Figure 1 Matériel et configuration A: La base de la chambre de l'imagerie en direct se compose d'un boîtier en plexiglas transparent avec des dimensions extérieures identiques à une boîte de culture de 6 puits. Il contient six trous dans lesquels les ensembles de musique de chambre individuelles 6 peuvent Slot B:. Chaque insert est composé de 4 éléments; un élément de formation d'image, un insert de formation d'image, une membrane de lourdaud, et un joint torique. Le clip et l'insert sont tournées du noir acétyl plastique, nous avons trouvé que d'avoir la plus faible autofluorescence des matières plastiques que nous avons testés. Le joint torique est fabriqué à partir d'un PVCd est utilisée pour pincer la membrane de lourdaud sur le fond de l'insert formant l'interface air-liquide (ALI). Le clip de formation d'image (acétyle noir) a plusieurs trous pour permettre la circulation de milieu de culture C:. L'arbre central de la pince est rempli avec 1% d'agarose avant de les utiliser pour former une surface plane et solide sur lequel monter la peau. La peau est attachée à la pince à fil de suture avant d'être poussé dans l'insert, prise en sandwich entre la peau et la membrane d'agarose lourdaud. L'insert est ensuite remplie de milieu de culture D:. Afin de disséquer et de manipuler la peau embryonnaire une seule brosse à dents à poils est monté dans une fente dans l'extrémité plate d'une pique de brochette de bambou. Une paire de bâtons de cheveux peut être utilisé en combinaison avec des pinces fines pour disséquer la peau embryonnaire et monter dans la chambre de l'imagerie E:.. Photographies des composants sont détaillés dans AC S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Des résultats représentatifs de 6 films enregistrés en parallèle. AF: Le suivi des résultats à partir de 6 films enregistrés en parallèle à démontrer les capacités du système. Chaque film a été enregistrée à des moments de 2 min pour un total de 18 heures (voir Films 1-3 pour le film correspondant de panneaux A et G). Les positions des cellules dans une trame du film sont présentés et les résultats du suivi sont superposées sur GL:. Résumé des résultats de suivi tracée à zéro des données de suivi.
d/51352/51352fig3.jpg "/>
Figure 3 images représentatives de films time-lapse de cheveux développement folliculaire et d'un mélanoblaste mitose AX:.. Sélectionnée, cultivée cadres de film 1 follicules pileux primaires deviennent visibles sur la période de culture de peau 0-18 h.. Une LUT a été appliqué aux images A'-X. ': Sélectionnée, cultivée cadres de Movie 2 images représentatifs de mélanoblastes migrent dans l'épiderme en développement et une cellule individuelle (voir flèche en A'.) Mitose subir (flèche en T ') . S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Film 1: résultat Représentant du canal de lumière transmise à partir d'une expérience time-lapse de 18 h. </ Strong> Le motif du follicule pileux primaire, mais pas évident au début du film, devient plus importante que la culture progresse.
Film 2: . résultat représentatif du canal YFP d'une expérience de temps de déchéance 18 h La population de mélanoblaste est une population très dynamique et migratoire. Cellules stationnaires rares sont généralement en cours de la mitose (voir la figure 3).
Film 3: . résultat représentatif de la couche composite d'une expérience de temps de déchéance 18 h La population de mélanoblaste peut être vu à migrer dans l'épiderme en développement et d'interagir avec les follicules pileux en développement.
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Discussion
Nous décrivons une méthode de culture embryonnaire peau qui est particularité prête à l'imagerie des cellules vivantes sur des microscopes confocaux inversées. Le procédé comprend les améliorations récentes qui permettent 6 cultures à imager en parallèle et supprime le recours à matrigel et membranes Nuclepore de la méthode originale 6. La différence essentielle technique de techniques similaires est l'utilisation d'une membrane perméable aux gaz lourdaud pour établir une interface air-liquide et aussi d'agir comme une lamelle. Nous avons réussi à maintenir les cultures avec l'imagerie confocale en continu jusqu'à 48 h. La haute résolution et un excellent rapport signal sur bruit des images confocale permet le suivi des cellules automatisé pour analyser le comportement mélanoblaste dans les films time-lapse en résultent.
En utilisant cette technique, il est possible d'étudier la dynamique de dispersion mélanoblaste et étudier leur interaction avec l'épiderme et les follicules pileux en développement. La st critiqueeps dans le protocole sont à effectuer une dissection minutieuse qui n'endommage pas l'épiderme en développement et de monter le côté dermique des échantillons de peau contre l'agarose sans le plier ou étendues. La procédure décrite dans cet article fonctionne mieux entre E13.5 et E15.5. Avant E13.5 la peau est très fragile et après E15.5 il est relativement épaisse et difficile à pénétrer par microscopie confocale. Les capacités du système de microscope utilisé sont également très importants. Nous utilisons généralement un microscope confocal Nikon A1R équipé propriétaire parfait accent système de Nikon (PFS). Utilisation PFS réduit considérablement le nombre de mauvais films causés par la dérive de la scène, des systèmes similaires sont disponibles pour d'autres plates-formes.
Un inconvénient de cette technique est la nécessité d'un équipement de culture spécialisés. Cependant, la conception est simple et la chambre pourrait être facilement assemblé par un petit atelier technique. En résumé, nous présentons une méthode simple qui devrait se révéler utile pour Studies du développement embryonnaire de la peau et le comportement mélanoblaste. Il est prévu que la technique peut également être modifiée pour d'autres scénarios où une interface air-liquide est une exigence pour la culture réussie.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Le travail a été soutenu par un financement de base du Conseil de recherches médicales. Nous sommes reconnaissants à Craig Nicol pour préparer des dessins techniques. Nous sommes reconnaissants à Matthew Pearson et Paul Perry pour leur soutien d'imagerie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30 cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
References
- Thomas, A. J., Erickson, C. A. The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest. Pigment Cell & Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).
- Mayer, T. C. The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos. Developmental Biology. 34 (1), 39-46 (1973).
- Kashiwagi, M., Huh, N. Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis. Epidermal Cells: Methods and Protocols. Turksen, K. 289, Humana Press. 39-45 (2005).
- Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin. Developmental Biology. 189 (1), 22-32 (1997).
- Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies. Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).
- Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).
- Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles. Developmental Biology. 225 (2), 424-436 (2000).
- Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L.
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).
- Li, A., et al. Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod. Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).
- Li, A., et al. Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism. The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).
- Schachtner, H., et al. Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo. European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).
- Ma, Y., et al. Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation. Development. 140 (10), Cambridge, England. 2203-2211 (2013).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).
