표면에 비리온의 부착은 슈퍼 해상도 형광 화상 진찰 또는 원자력 현미경 검사법 (AFM)에 의한 단일 virion 화상 진찰을 위한 요구 사항입니다. 여기서 우리는 AFM 및 초분해능 형광 이미징에 사용하기에 적합한 유리 표면에 대한 비온의 제어 접착을 위한 샘플 준비 방법을 시연한다.
유리 표면에 비온의 고정은 단일 virion 이미징에서 중요한 단계입니다. 여기서 우리는 특이성을 가진 유리 표면에 단 하나 비약의 접착을 허용하는 단 하나 분자 화상 진찰 소사에서 채택된 기술을 제시합니다. 이러한 제제는 PLL-g-PEG 와 PLL-g-PEG-Biotin의 혼합물로 유리 표면을 접목하고, 아비딘층을 추가하고, 마지막으로 생체화 바이러스 특이적 항체의 부착을 통해 비리온 앵커를 만드는 것을 기반으로 한다. 우리는 원자력 현미경 검사법 (AFM) 및 초해상도 형광 화상 진찰을 포함하여 실험의 범위에 이 기술을 적용했습니다. 이 샘플 준비 방법은 표면에 대한 비온의 제어 접착을 초래한다.
충전 기반비특이적 상호 작용은 원자력 현미경검사법 1,2에서비온의 유착을 위해 일상적으로 사용된다. 이러한 기술은 매우 뻣뻣한 캡시드3-6과비 봉투 된 virions에 사용할 때 특히 잘 작동합니다. 이러한 기술은 시료를 고정하는 데 매우 효과적이지만 표면에 단백질의 비특이적 결합을 방지하지는 않습니다. 비특이적 결합은 다양한 항체를 가진 견본의 잠양을 요구하는 AFM 및 초해상도 형광 기술로 virions를 심상시도하는 때 문제를 만들 수 있습니다. 여기서 우리는 virions의 특정 고정을위한 샘플 준비 방법을 설명합니다.
폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)는 폴리(L-lysine)(PLL)에 접목되어 유리 표면에 흡착되어 유리7을가진 단백질의 정전기 상호작용을 위한 중요한 블록을 제공한다. 유리 표면에 단일 분자의 고정화를 필요로 하는 단일 분자 소는 이 특성을 이용하고 특정 PEG 기반 단일 분자 고정 기술을 만드는 데 사용되었다8-10. 이러한 제제는 또한 유리표면(11)에 클래트린 케이지를 고정하고 대조군 세포 접착을위한 균질성 섬유네틴 코팅을 만드는 데 사용되었다.
단일 분자 이미징 방법론으로부터 유리 표면에 PLL-g-PEG 흡착에 기초한 샘플 준비 방법을 채택하고 이를 VEsicular 구내염 바이러스(VSV)의 단일 바이러스 를 이미징하는 데 적용했습니다. 이 단 하나 virions는 원자력 현미경 검사법 (AFM)를 사용하여 이미지되었다. 기능성 구슬에서도 대조군으로 유사한 실험이 수행되었다. 바이러스는 또한 알렉사 647로 표지된 VSV-G 항체가 단일 바이러스의 봉투의 이미지를 생성하는 데 사용되었다는 초해상도 형광 현미경 검사법에 의해 이미지되었다. 고분해능 형광 화상 진찰은 단일 분자의 국소화를 활용하여 이미지13-15를생성한다. fPALM 쌍면 이미징은 평면에서 20 nm와 광학 축15,16을따라 50 nm 해상도로 단일 분자의 국소화를 허용합니다. 이 쌍층 기술은 이 연구에 존재하는 초해상도 형광 심상을 이미지하기 위하여 이용되었습니다. 비슷한 결과를 가지고 다른 기술은 STORM13,17,18입니다.
이 논문에 설명된 절차에 의해 유리에 고정된 VSV의 AFM 및 초해상도 형광 이미지 모두 최소 비특이적 상호작용(19)을사용하여 유리에 대한 특이적 결합을 보였다. 여기서 우리는 AFM 및 초해상도 형광 화상 진찰 실험을 위한 견본 준비 프로토콜을 제시합니다. 요약: 클린 글래스 커버립은 PLL-g-PEG와 PLL-g-PEG-비오틴의 혼합물을 흡착하여 기능화됩니다. 이 박막은 코팅 된 표면에 15-25 % 기능성 비오틴을 제공하도록 설계되는 것이 일반적입니다. 커버립은 테트라메릭 아비딘으로 더 배양됩니다. 생체화 바이러스 항체는 그 때 virions를 위한 유일한 결합 사이트를 만드는 데 이용됩니다. 항체의 결합은 두 가지 방법으로 수행 될 수있다.
첫 번째 방법은 AFM에 최적화되어 있지만 초해상도 형광 이미징에 적합합니다. 이 방법에서 아비딘 코팅 표면은 바이러스 성 접착 전에 생체 개화 항체로 처리된다. 고정 된 virions는 봉투를 커버하고 바이러스의 초해상도 형광 이미징을 허용하기 위해 Alexa 647 표지 된 항체로 처리됩니다.
두 번째 방법은 아비딘 처리된 표면에 바이러스를 부착하기 전에 생체화 항체 및 Alexa 647 표지항체를 사용하여 용액에서 바이러스를 공격하는 것이다. 이 방법은 바이러스 봉투의 회복이 중요한 초해상도 형광 화상 진찰 실험에 최적화되어 있습니다. 이 방법은 바이러스 성 표면에 균일 한 항체 코팅을 허용하는 장점이 있다. 상기 생체화 항체는 바이러스 봉투의 외부에 높은 농도의 형광 라벨을 유지하면서 아비딘 처리된 표면에 바이러스의 충분한 흡착을 허용하는 비율로 Alexa 647 표지된 바이러스 항체와 혼합될 수 있다. 이러한 Alexa 647 표지 된 바이러스 성 항체는 생체 화되지 않으며 그들의 과잉은 배경 소음을 줄이기 위해 멀리 씻어 수 있습니다.
AFM 및 고해상도 형광 이미징을 사용한 단일 비리온 이미징은 CryoEM 단층 촬영의 대체 방법론으로 사용될 수 있습니다. 이러한 방법론의 각각은 특정 강점을 가지고 있습니다. 예를 들어 AFM은 샘플 또는 내부 바이러스 성 단백질에 태그를 지정할 필요없이 WT virions에서 수행 할 수 있습니다. 바이러스 구조의 위치는 비리온의 탄성 특성에 대한 기여에서 감소된다.
새로 개발된 바이러스 성 역 유전 접근법과 결합된 단일 비리온 슈퍼 해상도 이미징은 낮은 카피 수 바이러스 성단백질(20)을국소화하는 강력한 기술이 된다. 형광 단백질에 융합된 단백질과 단백질을 대체하는 재조합 바이러스는 이러한 역유전적 접근법을 사용하여 만들고 정제할 수 있다. 초해상도 화상 진찰은 유전 태깅 때문에 부분적으로 특이성을 가지고 있지만, 돌연변이 바이러스의 사용을 요구합니다.
AFM 및 초해상도 이미징은 매우 유사한 샘플 제제를 활용하는 무료 방법입니다. 이 논문에 설명된 방법은, 이전 단일 분자 화상 진찰 소사 양식을 채택하는, virions의 토폴로지에 거의 효력을 가진 단 하나 바이러스의 고정을 허용합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 원래 단일 분자 준비 프로토콜에 대한 박사 틸 뵈킹 감사합니다. 이 작업은 NSF 교부금 1121972(SS)에 의해 지원되었습니다.
Glass coverslips (fPALM) | Electron Microscopy Services | 72225-01 | 25 mm Coverslips |
PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | SuSoS | – | Stock: 0.5 mg/ml in PBS |
NeutrAvidin biotin-binding protein | Invitrogen | A2666 | Stock: 0.25 mg/ml in PBS |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21245 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
α-VSV-G | Invitrogen | ab34774 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
Gluox | Sigma | G2133-250KU | Glucose oxidase type seven from Aspergillius |
Catalase | Sigma | C40-100mg | Catalase from Bovine liver |
MEA | Sigma | 30070-10G | Cysteamine (MEA |
Stock Buffer | 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose | ||
NTE | 10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA | ||
Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit | Thermo Scientific | 10,000 MW | |
Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1 | Fisherbrand | 35 CIRCLE #1 |