1. Химия Подготовка Подготовка и хранение PLL-g-PEG-биотина и алдин: Растворите полимер PLL-g-PEG-биотин в буфере PBS в соответствии с указаниями производителя при концентрации 1,0 мг/мл. Aliquot в соответствии с размером крышки (см. таблицу 1) и хранить при -80 градусов по Цельсию на срок до одного года. Подготовка и хранение Avidin/NeutrAvidin Растворите неотсвятный Avidin/NeutrAvidin в буфере PBS в соответствии с указаниями производителя при концентрации 1,0 мг/мл. Aliquot в соответствии с размером крышки (см. таблицу 1) и хранить при -20 градусов по Цельсию на срок до 3 лет. Подготовка образца вируса: Подготовка образцов вируса в соответствии с экспериментальной потребностью и лабораторным протоколом до этого анализа. Используйте шаг 1.3.1 для метода 5A, или 1.3.2 для метода 5B. Подготовка образцов вируса для метода 5A до 2-го этапа. Используйте подготовленные вирусные образцы в течение 1-2 дней после приготовления, или aliquot в соответствии с размером покрытия скольжения (см. таблицу 1), затем вспышки заморозить в жидком азоте и хранить при -80 градусов по Цельсию на срок до одного года. Когда оттаяет, немедленно используйте. Подготовка образцов вируса для метода 5B, аналогичного 1.3.1. Оттепель aliquots вируса до 5B и хранить при 4 КК не более 24 часов до смешивания с антителами. Подготовье соответствующих биотинилированных антител для эксперимента. 2. Очистка крышки в рамках подготовки к химической обработке Поместите крышки в соответствующую по размеру стойку тефлонового покрытия, которая удерживает их в вертикальной ориентации и погружает в стакан, наполненный фильтрованным (0,2 мкм) этилового спирта (190 доказательств). Sonicate coverslips в фильтрованного этилового спирта (190 доказательство) в течение 30 мин. Удалить coverslips от алкоголя и промыть coverslips широко с ультрачистой водой. Поместите промытые крышки в отдельную чистую тефлоновую стойку и стакан, наполненный 1 M NaOH. Sonicate крышки в 1 M NaOH в течение 30 мин. Удалите крышки из NaOH и широко промойте их ультрачистой водой. Высушите промытые крышки азотным потоком и поместите их в чистую сухую тефлоновую стойку. Осмотрите крышки для любой видимой пленки или частиц, которые остаются на крышке. Если какой-либо видимый материал остается, крышки не были должным образом очищены и промыты. Если не правильно очистить повторные шаги 2.1-2.7. Очистите крышки кислородно-плазмой в течение 2 мин. Этот шаг является необязательным, но рекомендуется. 3. Формирование тонкого слоя пленки PLL-g-PEG Сразу после высыхания в потоке азота (или дополнительной кислородно-плазменной), поместите один крышку горизонтально в стерильную чашку Петри. Pipet в центре крышки соответствующее количество оттаялого PBS буферных PLL-g-PEG-биотин (см. таблицу 1). Поместите еще один очищенный крышки на вершине жидкости в сэндвич метод. Обратите внимание, что этот метод состоит из двух coverslips инкубировать свои химические пленки, ориентируя их химически обработанных “активных лиц” друг к другу, разделенных только текущим химическим слоем. Убедитесь, что существует достаточно жидкости, так что объем между двумя крышками полностью заполнен жидкостью, но что нет утечки жидкости между крышками (см. таблицу 1). “Активное лицо” отныне обозначает крышки лица, которые были в контакте с жидкостью в конфигурации бутерброда. Поместите крышку чашки Петри на сэндвич с крышкой и инкубировать на RT в течение 45-60 мин. Снимите крышку чашки Петри и возьмите бутерброд с парой пинцетов. Будьте осторожны, чтобы не ущипнуть избыток жидкости. Используйте большой и указательный пальцы, чтобы слегка ущипнуть сэндвич и сдвиньте крышки в противоположных направлениях горизонтально по отношению друг к другу, а затем отделить две крышки друг от друга, не касаясь активных лиц. Промыть оба активных лица с ультрачистой водой путем трубопроводов 25 мл ультрапурной воды над активным лицом 2-4x, а затем высушить крышки с потоком азота. Не забудьте отметить, какие лица обложки активны. Используйте крышки немедленно, или хранить O / N с активным лицом вверх в стерильной чашке Петри помещены в свободной от пыли низкой влажности окружающей среды. 4. Avidin Связывание Повышение Поместите обработанный крышку PLL-g-PEG с активным лицом вверх в стерильную чашку Петри. Pipette соответствующее количество разморожевания avidin в буфере (подготовлен в шаге 1.2) на середину активного лица. Поместите другой крышку (активное лицо вниз) на вершине жидкости в сэндвич метод. Обратите внимание на активное лицо крышки. Важно, чтобы активные лица соего контакта с жидкостью во время инкубации (см. шаг 3.2). Поместите крышку чашки Петри на сэндвич с крышкой и инкубировать в RT в течение 25-30 мин. Снимите крышку чашки Петри и разделте две крышки, описанные в шаге 3.4, убедившись, что отслеживать и не прикасаться к активным лицам. Промыть оба активных лица с ультрапурной водой, трубя 25 мл ультрапурной воды над активным лицом 2-4x, а затем высушить крышки с потоком азота. Обратите внимание на активное лицо крышки. Используйте немедленно для следующего этапа. IMPORTANT ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют два различных метода для завершения подготовки образца в зависимости от типа анализа эксперимента влечет за собой. Экспериментатор должен приступить к этапу 5A, в котором вирус закреплен на стекле, прежде чем какие-либо дополнительные антитела лечения, необходимые для супер-разрешение изображения добавляется. 5B описывает альтернативный метод маркировки вируса в растворе, прежде чем присев его на стекло. Репрезентативные данные в этой рукописи готовятся с использованием 5A. Соответствующий метод должен быть выбран в соответствии с экспериментальным типом анализа. 5A. Активный антитела лица Tether Сразу после высыхания азотным потоком на стадии 4.6 поместите алдин обработанный крышку активным лицом вверх в стерильную чашку Петри. Pipette соответствующее количество оттаялого биотинилированного антитела в буфере на середину активного лица (см. таблицу 1). Поместите другой крышку (активное лицо вниз) на вершине жидкости в сэндвич метод. Обратите внимание на активное лицо крышки, важно, чтобы активные лица находятся в контакте с жидкостью для инкубации (см. шаг 3.2.). Поместите крышку чашки Петри на сэндвич с крышкой и инкубировать на RT в течение 45-60 мин. Снимите крышку чашки Петри и разделте две крышки, описанные в шаге 3.4, убедившись, что отслеживать и не прикасаться к активным лицам. Промыть оба активных лица с PBS путем пипетки 25 мл PBS над активным лицом 2-4x, не высыхают и использовать немедленно. Обязательно следите за тем, какие лица обложки активны. Поместите антитела лечение coverslip активное лицо в стерильной чашке Петри, и пипетки соответствующее количество оттаялого вируса в буфер на середину активного лица. Поместите другой крышку (активное лицо вниз) на вершине жидкости в сэндвич метод. Обратите внимание на активное лицо, так как важно, чтобы активные лица со контактом с жидкостью для инкубации (см. шаг 3.2.). Поместите крышку чашки Петри на сэндвич с крышкой и инкубировать на RT в течение 45-60 мин. Снимите крышку чашки Петри и разделте две крышки, описанные в шаге 3.4, убедившись, что отслеживать и не прикасаться к активным лицам. Промыть оба активных лица с PBS путем трубопроводов 25 мл PBS над активным лицом 2-4x. Не сушите крышки, вместо этого поместите их в тефлоновую стойку и стакан, наполненный PBS немедленно. Обязательно следите за тем, какие лица обложки активны. Немедленно используйте подготовленные образцы или храните в соответствующем буфере при 4 градусах Цельсия в течение трех дней без существенной потери целостности.Важное ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы должны быть использованы в анализе AFM, подготовка завершена, и они могут быть использованы немедленно или храниться, как описано в шаге 5A.20 – 5A.21. Если образцы должны быть использованы в анализе флуоресценции супер-разрешения, переходите к маркировке антител, описанной в шагах 5A.12 – 5A.19. Поместите оба вируса обработанные coverlips активное лицо вверх в стерильной чашке Петри и пипетки достаточно белка блокирования буфера на coverslips шарик достаточно жидкости объем для покрытия центральной 95% крышки без течет любой блокирующий буфер от крышки (как правило, 100 – 200 l.) Инкубация на RT в течение 60-90 мин. Аккуратно удалите блокирующий буфер, удалив крышки по одному из чашки Петри и вылив жидкость из крышки в стакан отходов. Будьте осторожны, чтобы не уронить крышку. Промыть оба активных лица с PBS путем пипетки 25 мл PBS над активным лицом 2-4x, не высыхают и использовать немедленно. Обязательно следите за тем, какие лица обложки активны. Поместите один блокирующий буфер обработанных coverslip активное лицо в стерильной чашке Петри, и пипетка соответствующее количество флуоресцентно помечены вирусные антитела в буфере на середину активного лица. Поместите другой крышкой (активное лицо вниз) сверху жидкости в сэндвич метод. Обратите внимание, какое лицо активно, важно, чтобы активные лица находятся в контакте с жидкостью для инкубации (см. шаг 3.2). Поместите крышку чашки Петри на сэндвич с крышкой и инкубировать на RT в течение 30 минут. Снимите крышку чашки Петри и разделте две крышки, описанные в шаге 3.4, убедившись, что отслеживать и не прикасаться к активным лицам. Промыть оба активных лица с PBS путем пипетки 25 мл PBS над активным лицом 2-4x, не высыхают и использовать немедленно. Обязательно следите за тем, какие лица обложки активны. Не сушите крышки, вместо этого поместите их в тефлоновую стойку в стакане, наполненном PBS. Обязательно следите за тем, какие лица обложки активны. Немедленно используйте подготовленные образцы или храните в соответствующем буфере при 4 градусах Цельсия в течение трех дней без существенной потери целостности. 5Б. В атаке антител решения Этот метод является необязательным усовершенствование стратегии маркировки для супер-разрешения флуоресцентных изображений. Применяя при атаке раствора, лучшее покрытие антител на вирусной поверхности может быть достигнуто. Смешайте антитела решений в соотношении в соответствии с экспериментами нужно. Пример 1:4 соотношение 0,01 мг/мл биотинилированных антител к 0,01 мг/мл флуоресцентно помеченных антител даст хорошее связывающее сродство и позволит хорошее восстановление конверта в супер-разрешение изображения анализа. Смешайте равные части антител и вирусных растворов, соответственно, подготовленных в (5B.1) и (1.3). Смешайте осторожно, трубя вверх и вниз несколько раз в aliquot. Это в результате раствор может храниться до тех пор, пока это необходимо для до 24 часов при 4 градусов по Цельсию. По завершении шага 4.6, поместите avidin обработанные крышки с активным лицом вверх в стерильной чашке Петри. Pipette соответствующее количество вируса с антителом раствор (подготовлен в шаге 5B.2) на середину активного лица. Поместите другой крышку (активное лицо вниз) на вершине жидкости в сэндвич метод. Обратите внимание на активное лицо, так как важно, чтобы активные лица со контактом с жидкостью для инкубации (см. шаг 3.2). Поместите крышку чашки Петри на сэндвич с крышкой и инкубировать на RT в течение 45-60 мин. Снимите крышку чашки Петри и разделте две крышки, описанные в шаге 3.4, убедившись, что отслеживать и не прикасаться к активным лицам. Промыть оба активных лица с PBS путем трубопроводов 25 мл PBS над активным лицом 2-4x. Не сушите крышки, вместо этого поместите их в тефлоновую стойку и стакан, наполненный PBS немедленно. Обязательно следите за тем, какие лица обложки активны. Используйте подготовленные образцы немедленно или храните при 4 градусах Цельсия в течение трех дней без значительной потери целостности. 6. Измерение свойства материалов атомной микроскопии силы Включите лазеры AFM и откройте программное обеспечение AFM. Выберите подходящий режим сканирования для желаемого анализа из диалога открытия. Все необходимые окна должны открываться по умолчанию; если не проконсультируйтесь с руководством пользователя, чтобы открыть нужные окна. Выберите кантилевер, соответствующий желаемому измерению, и вставьте его в корпус кантилевера в соответствии с руководящими принципами производителя. Существует широкий спектр условий и типов экспериментов, для которых существуют различные кантилеверы. Экспериментатор должен исследовать кантилеверы в соответствии с их потребностью. Вставьте корпус кантилевера в голову AFM в соответствии с руководящими принципами производителя. Если образец будет использоваться во влажных условиях, удалите образец из буфера хранения и перейти к шагу 6.7. Если образец будет использоваться в условиях окружающей среды (сухой), удалите образец из буфера хранения и прополощите его, окунув в стакан ультрачистой воды. Примечание: Это оставит тонкий слой гидратации на образец, который может вызвать притяжение капилляров с кантилеверами, имеющих низкую пружинную константу. Если образец будет использоваться в окружающей (сухой) условиях, аккуратно высушите образец потоком азота. Аккуратно высушите заднюю сторону крышки с помощью фильтровальной бумаги без пыли, чтобы не касаться активного лица образца. Поместите образец в соответствующий держатель образца AFM, а затем поместите образец на сцену AFM. Если образец будет изображен во влажных условиях, пипетка небольшое количество буфера на центр образца (No 10 мкл). Поместите головку AFM над образцом. Если образец мокрый, убедитесь, что кантилевер и наконечник AFM проникают в поверхностный слой, и что между кантилевером и кантилевером нет пузырьков. Выравнивание лазера AFM с кантилевером в соответствии с рекомендациями производителя для получения оптимального сигнала. Измерьте резонансную частоту кантилевера и установите частоту сканирования в соответствии с типом эксперимента. Опустите наконечник AFM на поверхность и оптимизируйте настройки сигнала. Выполните сканирование AFM площадью 20 мкм в режиме по вашему выбору. Режим нажатия (ПЕРЕМЕН) использовался при генерации репрезентативных данных. Определите кандидатов вируса по приблизительной высоте, которую обычно можно рассматривать как резкие шипы на поверхности стекла. Выберите кандидата от вируса и центр сканирования голову над ним. Выполните сканирование квадрата 250 нм (или соответствующее сканирование супер-разрешения) о выбранном вирусе, чтобы получить его топологию и ориентацию. Выберите точку на вирусе для измерения свойств материала(например, центр сферического вируса для измерения модула Янга) и выполните измерение в соответствии с указаниями производителя. 7. Метод визуализации супер-разрешения Откройте программное обеспечение для визуализации с супер-разрешением и откалибровайте программное обеспечение в соответствии с руководящими принципами производителя. Калибруйте оборудование для визуализации супер-разрешения в соответствии с указаниями производителя с использованием флуоресцентных бусин. Соберите буфер визуализации образца из запасов непосредственно перед визуализацией, объединив 50 мкл 1 М МЕА и 100 мкл 10x Gloxy до 850 мл запасного буфера. Храните буфер изображения на льду в течение всего эксперимента. Удалите подготовленный крышку с образцом из буфера хранения и промойте его 5x, окунув его в стакан ультрачистой воды. Высушите неактивное лицо крышки, используя фильтровальную бумагу без пыли. Убедитесь в том, чтобы не прикасаться к активному лицу. Вставьте в держатель образца системы визуализации и добавьте 250 мкл буфера изображения к держателю образца. Разумно обмениваться буфером изображения на выборке каждые 2 часа для поддержания последовательных результатов. Обложка образца держателя с парафильмом для уменьшения атмосферного взаимодействия с комнатной средой. Поместите держатель образца в оборудование для визуализации. Сосредоточьте образец, используя направления производителя. Изображение образца в соответствии с используемой техникой супер-разрешения. Обязательно отрегулируйте условия визуализации для оптимизации сигнала при одновременном снижении одновременной активации фотоизменяемых флюорофоров.IMPORTANT ПРИМЕЧАНИЕ: Условия визуализации зависят от образца и варьируются в зависимости от экспериментальной необходимости. Типичный эксперимент с использованием Alexa 647 эффективно инициализированы в их темное состояние в буфере изображения может быть фото-активирована с помощью применения 405 нм УФ-излучения. Изображения получены захватывающим редким подмножеством молекул Alexa 647 в плотно маркированную выборку и локализации каждого флюорофора с точностью, ограниченной главным образом количеством собранных фотонов. Эта процедура неоднократно итерируется программным обеспечением до тех пор, пока не произошло желаемое количество циклов приобретения. Экспериментатор должен иметь эту настройку коррелируют с каждым флюорофор в образце были фото-отбеленные. После завершения визуализации выключите оборудование для визуализации в соответствии с указаниями производителя. Программное обеспечение может быть оставлено открытым для анализа данных. Анализ данных в значительной степени зависит от эксперимента; однако во всех случаях идентифицируют вирусы по их полной ширине в два раза меньше, чем по сравнению с известными размерами вируса, убедившись, что они принимают во внимание дополнительный размер флуоресцентных меток. Для лучшей визуализации, просмотреть образцы, используя либо вариант визуализации Isosurface или опцию объемного рендеринга, оба из которых, как правило, находятся в супер-разрешение изображения программного обеспечения.