1. הכנת כימיה הכנה ואחסון של PLL-g-PEG-ביוטין ואבידין: להמיס את פולימר PLL-g-PEG-ביוטין במאגר PBS על פי הוראות היצרן בריכוז של 1.0 מ”ג / מיליליטר. Aliquot על פי גודל כריכה (ראה טבלה 1)ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד שנה אחת. הכנה ואחסון של אבידין/נויטרבידין ממיסים את Avidin/NeutrAvidin ללא תווית במאגר PBS בהתאם להנחיות היצרן בריכוז של 1.0 מ”ג/מ”ל. Aliquot על פי גודל coverslip (ראה טבלה 1)ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד 3 שנים. הכנת דגימת וירוס: הכינו דגימות וירוסים לפי צורך ניסיוני ופרוטוקול מעבדה לפני ההסמכה הזו. השתמש בשלב 1.3.1 עבור שיטה 5A, או 1.3.2 עבור שיטה 5B. הכינו דגימות וירוסים לשיטה 5A לקראת שלב 2. השתמש דגימות ויראליות מוכנות בתוך 1-2 ימים של הכנה, או aliquot על פי גודל להחליק כיסוי (ראה טבלה 1) ואז להקפיא פלאש בחנקן נוזלי ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד שנה אחת. כאשר מופשרים, יש להשתמש מיד. הכן דגימות וירוסים לשיטה 5B בדומה ל- 1.3.1. להפשיר aliquots של וירוס מראש של 5B ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לא יותר מ 24 שעות לפני ערבוב עם נוגדנים. הכינו נוגדנים ביו-טינילציה מתאימים לניסוי. 2. ניקוי כריכות כהכנה לטיפול כימי מניחים כיסויים בארון תקשורת טפלון בגודל מתאים שמחזיק אותם בכיוון אנכי ומכניסים אותם לעגלה מלאה באלכוהול אתיל מסונן (0.2 מיקרומטר) (190 הוכחה). Sonicate את הכיסויים באלכוהול אתיל מסונן (190 הוכחה) במשך 30 דקות. הסר כיסויים מאלכוהול ולשטוף כיסויים בהרחבה עם מים אולטרה-דקים. מניחים כיסויים שטפים בארון תקשורת טפלון נקי נפרד וזכוכית מלאה 1 M NaOH. סוניק את הכיסויים ב 1 M NaOH במשך 30 דקות. הסר כיסויים מ NaOH ולשטוף אותם בהרחבה עם מים אולטרה סגולים. יבשו את הכיסויים השטפים בזרם חנקן, והניחו אותם בארון תקשורת טפלון נקי ויבש. בדוק את הכיסויים עבור כל סרט או חלקיקים גלויים שנותרו על העטיפה. אם נשאר חומר נראה לעין, הכיסוי לא נוקה כראוי ושטוף. אם לא ניקו כראוי את שלבי החזרה 2.1-2.7. נקה את הכיסויים עם חמצן-פלזמה במשך 2 דקות. שלב זה הוא אופציונלי אך מומלץ. 3. היווצרות שכבת הסרט הדק PLL-g-PEG מיד לאחר ייבוש בזרם החנקן (או פלזמת החמצן האופציונלית), מניחים כיסוי אחד אופקית בצלחת פטרי סטרילית. פיפט במרכז הכיסויים כמות מתאימה של PBS מופשר אגירה PLL-g-PEG-ביוטין (ראה טבלה 1). מניחים עוד כיסויים מנוקים על גבי הנוזל בשיטת כריך. שים לב כי שיטה זו מורכבת משני כיסויים להדגיר את הסרטים הכימיים שלהם על ידי התמצאות שלהם כימית מטופלים “פרצופים פעילים” אחד כלפי השני, מופרדים רק על ידי השכבה הכימית הנוכחית. ודא שיש מספיק נוזלים כך שהנפח בין שני הכיסויים מלא לחלוטין בנוזל, אך אין נוזל דולף החוצה בין הכיסויים (ראה טבלה 1). “הפנים הפעילות” מעתה ואילך מייעדות פרצופי כיסוי שהיו במגע עם הנוזל בתצורת הכריך. מניחים את המכסה של צלחת פטרי מעל כריך כריכה ודגרת ב RT במשך 45-60 דקות. מוציאים את המכסה של צלחת פטרי ומרימים את הכריך עם זוג פינצטה. היזהר לא לצבוט נוזלים עודפים. השתמש באגודל ובאצבע המורה כדי לצבוט את הכריך קלות ולהחליק את הכיסויים בכיוונים מנוגדים אופקית ביחס זה לזה, ולאחר מכן להפריד את שני כריכות אחד מהשני מבלי לגעת בפנים הפעילים. יש לשטוף את שני הפרצופים הפעילים במים אולטרה-דקים על ידי הזרמת 25 מ”ל של מים אולטרה-דקים על הפנים הפעילות 2-4x, ולאחר מכן לייבש את הכיסויים עם זרם חנקן. הקפד לציין אילו פרצופי כיסוי פעילים. יש להשתמש בכיסויים באופן מיידי, או לאחסן את O/N עם הפנים הפעילות כלפי מעלה בצלחת פטרי סטרילית הממוקמת בסביבת לחות נמוכה נטולת אבק. 4. שיפור מחייב אבידין מניחים כיסויים שטופלו ב-PLL-g-PEG עם פנים כלפי מעלה בצלחת פטרי סטרילית. פיפט כמות מתאימה של אבידין מופשר במאגר (מוכן בשלב 1.2) על אמצע הפנים הפעילים. מניחים כיסוי נוסף (פנים פעילות כלפי מטה) על גבי הנוזל בשיטת הכריך. שים לב לפנים הפעילות של התוויות. חשוב שהפרצופים הפעילים יהיו במגע עם הנוזל במהלך הדגירה (ראו שלב 3.2). מניחים את המכסה של צלחת פטרי מעל כריך כריכה ודגרת ב RT במשך 25-30 דקות. הסר את מכסה צלחת פטרי ולהפריד את שני coverslips כמתואר בשלב 3.4, הקפד לעקוב ולא לגעת בפנים הפעילים. יש לשטוף את שני הפרצופים הפעילים במים אולטרה-דקים על ידי הזרמת 25 מ”ל של מים אולטרה-דקים על הפנים הפעילות 2-4x ולאחר מכן לייבש את הכיסויים עם זרם חנקן. שים לב לפנים הפעילות של התוויות. יש להשתמש באופן מיידי לשלב הבא. הערה חשובה: ישנן שתי שיטות נפרדות להשלמת הכנת מדגם בהתאם לסוג הבדיקה שהניסוי כרוך בה. על הנסיין להמשיך בשלב 5A שבו הנגיף מעוגן לזכוכית לפני הוספת טיפול נוגדנים נוסף הנדרש להדמיית סופר-רזולוציה. 5B מתאר שיטה חלופית של תיוג הנגיף בתמיסה לפני עיגון אותו לזכוכית. הנתונים הייצוגיים בכתב יד זה מוכנים באמצעות 5A. יש לבחור שיטה מתאימה בהתאם לסוג מבחנים ניסיוניים. 5A. קשר נוגדן פנים פעיל מיד לאחר ייבוש עם זרם חנקן בשלב 4.6, מניחים כיסויים שטופלו באבידור עם הפנים כלפי מעלה בצלחת פטרי סטרילית. פיפט כמות מתאימה של נוגדן biotinylated מופשר במאגר על אמצע הפנים הפעילים (ראה טבלה 1). מניחים כיסוי נוסף (פנים פעילות כלפי מטה) על גבי הנוזל בשיטת כריך. שים לב לפנים הפעילות של הכותרות, חשוב שהפרצופים הפעילים נמצאים במגע עם הנוזל להדגירה (ראה שלב 3.2). מניחים את המכסה של צלחת פטרי מעל כריך כריכה ודגרת ב RT במשך 45-60 דקות. הסר את מכסה צלחת פטרי ולהפריד את שני coverslips כמתואר בשלב 3.4, הקפד לעקוב ולא לגעת בפנים הפעילים. יש לשטוף את שני הפרצופים הפעילים ב-PBS על ידי צנרת של 25 מ”ל של PBS על הפנים הפעילות 2-4x, לא להתייבש ולהשתמש בהם באופן מיידי. הקפד לעקוב אחר אילו פרצופי כריכה פעילים. מניחים כיסויים מטופלים נוגדנים עם הפנים הפעילות כלפי מעלה בצלחת פטרי סטרילית, ופיפט כמות מתאימה של וירוס מופשר במאגר על אמצע הפנים הפעילות. מניחים כיסוי נוסף (פנים פעילות כלפי מטה) על גבי הנוזל בשיטת כריך. שימו לב לפנים הפעילות, שכן חשוב שהפרצופים הפעילים נמצאים במגע עם הנוזל להדגירה (ראו שלב 3.2). מניחים את המכסה של צלחת פטרי מעל כריך כריכה ודגרת ב RT במשך 45-60 דקות. הסר את מכסה צלחת פטרי ולהפריד את שני coverslips כמתואר בשלב 3.4, הקפד לעקוב ולא לגעת בפנים הפעילים. יש לשטוף את שני הפרצופים הפעילים עם PBS על-ידי צנרת של 25 מ”ל של PBS על הפנים הפעילות 2-4x. אין לייבש את הכיסויים, במקום זאת מניחים אותם בארון תקשורת טפלון וזכוכית מלאה PBS מיד. הקפד לעקוב אחר אילו פרצופי כריכה פעילים. יש להשתמש בדגימות המוכנות באופן מיידי או לאחסן במאגר מתאים ב-4 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה ימים ללא אובדן משמעותי של שלמות.הערה חשובה: אם יש להשתמש בדגימות ב- AFM assay, ההכנה הושלמה וניתן להשתמש בהן באופן מיידי או לאחסן אותן כמתואר בשלב 5A.20 – 5A.21. אם יש להשתמש בדגימות בהדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציית-על, המשך לתיוג הנוגדנים המתואר בשלבים 5A.12 – 5A.19. מניחים את שני הכיסויים שטופלו בווירוס עם הפנים כלפי מעלה בצלחת פטרי סטרילית ומאגר חסימת חלבונים מספיק על המכפלות כדי לחרוז מספיק נפח נוזלים כדי לכסות את 95% המרכזיים של הכיסוי מבלי להזרים כל חיץ חסימה מהכיסוי (בדרך כלל 100 – 200 μl.) דגירה ב RT במשך 60-90 דקות. בזהירות להסיר חיץ חסימה על ידי הסרת coverslips אחד בכל פעם מצלחת פטרי לשפוך את הנוזל של כיסוי לתוך פסולת. היזהר לא להפיל את הכיסוי. יש לשטוף את שני הפרצופים הפעילים ב-PBS על ידי צנרת של 25 מ”ל של PBS על הפנים הפעילות 2-4x, לא להתייבש ולהשתמש בהם באופן מיידי. הקפד לעקוב אחר אילו פרצופי כריכה פעילים. מניחים חיץ חסימה יחיד מטופל coverslip פעיל פנים כלפי מעלה בצלחת פטרי סטרילית, פיפטה כמות מתאימה של נוגדן ויראלי שכותרתו פלואורסצנטית במאגר על אמצע הפנים הפעילים. מניחים כיסוי נוסף (פנים פעילות כלפי מטה) על גבי הנוזל בשיטת כריך. שים לב איזה פרצוף פעיל, חשוב כי הפנים הפעילים נמצאים במגע עם הנוזל עבור דגירה (ראה שלב 3.2). מניחים את המכסה של צלחת פטרי מעל כריך כריכה ודגרת ב RT במשך 30 דקות. הסר את מכסה צלחת פטרי ולהפריד את שני coverslips כמתואר בשלב 3.4, הקפד לעקוב ולא לגעת בפנים הפעילים. יש לשטוף את שני הפרצופים הפעילים ב-PBS על ידי צנרת של 25 מ”ל של PBS על הפנים הפעילות 2-4x, לא להתייבש ולהשתמש בהם באופן מיידי. הקפד לעקוב אחר אילו פרצופי כריכה פעילים. אין לייבש את הכיסויים, במקום זאת מניחים אותם בארון תקשורת טפלון בתוך זכוכית מלאה PBS. הקפד לעקוב אחר אילו פרצופי כריכה פעילים. יש להשתמש בדגימות המוכנות באופן מיידי או לאחסן במאגר מתאים ב-4 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה ימים ללא אובדן משמעותי של שלמות. 5B. בפתרון התקפת נוגדנים שיטה זו היא שיפור אופציונלי של אסטרטגיית התיוג עבור ההדמיה הפלואורסצנטית ברזולוציית-על. על ידי החלת התקפת הפתרון, ניתן להשיג ציפוי נוגדנים טוב יותר על פני השטח הנגיפיים. מערבבים פתרונות נוגדנים ביחסים לפי הצורך בניסויים. דוגמה 1:4 יחס של 0.01 מ”ג / מ”ל נוגדן biotinylated ל 0.01 מ”ג / מיליליטר פלואורסצנטי שכותרתו נוגדן ייתן זיקה מחייבת טובה ולאפשר התאוששות מעטפה טובה במדורי הדמיה ברזולוציה סופר. מערבבים חלקים שווים של פתרונות הנוגדנים והווירוסים שהוכנו בהתאמה (5B.1) ו- (1.3). מערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים aliquot. פתרון זה וכתוצאה מכך ניתן לאחסן עד הצורך עד 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. עם השלמת שלב 4.6, מניחים כיסויים מטופלים אבידין עם פנים פעיל למעלה בצלחת פטרי סטרילית. פיפטה כמות מתאימה של וירוס עם פתרון נוגדנים (מוכן בשלב 5B.2) על אמצע הפנים הפעילים. מניחים כיסוי נוסף (פנים פעילות כלפי מטה) על גבי הנוזל בשיטת כריך. שימו לב לפנים הפעילות, שכן חשוב שהפרצופים הפעילים נמצאים במגע עם הנוזל להדגירה (ראו שלב 3.2). מניחים את המכסה של צלחת פטרי מעל כריך כריכה ודגרת ב RT במשך 45-60 דקות. הסר את מכסה צלחת פטרי ולהפריד את שני coverslips כמתואר בשלב 3.4, הקפד לעקוב ולא לגעת בפנים הפעילים. יש לשטוף את שני הפרצופים הפעילים עם PBS על-ידי צנרת של 25 מ”ל של PBS על הפנים הפעילות 2-4x. אין לייבש את הכיסויים, במקום זאת מניחים אותם בארון תקשורת טפלון וזכוכית מלאה PBS מיד. הקפד לעקוב אחר אילו פרצופי כריכה פעילים. יש להשתמש בדגימות מוכנות באופן מיידי או לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה ימים ללא אובדן משמעותי של שלמות. 6. מדידת מאפיין חומר מיקרוסקופי כוח אטומי הפעל את לייזרים AFM ולפתוח את תוכנת AFM. בחרו במצב הסריקה המתאים לתקנון הרצוי מתיאו-שיח הפתיחה. כל החלונות הדרושים צריכים להיפתח כברירת מחדל; אם אינך מתייעץ עם המדריך למשתמש כדי לפתוח את החלונות הרצויים. בחר cantilever המתאים למדידה הרצויה ולהכניס אותו לתוך דיור cantilever על פי הנחיות היצרן. ישנם מגוון רחב של תנאים וסוגי ניסויים שעבורם יש מגוון של cantilevers. הנסיינית צריכה לחקור את הניסויים בהתאם לצורך שלהם. הכנס את דיור cantilever לתוך ראש AFM על פי הנחיות היצרן. אם יש להשתמש במדגם בתנאים רטובים, הסר את הדגימה ממאגר האחסון והמשך לשלב 6.7. אם יש להשתמש במדגם בתנאי סביבה (יבשים), הסר את הדגימה ממאגר האחסון שלה ושטוף אותה לזמן קצר על ידי טבילה בעגלה של מים אולטרה-דקים. הערה: זה ישאיר שכבת לחות דקה על המדגם אשר עלול לגרום משיכה נימי עם cantilevers בעל קבוע באביב נמוך. אם יש להשתמש במדגם בתנאי סביבה (יבשים), יבש בעדינות את הדגימה עם זרם חנקן. ייבש בעדינות את הצד האחורי של העטיפה בנייר סינון ללא אבק, וודא שלא ייגע בפנים הפעילות של הדגימה. הנח את הדגימה במחזיק מדגם AFM המתאים ולאחר מכן מקם את המדגם על שלב AFM. אם המדגם הוא להיות בתמונה בתנאים רטובים, פיפטה כמות קטנה של חוצץ על מרכז המדגם (~ 10 μl). הנח את ראש AFM מעל הדגימה. אם המדגם רטוב, ודא כי קצה cantilever ו- AFM לחדור את שכבת פני השטח, וכי אין בועות בין cantilever ו cantilever דיור. ליישר את לייזר AFM עם cantilever בהתאם להמלצות היצרן על מנת לקבל את האות האופטימלי. למדוד את תדירות התדהודה ולהגדיר את תדירות הסריקה לפי סוג הניסוי. הנמך את קצה AFM לפני השטח ומטב את הגדרות האות. בצע סריקת AFM מרובעת של 20 מיקרומטר במצב שתבחר. נעשה שימוש במצב הקשה (AC) ביצירת נתונים מייצגים. לזהות מועמדים וירוס לפי גובה משוער, אשר בדרך כלל ניתן לראות קוצים חדים על פני השטח זכוכית. בחר מועמד וירוס ומרכז את ראש הסריקה שמעליו. בצע סריקה מרובעת של 250 ננומטר (או סריקה מתאימה ברזולוציית-על) אודות הווירוס הנבחר על מנת להשיג את הטופולוגיה והכיוון שלו. בחר נקודה על הנגיף למדידת רכוש החומר(למשל מרכזו של וירוס כדורי למדידת מודולוס של יאנג) ובצע את המדידה בהתאם להוראות היצרן. 7. שיטת הדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד פתח את תוכנת ההדמיה ברזולוציית-על וכייל את התוכנה בהתאם להנחיות היצרן. כייל את ציוד ההדמיה ברזולוציית-על בהתאם להנחיות היצרן תוך שימוש חרוזים פלואורסצנטיים. להרכיב את מאגר ההדמיה מדגם מן המניות רק לפני ההדמיה על ידי שילוב של 50 μl של 1 M MEA ו 100 μl של 10x Gloxy כדי 850 μl של מאגר מלאי. שמור חיץ הדמיה על קרח למשך הניסוי. הסר כיסוי מוכן עם מדגם ממאגר האחסון שלו ולשטוף אותו 5x על ידי טבילת אותו בעגלה של מים אולטרה. יבש את פני הכיסוי הלא פעילים תוך שימוש בנייר סינון ללא אבק. הקפד לא לגעת בפנים הפעילות. הכנס למחזיק דגימת מערכת דימות והוסף 250 מיקרומטר של מאגר דימות למחזיק הדגימה. סביר להחליף את מאגר ההדמיה במדגם כל שעתיים כדי לשמור על תוצאות עקביות. מכסים את מחזיק הדגימה בפרפילם כדי להפחית את האינטראקציה האטמוספרית עם סביבת החדר. הנח את מחזיק הדגימה בציוד ההדמיה להדמיה. הכניסו את הדגימה למיקוד תוך ניצול הוראות היצרן. תמונה המדגם על פי טכניקת רזולוציית העל בשימוש. הקפד להתאים את תנאי ההדמיה כדי למטב את האות תוך הפחתת הפעלות בו-זמניות של פלואורופורים הניתנים להחלפה בתמונה.הערה חשובה: תנאי ההדמיה תלויים במדגם ומשתנים בהתאם לצורך הניסיוני. ניסוי טיפוסי ניצול Alexa 647 אותחל ביעילות למצב הכהה שלהם במאגר ההדמיה לאחר מכן ניתן להפעיל צילום באמצעות יישום של 405 ננומטר אור UV. תמונות מתקבלות על ידי תת קבוצה דלילה מרגשת של מולקולות Alexa 647 בתוך מדגם שכותרתו בצפיפות לוקליזציה כל פלואורופור עם דיוק מוגבל בעיקר על ידי מספר הפוטונים שנאספו. הליך זה חוזר על כך שוב ושוב על-ידי התוכנה עד להתרחשות מספר רצוי של מחזורי רכישה. הנסיין צריך הגדרה זו לתאם עם כל פלואורופור במדגם לאחר מולבן צילום. לאחר השלמת ההדמיה, כבה את ציוד ההדמיה בהתאם להנחיות היצרן. ייתכן שהתוכנה תישאר פתוחה לניתוח נתונים. ניתוח נתונים תלוי במידה רבה בניסוי; עם זאת, בכל המקרים לזהות וירוסים על ידי רוחב מלא שלהם בחצי מקסימום, אשר מושווה לממדי וירוס ידוע, הקפד לקחת בחשבון את הגודל הנוסף של תוויות פלואורסצנטיות. לקבלת תצוגה חזותית טובה יותר, הצג דוגמאות על-ידי שימוש באפשרות עיבוד Isosurface או באפשרות עיבוד אמצעי האחסון, ששניהם נמצאים בדרך כלל בתוכנת דימות ברזולוציית-על.