1. Preparazione chimica Preparazione e conservazione di PLL-g-PEG-Biotin e avidina: Sciogliere il polimero PLL-g-PEG-biotina nel tampone PBS secondo le indicazioni del produttore ad una concentrazione di 1,0 mg/ml. Aliquota in base alle dimensioni delle copertine (cfr. tabella 1) e conservare a -80 °C per un massimo di un anno. Preparazione e conservazione di Avidin/NeutrAvidin Sciogliere l’Avidin/NeutrAvidin senza etichetta in tampone PBS secondo le indicazioni del produttore ad una concentrazione di 1,0 mg/ml. Aliquota in base alle dimensioni delle copertine (cfr. tabella 1) e conservare a -20 °C per un massimo di 3 anni. Preparazione del campione di virus: Preparare campioni di virus in base alle esigenze sperimentali e al protocollo di laboratorio prima di questo test. Utilizzare il passaggio 1.3.1 per il metodo 5A o 1.3.2 per il metodo 5B. Preparare campioni di virus per il metodo 5A prima della fase 2. Utilizzare campioni virali preparati entro 1-2 giorni dalla preparazione o aliquota in base alle dimensioni dello slittamento di copertura (vedi tabella 1),quindi congelare flash nell’azoto liquido e conservare a -80 °C per un massimo di un anno. Quando viene scongelato, utilizzare immediatamente. Preparare campioni di virus per il metodo 5B simile al 1.3.1. Scongelare le aliquote del virus prima di 5B e conservare a 4 °C non più di 24 ore prima della miscelazione con anticorpi. Preparare anticorpi biotinilati appropriati per l’esperimento. 2. Pulizia delle labbra in preparazione al trattamento chimico Posizionare le copertine in un rack di coprilipani in teflon di dimensioni appropriato che le trattiene in orientamento verticale e immergerle in un bicchiere riempito con alcol etilico filtrato (0,2 μm) (190 prove). Sonicare i coprispagini nell’alcol etilico filtrato (190 prove) per 30 minuti. Rimuovere ampiamente i copripasci dall’alcol e sciacquare ampiamente le coperture con acqua ultrapura. Posizionare le copertine risciacquate in un rack in Teflon pulito separato e un becher riempito con 1 M NaOH. Sonicare i copriparsi nel NaOH da 1 M per 30 minuti. Rimuovere i copripasta da NaOH e sciacquarli ampiamente con acqua ultrapura. Asciugare le coperture risciacquate con un flusso di azoto e posizionarle in un rack in teflon pulito e asciutto. Ispezionare le copertine per eventuali pellicole o particelle visibili che rimangono sulla coverlip. Se rimane materiale visibile, il copripava non è stato adeguatamente pulito e risciacquato. Se non correttamente puliti ripetere i passaggi 2.1-2.7. Pulire le coverlips con ossigeno-plasma per 2 min. Questo passaggio è facoltativo ma consigliato. 3. Formazione dello strato di film sottile PLL-g-PEG Immediatamente dopo l’essiccazione nel flusso di azoto (o nel plasma di ossigeno opzionale), posizionare uno coverslip orizzontalmente in una piastra di Petri sterile. Pipetta al centro del coperchio una quantità appropriata di PLL-g-PEG-biotina tamponata PBS scongelata (vedere tabella 1). Posizionare un altro coverslip pulito in cima al fluido in un metodo sandwich. Si noti che questo metodo consiste nel far incubare due coverlips le loro pellicole chimiche orientando le loro “facce attive” trattate chimicamente l’una verso l’altra, separate solo dall’attuale strato chimico. Assicurarsi che vi sia un fluido sufficiente in modo che il volume tra i due copriparsi sia completamente riempito di liquido, ma che non fuoriesi fluidi tra i copripasci (vedere tabella 1). La “faccia attiva” designa d’ora in poi le facce di copra che sono state a contatto con il fluido nella configurazione sandwich. Posizionare il coperchio della piastra di Petri sul sandwich di coverlip e incubare a RT per 45-60 min. Rimuovere il coperchio della piastra di Petri e prendere il panino con un paio di pinzette. Fare attenzione a non pizzicare il liquido in eccesso. Utilizzare il pollice e l’indice per pizzicare leggermente il sandwich e far scorrere i copripazzi in direzioni opposte orizzontalmente rispetto all’altro, quindi separare i due copripazzi l’uno dall’altro senza toccare le facce attive. Risciacquare entrambe le facce attive con acqua ultrapura con pipettando 25 ml di acqua ultrapura sulla faccia attiva 2-4x, quindi asciugare le coperture con un flusso di azoto. Assicurarsi di notare quali facce di coprilipano sono attive. Utilizzare immediatamente i copripazzi o conservare O/N con la faccia attiva in una piastra di Petri sterile posta in un ambiente privo di polvere e bassa umidità. 4. Miglioramento dell’associazione Avidin Posizionare un coverslip trattato PLL-g-PEG con faccia attiva in una piastra di Petri sterile. Pipetta una quantità appropriata di avidina scongelata nel tampone (preparata nel passaggio 1.2) al centro della faccia attiva. Posizionare un altro coverslip (faccia attiva verso il basso) in cima al fluido nel metodo sandwich. Si noti la faccia attiva dei copripaspa. È importante che le facce attive siano a contatto con il fluido durante l’incubazione (vedere fase 3.2). Posizionare il coperchio della piastra di Petri sul sandwich di coverlip e incubare a RT per 25-30 minuti. Rimuovere il coperchio della piastra di Petri e separare i due copripacchi come descritto al passaggio 3.4, assicurandosi di tenere traccia e non toccare le facce attive. Risciacquare entrambe le facce attive con acqua ultrapura con pipettando 25 ml di acqua ultrapura sulla faccia attiva 2-4x e quindi asciugare i copricapo con un flusso di azoto. Si noti la faccia attiva dei copripaspa. Utilizzare immediatamente per la fase successiva. NOTA IMPORTANTE: Esistono due metodi distinti per completare la preparazione del campione a seconda del tipo di saggio che l’esperimento comporta. Lo sperimentatore deve procedere con lo stadio 5A in cui il virus è ancorato al vetro prima di aggiungere qualsiasi trattamento anticorpale aggiuntivo necessario per l’imaging a super risoluzione. 5B descrive un metodo alternativo per etichettare il virus in soluzione prima di ancorarlo al vetro. I dati rappresentativi di questo manoscritto sono preparati utilizzando il 5A. Un metodo appropriato deve essere selezionato in base al tipo di saggio sperimentale. 5A. Tether anticorpo facciale attivo Immediatamente dopo l’essiccazione con un flusso di azoto nella fase 4.6, posizionare un coverslip trattato con avidina attivo a faccia in su in una piastra di Petri sterile. Pipetta una quantità appropriata di anticorpo biotinilato scongelato in tampone al centro della faccia attiva (vedi tabella 1). Posizionare un altro coverslip (faccia attiva verso il basso) in cima al fluido in un metodo sandwich. Si noti la faccia attiva dei copripaspa, è importante che le facce attive siano a contatto con il fluido per l’incubazione (vedere fase 3.2.). Posizionare il coperchio della piastra di Petri sul sandwich di coverlip e incubare a RT per 45-60 min. Rimuovere il coperchio della piastra di Petri e separare i due copripacchi come descritto al passaggio 3.4, assicurandosi di tenere traccia e non toccare le facce attive. Risciacquare entrambe le facce attive con PBS pipettando 25 ml di PBS sulla faccia attiva 2-4x, non asciugare e utilizzare immediatamente. Assicurarsi di tenere traccia di quali facce di coverlip sono attive. Posizionare un coverslip attivo trattato con anticorpi a faccia in su in una piastra di Petri sterile e pipettare una quantità appropriata di virus scongelato nel tampone al centro della faccia attiva. Posizionare un altro coverslip (faccia attiva verso il basso) in cima al fluido in un metodo sandwich. Si noti la faccia attiva, poiché è importante che le facce attive siano a contatto con il fluido per l’incubazione (vedere fase 3.2.). Posizionare il coperchio della piastra di Petri sul sandwich di coverlip e incubare a RT per 45-60 min. Rimuovere il coperchio della piastra di Petri e separare i due copripacchi come descritto al passaggio 3.4, assicurandosi di tenere traccia e non toccare le facce attive. Risciacquare entrambe le facce attive con PBS tubazionando 25 ml di PBS sulla faccia attiva 2-4x. Non asciugare i copriletti, invece metterli in un rack in teflon e un becher riempito immediatamente con PBS. Assicurarsi di tenere traccia di quali facce di coverlip sono attive. Utilizzare immediatamente i campioni preparati o conservare in un buffer appropriato a 4 °C per un massimo di tre giorni senza perdita significativa di integrità.Nota importante: Se i campioni devono essere utilizzati in un saggio AFM, la preparazione è completa e possono essere utilizzati immediatamente o conservati come descritto nel passaggio 5A.20 – 5A.21. Se i campioni devono essere utilizzati in un saggio di imaging a fluorescenza a super-risoluzione, procedere all’etichettatura degli anticorpi descritta nei passaggi 5A.12 – 5A.19. Posizionare entrambi i coprisci virali attivi a faccia in su in una piastra di Petri sterile e pipettare abbastanza tampone di blocco proteico sui copripavimenti per perline abbastanza volume di fluido da coprire il 95% centrale del coverslip senza scorrere alcun tampone di blocco dal coverslip (in genere 100 – 200 μl.) Incubare a RT per 60-90 min. Rimuovere con cura il tampone di blocco rimuovendo i copriletti uno alla volta dalla piastra di Petri e versando il fluido dal coverslip in un becher di scarto. Fare attenzione a non far cadere il coverslip. Risciacquare entrambe le facce attive con PBS pipettando 25 ml di PBS sulla faccia attiva 2-4x, non asciugare e utilizzare immediatamente. Assicurarsi di tenere traccia di quali facce di coverlip sono attive. Posizionare un singolo tampone di blocco trattato coverlip attivo a faccia in su in una piastra di Petri sterile, e pipettare una quantità appropriata di anticorpo virale etichettato fluorescentmente nel tampone al centro del viso attivo. Posizionare un altro copripasto (faccia attiva verso il basso) sopra il fluido in un metodo sandwich. Si noti quale faccia è attiva, è importante che le facce attive siano a contatto con il fluido per l’incubazione (vedere fase 3.2). Posizionare il coperchio della piastra di Petri sul panino con coverlip e incubare a RT per 30 minuti. Rimuovere il coperchio della piastra di Petri e separare i due copripacchi come descritto al passaggio 3.4, assicurandosi di tenere traccia e non toccare le facce attive. Risciacquare entrambe le facce attive con PBS pipettando 25 ml di PBS sulla faccia attiva 2-4x, non asciugare e utilizzare immediatamente. Assicurarsi di tenere traccia di quali facce di coverlip sono attive. Non asciugare i copricapo, invece metterli in un rack in teflon all’interno di un becher pieno di PBS. Assicurarsi di tenere traccia di quali facce di coverlip sono attive. Utilizzare immediatamente i campioni preparati o conservare in un buffer appropriato a 4 °C per un massimo di tre giorni senza perdita significativa di integrità. 5B. In soluzione Attacco anticorpale Questo metodo è un miglioramento opzionale della strategia di etichettatura per l’imaging fluorescente a super risoluzione. Applicando l’attacco in soluzione, è possibile ottenere un migliore rivestimento anticorpale sulla superficie virale. Mescolare le soluzioni anticorpali in rapporti in base alle esigenze degli esperimenti. Il rapporto 1:4 di 0,01 mg/ml di anticorpo biotinilato a 0,01 mg/ml di anticorpo con etichetta fluorescente darà una buona affinità di legame e consentirà un buon recupero dell’involucro in un test di imaging a super risoluzione. Mescolare porzioni uguali delle soluzioni anticorpali e virali preparate rispettivamente in (5B.1) e (1.3). Mescolare delicatamente pipettando su e giù alcune volte nell’aliquota. Questa soluzione risultante può essere conservata fino a quando necessario fino a 24 ore a 4 °C. Al termine del passaggio 4.6, posizionare un coverslip trattato con avidin con faccia attiva in una piastra di Petri sterile. Pipettare una quantità appropriata di virus con soluzione anticorpale (preparata nel passaggio 5B.2) al centro della faccia attiva. Posizionare un altro coverslip (faccia attiva verso il basso) in cima al fluido in un metodo sandwich. Si noti la faccia attiva, poiché è importante che le facce attive siano a contatto con il fluido per l’incubazione (vedere fase 3.2). Posizionare il coperchio della piastra di Petri sul sandwich di coverlip e incubare a RT per 45-60 min. Rimuovere il coperchio della piastra di Petri e separare i due copripacchi come descritto al passaggio 3.4, assicurandosi di tenere traccia e non toccare le facce attive. Risciacquare entrambe le facce attive con PBS tubazionando 25 ml di PBS sulla faccia attiva 2-4x. Non asciugare i copriletti, invece metterli in un rack in teflon e un becher riempito immediatamente con PBS. Assicurarsi di tenere traccia di quali facce di coverlip sono attive. Utilizzare immediatamente campioni preparati o conservare a 4 °C per un massimo di tre giorni senza perdita significativa di integrità. 6. Misurazione della proprietà del materiale di microscopia a forza atomica Accendere i laser AFM e aprire il software AFM. Selezionare la modalità di scansione appropriata per il saggio desiderato dalla finestra di dialogo di apertura. Tutte le finestre necessarie devono aprirsi per impostazione predefinita; in caso di apertura delle finestre desiderate, se non consultare il manuale dell’utente. Selezionare un sbalzino appropriato alla misurazione desiderata e inserirlo nell’alloggiamento a sbalzi in base alle linee guida del produttore. Esistono una vasta gamma di condizioni e tipi di esperimenti per i quali esistono una varietà di cantilevers. Lo sperimentatore dovrebbe ricercare i cantilevers in base alle loro esigenze. Inserire l’alloggiamento a sbalzi nella testa AFM secondo le linee guida del produttore. Se il campione deve essere utilizzato in condizioni di bagnato, rimuovere il campione dal buffer di archiviazione e procedere al passaggio 6.7. Se il campione deve essere utilizzato in condizioni ambientali (asciutte), rimuovere il campione dal suo tampone di stoccaggio e risciacquarlo brevemente immergersi in un bicchiere di acqua ultrapura. Nota: Questo lascerà un sottile strato di idratazione sul campione che può indurre attrazione capillare con slitti con una bassa costante primaverile. Se il campione deve essere utilizzato in condizioni ambientali (asciutte), asciugare delicatamente il campione con un flusso di azoto. Asciugare delicatamente il lato posteriore del coperchio con una carta filtrante priva di polvere, assicurandosi di non toccare la faccia attiva del campione. Posizionare il campione nel portacampioni AFM appropriato, quindi posizionare il campione sullo stadio AFM. Se il campione deve essere immaginato in condizioni di bagnato, pipettare una piccola quantità di tampone al centro del campione (~10 μl). Posizionare la testa AFM sopra il campione. Se il campione è bagnato, assicurarsi che il sbalzino e la punta AFM penetrino nel livello superficiale e che non vi siano bolle tra l’alloggiamento a sbalzi e a sbalzi. Allineare il laser AFM con il cantilever in conformità con le raccomandazioni del produttore al fine di ottenere il segnale ottimale. Misurare la frequenza risonante a sbalzi e impostare la frequenza di scansione in base al tipo di esperimento. Abbassare la punta AFM sulla superficie e ottimizzare le impostazioni del segnale. Eseguire una scansione AFM quadrata di 20 μm nella modalità di tua scelta. La modalità di maschiatura (CA) è stata utilizzata per generare dati rappresentativi. Identificare i candidati al virus per altezza approssimativa, che in genere può essere vista come punte affilate sulla superficie del vetro. Selezionare un candidato al virus e centrare la testa di scansione sopra di esso. Eseguire una scansione quadrata di 250 nm (o un’analisi di super-risoluzione appropriata) sul virus selezionato per ottenerne la topologia e l’orientamento. Selezionare un punto sul virus per la misurazione della proprietà del materiale(ad esempio il centro di un virus sferico per la misurazione del modulo di un Giovane) ed eseguire la misurazione in base alle indicazioni del produttore. 7. Metodo di imaging a super risoluzione Aprire il software di imaging a super risoluzione e calibrare il software in base alle linee guida del produttore. Calibrare l’apparecchiatura di imaging a super risoluzione in base alle indicazioni del produttore utilizzando perline fluorescenti. Assemblare il tampone di imaging del campione dalle scorte poco prima dell’imaging combinando 50 μl di 1 M MEA e 100 μl da 10x Gloxy a 850 μl di stock buffer. Mantenere il buffer di imaging sul ghiaccio per tutta la durata dell’esperimento. Rimuovere un coverslip preparato con il campione dal suo tampone di stoccaggio e risciacquarlo 5 volte immergerlo in un bicchiere di acqua ultrapura. Asciugare la faccia non inattiva delle coperture utilizzando una carta filtrante priva di polvere. Assicurati di non toccare il viso attivo. Inserire in un supporto per campioni del sistema di imaging e aggiungere 250 μl di tampone di imaging al portacampioni. È ragionevole scambiare il buffer di imaging sul campione ogni 2 ore per mantenere risultati coerenti. Coprire il portacampioni con parafilm per ridurre l’interazione atmosferica con l’ambiente della stanza. Posizionare il portacampioni nell’apparecchiatura di imaging per l’imaging. Mettere a fuoco il campione utilizzando le indicazioni del produttore. Immagini il campione in base alla tecnica di super-risoluzione utilizzata. Assicurati di regolare le condizioni di imaging per ottimizzare il segnale riducendo al contempo le attivazioni simultanee dei fluorofori foto commutabili.NOTA IMPORTANTE: Le condizioni di imaging dipendono dal campione e variano in base alle esigenze sperimentali. Un tipico esperimento che utilizza Alexa 647 inizializzato in modo efficiente sul loro stato scuro nel buffer di imaging può quindi essere attivato dalla foto tramite l’applicazione della luce UV a 405 nm. Le immagini sono ottenute eccitanti da un sottoinsieme sparso di molecole di Alexa 647 all’interno di un campione densamente etichettato e localizzando ogni fluoroforo con una precisione limitata principalmente dal numero di fotoni raccolti. Questa procedura viene iterata ripetutamente dal software fino a quando non si è verificato un numero desiderato di cicli di acquisizione. Lo sperimentatore deve avere questa impostazione correlata a ogni fluoroforo nel campione che è stato foto-sbiancato. Al termine dell’imaging, spegnere l’apparecchiatura di imaging in base alle indicazioni del produttore. Il software può essere lasciato aperto per l’analisi dei dati. L’analisi dei dati dipende fortemente dall’esperimento; tuttavia, in tutti i casi identificare i virus per tutta la loro larghezza alla metà del massimo, che viene confrontato con le dimensioni del virus note, assicurandosi di prendere in considerazione le dimensioni aggiuntive delle etichette fluorescenti. Per una migliore visualizzazione, visualizzare gli esempi utilizzando l’opzione di rendering Isosurface o l’opzione di rendering volumetrico, entrambi in genere presenti nel software di imaging a super risoluzione.