1. Preparación química Preparación y almacenamiento de PLL-g-PEG-Biotina y avidina: Disuelva el polímero PLL-g-PEG-biotina en tampón pbs según las instrucciones del fabricante a una concentración de 1,0 mg/ml. Alícuota según el tamaño de la cubierta (véase el cuadro 1) y conservar a -80 °C durante un máximo de un año. Preparación y almacenamiento de Avidin/NeutrAvidin Disuelva el Avidin/NeutrAvidin sin etiquetar en el almacenador intermediario de PBS según las instrucciones del fabricante en una concentración de 1.0 mg/ml. Alícuota según el tamaño de la cubierta (ver Tabla 1)y almacenar a -20 °C durante un máximo de 3 años. Preparación de muestras de virus: Prepare muestras de virus de acuerdo con la necesidad experimental y el protocolo de laboratorio antes de este ensayo. Utilice el paso 1.3.1 para el método 5A, o 1.3.2 para el método 5B. Prepare muestras de virus para el método 5A antes de la etapa 2. Utilice muestras virales preparadas dentro de los 1-2 días de la preparación, o alícuota de acuerdo con el tamaño del resbalón de la cubierta (ver Tabla 1)luego congele en nitrógeno líquido y almacene a -80 °C durante un máximo de un año. Cuando se descongele, use inmediatamente. Prepare muestras de virus para el método 5B similar a 1.3.1. Descongelar las alícuotas del virus antes de 5B y almacenar a 4 °C no más de 24 horas antes de mezclarlas con anticuerpos. Prepare los anticuerpos biotinilados apropiados para el experimento. 2. Limpieza de cubrebocas en preparación para el tratamiento químico Coloque los cubrebocas en un estante de cubrebocas de teflón de tamaño adecuado que los sostenga en una orientación vertical y sumerjalos en un beaker lleno de alcohol etílico filtrado (0.2 μm) (prueba de 190). Sonicar las tapas en el alcohol etílico filtrado (prueba de 190) durante 30 min. Retire los cubrebocas del alcohol y enjuague los cubrebocas extensivamente con agua ultrapura. Coloque los cubrebocas enjuagados en un estante de teflón limpio separado y un casto lleno de NaOH de 1 M. Sonicar los cubrebocas en el NaOH 1 M durante 30 min. Retire los cubrebocas de NaOH y enjuáguelos extensivamente con agua ultrapura. Seque las cubiertas enjuagadas con una corriente de nitrógeno y colóquelas en un estante de teflón limpio y seco. Inspeccione las cubiertas en busca de cualquier película visible o partículas que permanezcan en la cubierta. Si queda algún material visible, el cubrebocas no se ha limpiado y enjuagado adecuadamente. Si no se limpia correctamente, repita los pasos 2.1-2.7. Limpie las tapas con oxígeno-plasma durante 2 min. Este paso es opcional pero se recomienda. 3. Formación de la capa de película delgada PLL-g-PEG Inmediatamente después de secar en la corriente de nitrógeno (o el plasma de oxígeno opcional), coloque una cubiertalip horizontalmente en una placa de Petri estéril. Pipeteo en el centro de la cubierta una cantidad adecuada de PBS descongelado tamponado PLL-g-PEG-biotina (ver Tabla 1). Coloque otra cubierta limpiada encima del líquido en un método de sándwich. Nótese que este método consiste en hacer que dos cubrebocas incuben sus películas químicas orientando sus “caras activas” tratadas químicamente unas hacia otras, separadas solo por la capa química actual. Asegúrese de que haya suficiente fluido de tal manera que el volumen entre las dos cubiertas esté completamente lleno de líquido, pero que ningún fluido se escape de entre las cubiertas (ver Tabla 1). La “cara activa” en adelante designa caras de cubrebocas que han estado en contacto con el fluido en la configuración del sándwich. Coloque la tapa de la placa de Petri sobre el sándwich de cubrebocas e incube en RT durante 45-60 min. Retire la tapa de la placa de Petri y recoja el sándwich con un par de pinzas. Tenga cuidado de no pellizcar el exceso de líquido. Use el pulgar y el dedo índice para pellizcar el sándwich ligeramente y deslice las cubiertas en direcciones opuestas horizontalmente con respecto a la otra, luego separe las dos cubiertas una de la otra sin tocar las caras activas. Enjuague ambas caras activas con agua ultrapura pipeteando 25 ml de agua ultrapura sobre la cara activa 2-4x, y luego seque las cubiertas con una corriente de nitrógeno. Asegúrese de anotar qué caras de cubrebocas están activas. Utilice los cubrebocas inmediatamente, o almacene O / N con el activo boca arriba en una placa de Petri estéril colocada en un ambiente libre de polvo y baja humedad. 4. Mejora de unión de Avidin Coloque una cubierta tratada con PLL-g-PEG con activo boca arriba en una placa de Petri estéril. Pipetear una cantidad adecuada de avidina descongelada en el tampón (preparado en el paso 1.2) en la mitad de la cara activa. Coloque otra cubierta (cara activa hacia abajo) encima del líquido en el método de sándwich. Tenga en cuenta la cara activa de los cubrebocas. Es importante que las caras activas estén en contacto con el líquido durante la incubación (ver paso 3.2). Coloque la tapa de la placa de Petri sobre el sándwich coverslip e incube en RT durante 25-30 min. Retire la tapa de la placa de Petri y separe las dos cubiertas como se describe en el paso 3.4, asegurándose de realizar un seguimiento y no tocar las caras activas. Enjuague ambas caras activas con agua ultrapura pipeteando 25 ml de agua ultrapura sobre la cara activa 2-4x y luego seque las cubiertas con una corriente de nitrógeno. Tenga en cuenta la cara activa de los cubrebocas. Utilícese inmediatamente para la siguiente etapa. NOTA IMPORTANTE: Hay dos métodos distintos para completar la preparación de la muestra dependiendo del tipo de ensayo que el experimento implica. El experimentador debe continuar con la etapa 5A en la que el virus se ancla al vidrio antes de que se agregue cualquier tratamiento adicional con anticuerpos requerido para obtener imágenes de súper resolución. 5B describe un método alternativo para etiquetar el virus en solución antes de anclarlo al vidrio. Los datos representativos en este manuscrito se preparan utilizando 5A. Se debe seleccionar un método apropiado de acuerdo con el tipo de ensayo experimental. 5A. Atado activo del anticuerpo de la cara Inmediatamente después de secar con una corriente de nitrógeno en la etapa 4.6, coloque una cubierta tratada con avidina activa boca arriba en una placa de Petri estéril. Pipetear una cantidad adecuada de anticuerpo biotinilado descongelado en tampón en la mitad de la cara activa (ver Tabla 1). Coloque otra cubierta (cara activa hacia abajo) encima del líquido en un método de sándwich. Tenga en cuenta la cara activa de las cubiertas, es importante que las caras activas estén en contacto con el líquido para la incubación (ver paso 3.2.). Coloque la tapa de la placa de Petri sobre el sándwich de cubrebocas e incube en RT durante 45-60 min. Retire la tapa de la placa de Petri y separe las dos cubiertas como se describe en el paso 3.4, asegurándose de realizar un seguimiento y no tocar las caras activas. Enjuague ambas caras activas con PBS pipeteando 25 ml de PBS sobre la cara activa 2-4x, no seque y use inmediatamente. Asegúrese de realizar un seguimiento de qué caras de cubrebocas están activas. Coloque un cubrebocas de anticuerpos tratados con la cara en una placa de Petri estéril y pipetee una cantidad adecuada de virus descongelado en el tampón en el centro de la cara activa. Coloque otra cubierta (cara activa hacia abajo) encima del líquido en un método de sándwich. Obsévense la cara activa, ya que es importante que las caras activas estén en contacto con el líquido para la incubación (véase el paso 3.2.). Coloque la tapa de la placa de Petri sobre el sándwich de cubrebocas e incube en RT durante 45-60 min. Retire la tapa de la placa de Petri y separe las dos cubiertas como se describe en el paso 3.4, asegurándose de realizar un seguimiento y no tocar las caras activas. Enjuague ambas caras activas con PBS pipeteando 25 ml de PBS sobre la cara activa 2-4x. No seque los cubrebocas, en su lugar colóquelos en un estante de teflón y un casto lleno de PBS inmediatamente. Asegúrese de realizar un seguimiento de qué caras de cubrebocas están activas. Utilice las muestras preparadas inmediatamente o guárdelo en un tampón apropiado a 4 °C durante un máximo de tres días sin pérdida significativa de integridad.NOTA importante: Si las muestras se van a utilizar en un ensayo de AFM, la preparación está completa y pueden utilizarse inmediatamente o almacenarse como se describe en el paso 5A.20 – 5A.21. Si las muestras se van a utilizar en un ensayo de imágenes de fluorescencia de súper resolución, proceda al etiquetado de anticuerpos descrito en los pasos 5A.12 – 5A.19. Coloque ambos cubrebocas tratadas con virus activos boca arriba en una placa de Petri estéril y pipetee suficiente tampón de bloqueo de proteínas en los cubrebocas para obtener suficiente volumen de líquido para cubrir el 95% central del cubrebocas sin que fluya ningún tampón de bloqueo del cubrebocas (típicamente 100 – 200 μl). Incubar en RT durante 60-90 min. Retire cuidadosamente el tampón de bloqueo eliminando los cubrebocas de uno en uno de la placa de Petri y vertiendo el líquido del cubrebocas en un casto de residuos. Tenga cuidado de no dejar caer el cubrebocas. Enjuague ambas caras activas con PBS pipeteando 25 ml de PBS sobre la cara activa 2-4x, no seque y use inmediatamente. Asegúrese de realizar un seguimiento de qué caras de cubrebocas están activas. Coloque un solo tampón de bloqueo tratado con cubrebocas activo boca arriba en una placa de Petri estéril, y pipetee una cantidad adecuada de anticuerpo viral marcado fluorescentemente en el tampón en el centro de la cara activa. Coloque otra tapa (cara activa hacia abajo) encima del líquido en un método de sándwich. Tenga en cuenta qué cara está activa, es importante que las caras activas estén en contacto con el líquido para la incubación (ver paso 3.2). Coloque la tapa de la placa de Petri sobre el sándwich de cubrebocas e incube en RT durante 30 min. Retire la tapa de la placa de Petri y separe las dos cubiertas como se describe en el paso 3.4, asegurándose de realizar un seguimiento y no tocar las caras activas. Enjuague ambas caras activas con PBS pipeteando 25 ml de PBS sobre la cara activa 2-4x, no seque y use inmediatamente. Asegúrese de realizar un seguimiento de qué caras de cubrebocas están activas. No seque los cubrebocas, sino que colóquelos en un estante de teflón dentro de un beaker lleno de PBS. Asegúrese de realizar un seguimiento de qué caras de cubrebocas están activas. Utilice las muestras preparadas inmediatamente o guárdelo en un tampón apropiado a 4 °C durante un máximo de tres días sin pérdida significativa de integridad. 5B. Ataque de anticuerpos en solución Este método es una mejora opcional de la estrategia de etiquetado para la proyección de imagen fluorescente de la super-resolución. Mediante la aplicación del ataque en solución, se puede lograr un mejor recubrimiento de anticuerpos en la superficie viral. Mezclar soluciones de anticuerpos en proporciones de acuerdo con la necesidad de experimentos. La proporción del ejemplo 1:4 de 0,01 mg/ml de anticuerpos biotinilados a 0,01 mg/ml de anticuerpos marcados con fluorescente dará una buena afinidad de unión y permitirá una buena recuperación de la envoltura en un ensayo de imágenes de súper resolución. Mezclar porciones iguales de las soluciones de anticuerpos y virus preparadas respectivamente en (5B.1) y (1.3). Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo un par de veces en la alícuota. Esta solución resultante se puede almacenar hasta que sea necesario durante un hasta 24 horas a 4 °C. Al finalizar el paso 4.6, coloque una cubierta tratada con avidina con activa boca arriba en una placa de Petri estéril. Pipetear una cantidad adecuada de virus con solución de anticuerpos (preparada en el paso 5B.2) en la mitad de la cara activa. Coloque otra cubierta (cara activa hacia abajo) encima del líquido en un método de sándwich. Tenga en cuenta la cara activa, ya que es importante que las caras activas estén en contacto con el líquido para la incubación (ver paso 3.2). Coloque la tapa de la placa de Petri sobre el sándwich de cubrebocas e incube en RT durante 45-60 min. Retire la tapa de la placa de Petri y separe las dos cubiertas como se describe en el paso 3.4, asegurándose de realizar un seguimiento y no tocar las caras activas. Enjuague ambas caras activas con PBS pipeteando 25 ml de PBS sobre la cara activa 2-4x. No seque los cubrebocas, en su lugar colóquelos en un estante de teflón y un casto lleno de PBS inmediatamente. Asegúrese de realizar un seguimiento de qué caras de cubrebocas están activas. Utilice las muestras preparadas inmediatamente o guárdelo a 4 °C durante un máximo de tres días sin pérdida significativa de integridad. 6. Medición de la propiedad del material de microscopía de fuerza atómica Encienda los láseres AFM y abra el software AFM. Seleccione el modo de escaneo apropiado para el ensayo deseado en el cuadro de diálogo de apertura. Todas las ventanas necesarias deben abrirse de forma predeterminada; si no consulta el manual de usuario para abrir las ventanas deseadas. Seleccione un voladizo apropiado para la medición deseada e insértelo en la carcasa del voladizo de acuerdo con las directrices del fabricante. Hay una amplia gama de condiciones y tipos de experimentos para los que hay una variedad de voladizos. El experimentador debe investigar voladizos de acuerdo a su necesidad. Inserte la carcasa en voladizo en el cabezal AFM de acuerdo con las directrices del fabricante. Si la muestra se va a utilizar en condiciones húmedas, retire la muestra del búfer de almacenamiento y continúe con el paso 6.7. Si la muestra se va a utilizar en condiciones ambientales (secas), retire la muestra de su tampón de almacenamiento y enjuáguela brevemente sumergiendo en un castor de agua ultrapura. Nota: Esto dejará una capa de hidratación delgada en la muestra que puede inducir atracción capilar con voladizos que tienen una constante de resorte bajo. Si la muestra se va a utilizar en condiciones ambientales (secas), seque suavemente la muestra con una corriente de nitrógeno. Seque suavemente la parte posterior de la tapa con un papel de filtro libre de polvo, asegurándose de no tocar la cara activa de la muestra. Coloque la muestra en el soporte de muestra AFM apropiado, luego coloque la muestra en la etapa AFM. Si la muestra se va a tomar una imagen en condiciones húmedas, pipetee una pequeña cantidad de tampón en el centro de la muestra (~ 10 μl). Coloque el cabezal AFM sobre la muestra. Si la muestra está húmeda, asegúrese de que el voladizo y la punta AFM penetren en la capa superficial y que no haya burbujas entre la carcasa en voladizo y en voladizo. Alinee el láser AFM con el voladizo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para obtener la señal óptima. Mida la frecuencia resonante en voladizo y establezca la frecuencia de exploración según el tipo de experimento. Baje la punta AFM a la superficie y optimice la configuración de la señal. Realice un escaneo AFM cuadrado de 20 μm en el modo que elija. Se utilizó el modo Tapping (AC) para generar datos representativos. Identifique a los candidatos a virus por una altura aproximada, que normalmente se puede ver como picos agudos en la superficie del vidrio. Seleccione un candidato a virus y centre el cabezal de escaneo encima de él. Realice una exploración cuadrada de 250 nanómetro (o una exploración apropiada de la super-resolución) sobre el virus seleccionado para obtener su topología y orientación. Seleccione un punto en el virus para la medición de la propiedad del material(por ejemplo, el centro de un virus esférico para la medición del módulo de Young) y realice la medición de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 7. Método de imágenes de súper resolución Abra el software de imágenes de súper resolución y calibre el software de acuerdo con las directrices del fabricante. Calibre el equipo de imágenes de súper resolución de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando perlas fluorescentes. Monte el tampón de imágenes de muestras de las existencias justo antes de la toma de imágenes combinando 50 μl de 1 M MEA y 100 μl de 10x Gloxy a 850 μl de tampón de stock. Mantenga el tampón de imágenes en el hielo durante la duración del experimento. Retire un cubrebocas preparado con muestra de su tampón de almacenamiento y enjuáguelo 5x sumergiéndolo en un castor de agua ultrapura. Seque la cara de la cubierta no activa utilizando un papel de filtro libre de polvo. Asegúrese de no tocar la cara activa. Inserte en un soporte de muestra del sistema de imágenes y agregue 250 μl de tampón de imágenes al soporte de la muestra. Es razonable intercambiar el tampón de imágenes en la muestra cada 2 horas para mantener resultados consistentes. Cubra el soporte de la muestra con parafilm para disminuir la interacción atmosférica con el entorno de la habitación. Coloque el soporte de la muestra en el equipo de imágenes para la toma de imágenes. Ponga la muestra en foco utilizando las instrucciones del fabricante. Imagen de la muestra de acuerdo con la técnica de super-resolución que se está empleando. Asegúrese de ajustar las condiciones de imagen para optimizar la señal mientras disminuye las activaciones simultáneas de fluoróforos foto-conmutables.NOTA IMPORTANTE: Las condiciones de la proyección de imagen son dependientes de la muestra y varían según necesidad experimental. Un experimento típico que utiliza Alexa 647 inicializada de manera eficiente en su estado oscuro en el búfer de imágenes puede ser fotoactivo a través de la aplicación de luz UV de 405 nm. Las imágenes se obtienen excitando un subconjunto escaso de moléculas de Alexa 647 dentro de una muestra densamente etiquetada y localizando cada fluoróforo con una precisión limitada principalmente por el número de fotones recogidos. Este procedimiento es iterado repetidamente por el software hasta que se ha producido un número deseado de ciclos de adquisición. El experimentador debe hacer que este ajuste se correlacione con cada fluoróforo de la muestra que ha sido fotoblanqueado. Cuando se complete la toma de imágenes, apague el equipo de imágenes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El software puede dejarse abierto para el análisis de datos. El análisis de datos depende en gran medida del experimento; sin embargo, en todos los casos identificar los virus por su ancho completo a la mitad máximo, que se compara con las dimensiones conocidas del virus, asegurándose de tener en cuenta el tamaño adicional de las etiquetas fluorescentes. Para una mejor visualización, vea las muestras utilizando la opción de representación de isosuperficie o la opción de representación volumétrica, que normalmente se encuentran en el software de imágenes de súper resolución.