Summary
在由流体动力基因递送裸DNA的体内转染引入基因到最小的炎症反应的动物的组织中。产生基因产物的足够量,使得基因功能和调节以及蛋白质结构和功能可以被分析。
Abstract
体内转基因的有效表达是在基因功能研究和开发治疗疾病至关重要。在过去几年中,水动力基因传递(对冲)已成为交付的转基因老鼠成一个简单,快速,安全,有效的方法。这种技术依赖于通过快速注射大量生理溶液,以增加灌注器官的细胞膜的渗透性的产生的力,从而将DNA传递到细胞内。一个HGD的主要优点是使用裸质粒DNA(pDNA的)引入转基因到哺乳动物细胞的能力。使用质粒导入外源基因是微创费力,高效,违背病毒携带者,非常安全。 HGD最初用于将基因递送到小鼠体内,它现在被用于提供一个范围广泛的物质,包括寡核苷酸,人工染色体,RNA,蛋白质和小分子进入小鼠,大鼠并且,在有限的程度,其他动物。本协议描述HGD小鼠,专注于那些能够成功执行的关键步骤的方法的三个主要方面:针头插入静脉的正确插入,注入的量和交货速度。实施例是为了显示本方法的应用,以2基因编码分泌的,灵长类特异性蛋白的瞬时表达,载脂蛋白李(APOL-I)和触珠蛋白相关蛋白(HPR)。
Introduction
自从其首次描述Liu 等人 ,张等人 ,流体力学基因传递(对冲)已经成为一个非常宝贵的工具,在啮齿动物模型系统1,2基因功能研究。该技术涉及的溶液的大量(8-12%体重)的快速注射(5-7秒)到小鼠尾静脉中由靶器官1,2的细胞,以促进质粒DNA的摄取。这些条件导致的肾,脾,肺和心脏,肝脏和较少的基因表达健壮的基因表达。
注射10微克质粒pCMV-LacZ的质粒可以转染高达40%的肝细胞,使得HGD最高效的,非病毒, 体内基因递送方法至今1。不像病毒携带者,质粒DNA是很容易准备,不会引起在啮齿动物宿主3的免疫反应和结尾重组不会对健康构成威胁ogenous病毒。另外,由于通过HGD交付的DNA分子不需要的包装,这种方法适合于细菌人工染色体(BAC)一样大的150 kb的4输送。其它类型的已交付由一个流体动力法分子包括RNA 5-10,吗啉11,蛋白质12,13和其它小分子12,14。 HGD超过其它递送方法的优点和缺点的优良评论已被讨论在文献15-20和许多作者所提供的程序21-23的详细描述。
由HGD引入转基因到小鼠中是安全和有效的1-3,24,并 且该方法已在大鼠可比成功25被使用。有了一定的修改,概念验证的实验已经进行了26只鸡,饶位27和28的猪,虽然在较大的动物的体内应用这一技术仍然是一个挑战。当使用这种方法,另一种常见的限制是,许多现有的哺乳动物表达载体中缺少的组件来实现基因表达的持续性,高水平。使用目标器官的pCMV-吕克质粒,基因表达是明显的,因为早在HGD后十几分钟,然而,最初的高表达水平在注射之后的第一周急剧下降。长期的转基因表达可能依赖于在质粒设计3,24然而,维护高水平的基因表达,往往需要反复注射用的启动子和内含子。出于这个原因,HGD可能会对研究慢性疾病是长期暴露于有害的蛋白质或蛋白质产物的结果不太适合。有了这些限制,HGD是一个非常强大的工具,学习宝基因和它的影响作用潜力在体内 ,以及治疗效果和蛋白质的调控和建立疾病的动物模型突变体(综述见15)。例如,HGD,可以使用由单独引入各种基因构建到小鼠体内已各基因敲除分配功能结构域和蛋白质的氨基酸。此外,该技术可以在任何小鼠品系使用。
本协议描述HGD小鼠,专注于必要的技术方面实现成功转染:正确的针头插入静脉,注射量交付和速度。这种方法的应用是体现在非洲锥虫病,人类的一种致命的疾病和牲畜29,30的小鼠模型。虽然一些物种锥虫引起疾病的家畜,最不能引起疾病,由于先天免疫复合物在B人类载量称为锥虫溶解因子(TLFS)29,31,32。这些孔隙形成,高密度脂蛋白(HDL)包含两个独特的,灵长类特异性蛋白质:HPR,配体,这有利于TLFS的摄取锥虫和APOL-I,裂解组件31,33-38 锥虫布氏罗得西亚能够感染人类由于血清耐药相关蛋白(SRA),其结合并中和人类APOL-I 34,39的表达。狒狒TLF未通过SRA由于其不同的APOL-I蛋白40中和。据此前报道,使用哺乳动物表达载体(pRG977),狒狒TLF成分的转基因小鼠表达赋予的保护,防止人类感染锥虫40。这里提出的有代表性的数据展示如何流体力学基因递送可用于研究蛋白质的治疗效果。
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Protocol
这里描述的所有实验均批准了亨特学院的纽约市立大学机构动物护理和使用委员会。
1,制备无内毒素的质粒DNA
- 挑含有在哺乳动物表达载体目的基因从新鲜的划线平板选择性细菌的单菌落。
- 按照市售的无内毒素质粒纯化试剂盒用于种植和收获细菌的手册中找到的建议。
- 通过以下的市售无内毒素的质粒纯化试剂盒的方案纯化从细菌细胞的无内毒素的质粒DNA。
- 使用无内毒素的塑料制品和处理的DNA与照顾,以确保内毒素是不会重新引入的DNA样品中去除步骤之后。
- 通过使用MICR确定其260nm处的吸光度测量的无内毒素的质粒DNA的浓度如下所述邻体积紫外分光光度计或标准,比色皿型分光光度计。
- 清洁微型分光光度计样品保留系统的下部和上部的光学表面如下。吸取1μL的干净的去离子水到较低的光学系统。关闭杠杆臂,并点击了几次,洗澡上的光学系统,然后打开杆并用纸巾擦拭干净。
- 打开微分光光度计的软件,并选择核酸模块。
- 将降低光学系统1微升干净的去离子水,降低杠杆臂,然后从程序软件“初始化”。一旦初始化一个组织完整的,既清洁光学表面..
- 和从程序软件选择“空白”,通过加载1微升的无内毒素的TE缓冲液(1mM EDTA的10mM Tris-CL,pH 8.0)中进行空白测定。一旦空白测量完成后,既清洁光学表面与组织。
- 从程序软件加载1微升的内毒素的DNA样本,并选择“测量”进行样品测量。记录DNA浓度。通过记录吸光度比值260/280 nm的屏幕上会出现评估的DNA纯度。因为对于HGD使用纯DNA(260/280比值为1.8)是非常可取的,避免使用DNA样品与260/280的比例在1.7以下。一次测量完成后,用纸巾清洁两个光学表面。
2,称量小鼠
- 马克小鼠的方式适当的应变。注:尾部的标记,不建议这个程序。
- 有白苔( 如瑞士韦伯斯特)在他们的后面有一黑色标记标记鼠种。随着时间的推移重新标记作为必要的。
- 有黑色皮草( 如 C57BL / 6)由耳标鼠种冲孔数天前。
- 称取小鼠individuaLLY轻轻放置在动物秤盘或桶放在数字实验室天平。记录实验中所用各小鼠的体重,在实验当天。
3,准备注射器
- 注射混合制备
- 计算所需要的假设5的DNA的量 - 50微克无内毒素的质粒DNA用于注入每只小鼠。
- 实验方法确定质粒DNA的最佳量。
- 当确定的DNA所需的时间,假定注入每组的一个额外的鼠标,由于注射器的正确装载将需要一些额外的注射组合。为了帮助计算,考虑下面的例子:注射4实验和4个对照组,每个重25克,每只小鼠50微克质粒DNA。以确定需要在这种情况下的DNA的量,计算出以每组5只小鼠:需要为每个组5×50微克= 250微克的DNA。
- 确定所需的假设体重10%为注射每只小鼠的盐水量(0.9%氯化钠)。
- 根据上面的例子中,于2.5ml盐水(2.5克液体)与50微克质粒DNA注入每个25克鼠标。
- 当确定需要对小鼠的整个组生理盐水的量,假设注入每组附加鼠标,以允许注射器的正确装载。考虑给定的实验中,计算所需的5只小鼠的各组中的盐水的量:5×2.5毫升= 12.5 ml生理盐水为每个组(或25毫升总数)。注意:如果在同一组内的老鼠是不一样的体重(体重超过10%的差异),准备注射液分别混合。
- 使用已批准供人类使用防腐剂和无内毒素,无菌生理盐水,10毫升,多用小瓶。
- 使用连接到20ml的注射器的鲁尔锁头20号针头(0.9毫米×25毫米),从生理盐水瓶中抽出液体,并清空注射器到50毫升锥形管中。为了帮助DNA的盐水注入混合物的制备过程中盐的精确移液,收集比所需的注射所有的小鼠在实验的更多的盐水。对于上面的实验中,从3撤回盐水,将10毫升小瓶(总约30毫升)中,即使盐水的实验所需的计算量仅为25毫升
- 吸取DNA的计算量为不同的50ml锥形管中。小心不要触摸与移液管主体管的一侧,以避免引进的内毒素。根据本示例中,吸取250微克实验的质粒DNA为单独的锥形管的控制和250微克。
- 添加所需的盐水的量来使用血清吸液管将DNA。考虑到样本实验,吸管12.5毫升生理盐水各母液(实验组和对照组)的。
- 让所有的解决方案,以达到室温下在注射之前。
- 计算所需要的假设5的DNA的量 - 50微克无内毒素的质粒DNA用于注入每只小鼠。
- 注射器的制备
- 对于每个小鼠,填充无菌的3毫升,鲁尔锁注射器用无菌20号针头(0.9毫米×25毫米)的DNA的盐水混合。注意避免气泡。避免使用更高容量的注射器注射的流速不能被控制得很好,而且也难以用一只手操纵较大的注射器。弹出任何多余的DNA的盐水混合放回锥形管,因为这可能是重新使用。
- 针切换到一个无菌的27号针头。液体填充针完全没有引入气泡。调整计算基于鼠标的重量将DNA-盐水混合物的体积。
- 不要让不封顶的针头接触任何非无菌表面。放置在一个平面上的盖,插入针没有握住瓶盖用另一只手,按上限针:如果有必要,针头可使用单手技术重新皑皑对一个公司的对象来保护帽将针头。注射器现在已准备好尾静脉注射。
4,水动力DNA传递
- 需要注意的是麻醉的小鼠可能会降低活力。避免在一个房间里太冷执行HGD,因为这也将降低生存能力。如果房间有20°C的环境温度下,或者使用麻醉,将小鼠一个加热垫设置在37℃后程序,以避免任何动物的损失。如果使用麻醉,确保鼠标的嘴和鼻子都在热垫通畅的同时,观察鼠标,直到它完全恢复。不要隐瞒的食物或水从小鼠前HGD。
- 暖鼠来扩张血管。
- 将鼠标笼(床上用品包括在内)在5分钟加热垫,使被褥的温度大约为38-39°C。的温度应足够低,以保持小鼠在热垫为一延长期限。
- 或者,将鼠标变成背的访问限制器以最小的克制。轻轻地用一块纱布浸湿温水中保持温暖鼠标1分钟的尾巴。让鼠标重新定位,如果必要的。擦拭尾部用纸巾擦干。
- 另外,保暖鼠标放置在热灯下笼不超过2分钟。如果使用烤灯,谨慎操作,避免鼠标过热。
- 大容积尾静脉注射
- 通过实验室胶带固定背侧访问阻挡在一个平面上。
- 的尾巴持有,请将鼠标轻轻放入阻挡并插入插头。使用尽可能少的约束作为必要保持尾固定。确保鼠标自由地呼吸。
- 如果鼠标是在严重的困扰任意点的过程中,从阻挡立即移开鼠标,并允许它休息。
- 将鼠标等等横向尾静脉中的一个是可见的。红线在尾部的中间运行是动脉,而在尾部两侧的蓝线是横向尾静脉:直视下在小鼠背部定位的横向尾静脉。
- 擦拭鼠标的尾部用酒精棉签彻底。
- 使用非注射手,紧紧握住尾巴的食指和中指之间,以使尾部穿过食指下,在中间和第三手指和下小指。让拇指保持自由移动。 ( 图1A)
- 用另一只手,擦拭被用酒精棉签再注入的区域。允许区域干燥。
- 拿起装入注射器与注射手和用拇指和其它四个数字之间的枪管握住。不要守住柱塞。
- 定位与针指向鼠标的主体平行于尾部的注射器和朝上针的斜面(倾斜边缘)。
- 将针头插入尾静脉。继续进行注射仅当静脉正确定位,这是显而易见的,从针无阻力滑动。需要注意的是进针的深度是个人喜好的问题然而,完全插入时不因静脉剪切的风险增加建议。 避免移动针头。
- 用尾巴保持手的拇指,关闭上针,然后按集线器反对尾巴的位置保持针的枢纽。不要施加强压,不守住轴针,因为这些都会阻碍液体流入静脉。持用食指尾部松弛地在这一点上,以便不妨碍喷射( 图1A)。
- 重新定位注射器夹持手,使得食指和中指握住凸缘和拇指是在柱塞的端部(FIGURË1A)。
- 向下按柱塞于一体,连续运动,在6-8秒注入液体的最大音量。
- 从静脉取出针和通过应用温和的压力,尾部用纸巾止血。
- 从限制器和地点鼠标移除鼠标进入恢复笼放置在加热垫的顶部(床上用品应该是37-38°C)。如果注射室是冷的,这一步是为鼠标生存的关键。守住鼠标的尾部,直到出血完全停止。
- 观察小鼠1小时以下的水动力DNA传递。气喘吁吁,不动的初期是正常而引起的HGD临时心律失常,但要确保鼠标显示出复苏的迹象,约5分钟。如果鼠标的呼吸变得非常浅,轻轻按摩鼠标促进呼吸的腹部。注意恢复的速度可以由所使用的小鼠品系略有影响。
- 返回鼠标住房笼,确保鼠标有食物和水供应充足。
- 使用替代手的位置大容量尾静脉注射
- 把鼠标放到阻挡和注射制备由下列步骤4.3.1至4.3.5中,如前所述。
- 用四个手指在一个90度的角度弯曲,休息的非注射的手放在一平面上。手指(除了拇指)应让彼此的顶端,创造了一个平台。容纳拇指和指向手指( 图1B)之间的小鼠的尾部。
- 用另一只手,擦拭被用酒精棉签再注入的区域。允许区域干燥。
- 抓住注射器与注射手和通过凸缘与柱塞,准备用于注射的结束握住。
- 通过从步骤4.3.9至步骤4.3.17下面这个协议中,如前面所述完成该过程。
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Representative Results
针的正确定位到小鼠尾静脉中( 如图1)可以通过流体力学的基于转染成功递送的转基因的先决条件。通常的技术中最具挑战性的部分,但是,尾静脉内针不移动的保持,从而使注射的总体积可在6-8秒钟时间内被传递。在注射过程中的小错误可能导致大大降低转染效率和蛋白表达的影响。因此,必须监测HGD的每个实验的成功。如果感兴趣的转基因蛋白难以通过蛋白印迹分析,由于缺乏敏感性的抗体来检测,如在狒狒APOL-I的情况下,喷射效率可以通过共同注射的质粒携带的基因的蛋白质的监测该是容易被检测到。在图2中所示的实验中,给小鼠注射50一个质粒携带三个差异的6xHis之一微克标记的狒狒APOL-I基因和50微克的另一个质粒(同一表达载体的设计),这是承载狒狒HPR(BHPR,标签)。本实验的主要目的是评估在所选定的序列的位置的另外一个6xHis标签的是否干扰正确处理和狒狒APOL-1蛋白的分泌。但是,如果添加了标签的干扰的正确折叠,因此,该蛋白质的分泌,它确定是否蛋白表达的损失发生了,因为受损处理或不成功HGD变得困难。此外,由于缺乏足够的灵敏度的抗体,直接检测狒狒APOL-I在转染的小鼠血浆中的困难,即使在发生成功的基因递送(如通过小鼠的保护,防止人类感染锥虫挑战确定)。在这个实验中,这些问题得到解决通过加入的狒狒HPR质粒等当量到APOL-I HGD混合物作为替代喷射控制。这表现在图中,狒狒HPR呈高表达,几乎所有的转染的小鼠表明HGD是成功的等离子体中。次要滴的表达水平,如在两只小鼠中bAPOL-I的6xHis组1在图2A的1可见,一般是由于一个很小的减少(1-2小时)的注射速度。在图2B中,第一血浆样品泳道1(在bAPOL-I的6xHis组3)示出了完全缺乏蛋白表达的指示失效HGD。在大多数情况下,这是由于注入的递送载体的全部体积的不完全的。因为本实验证实HGD在所有情况下,成功但1,上bAPOL-1分泌的6xHis标签的效果,现在可以通过一个反的6xHis免疫印迹( 图2C和D)进行评估。看在图2D中 ,在他们的血浆有6xHis标签蛋白的可检测水平的唯一组小鼠为组3。此组内的蛋白质表达谱证实,注射的小鼠在这一组中的一个是不成功的。完全没有可检测的6xHis蛋白在组1和2( 图2C)包括强调在注射混合的示踪蛋白监测HGD的成功的重要性。不考虑BHPR( 图2A和B)的血浆水平,从图2C和D的数据可以很容易被误解为HGD在组1和2的故障。
狒狒TLF1组件bAPOL-I和BHPR成功HGD,给小鼠抗人感染布氏布氏锥虫 -SRA寄生虫(TBB-SRA,实验室相当于罗德西亚布氏锥虫的罗得西亚 )40。这个阻力是由于bAPOL-I <的转基因表达/ em>的,作为注射BHPR单独不提供保护,防止人类感染寄生虫。为了评估是否6xHis标签的变种bAPOL我仍然能够起到溶解的蛋白质,即同时接受bAPOL-I和BHPR由HGD小鼠挑战与5000 TBB-SRA寄生虫基因传递的两天后。正如图3,小鼠的6xHis 2组死于感染的极早期,而大多数小鼠组1和3,只要未标记bAPOL-I阳性对照活了下来。 (狒狒APOL我在这个小鼠品系赋予部分保护。)由于在第2组的转基因表达是普遍高,缺乏保护这些小鼠可以被正确地解释为bAPOL我溶解功能的丧失是由于在该6xHis标签位置。护理必须采取然而,该内3组小鼠过早(7天)死亡是不是误解,因为这款鼠标没有成功注射了转基因( 见图URE 2B,泳道1)。在光从图2和3相结合的数据,我们得出结论,bAPOL-I可标记在位置3(中的6xHis第3组)没有任何不良影响,而在2位标记该蛋白(中的6xHis组2)破坏其细胞溶解功能。中的6xHis组1,而数据是暗示保护的小鼠的数目不足以取得显著数据。功率分析应该被执行以确定所需的每个实验小鼠的数目。而明显缺乏在从第1组小鼠血浆可检测蛋白的可能看起来是矛盾的,以如图3所示的保护模式,请注意,在这个基团的负反的6xHis印迹可能是缺乏检测的结果是由于蛋白质加工而比缺乏基因的表达。在组1中,6xHis标签中加入上述预测信号肽的切割位点后关闭。狒狒APOL-I氨基酸序列中包含一个额外的predicteð蛋白裂解位点从该信号肽40的切割位点的约20个氨基酸。因此,很显然,bAPOL-I在这些小鼠中被分泌和功能尚未失去必要的,它的检测6xHis标签。因而示出HIS标签放置的重要性。
APOL-I通过孔隙形成的寄生虫溶酶体膜36,37杀死非洲锥虫。人类APOL-I的自然变异,在人与最近的非洲祖先发现,一直强烈肾脏疾病在非洲的美国人有关,虽然,肾损害的机制尚不清楚41,42。自HGD导致在肝脏最高的基因表达,我们想如果人类APOL-I或其合成的序列变体,在此器官造成损害的调查。为此,给小鼠注射50微克的WT人类APOL-Ⅰ或单个氨基酸合成的突变体所指定的s K4.To评估肝功能损害,我们测得天门冬氨酸转氨酶(AST)收集第2天注射后在小鼠血浆水平。符合其裂解功能,WT人类APOL-I引起的血清AST水平的升高( 图4A)相比,注射了生理盐水的小鼠。与此相反,注射突变K4,其不同之处仅一个氨基酸,造成非常小的AST释放。在肝损伤的差异不太可能是由于蛋白质表达水平,K4蛋白水平相当或高于野生型人类APOL-I( 图4B)的更高。检查来自HGD的小鼠肝脏的收集后5天注射表明人类WT APOL-I导致有限的组织坏死中度巨噬细胞浸润( 图5B)相比,显示正常肝组织学盐水注射的小鼠( 图5A,紫色区域 ) 。确认通过测定血浆AST水平而获得的数据,K4在同一质粒backg注入圆作为WT显示正常肝组织学检查( 图5C)。
图1:插图手,持仓量为HGD的。 A.)位置1。推荐手的位置,以达到最大注射速度,避免在注射后针头运动已经开始。箭头指示的插入针头插入静脉后拇指所建议的运动。拇指应轻轻保持对小鼠的尾部毂固定针头。用手握住注射器必须重新定位,以便能够在注射前摁倒在柱塞。 B.)位置2,该位置,建议如果尾静脉注射,必须进行更接近尾的基部因重复注射。一旦将针插入静脉,此指针位置,需要的不是皮毛热敏调整。
图2等离子体的五周龄,雌性,瑞士韦伯斯特(SW)注射了两个独立的质粒混合的小鼠收集的Western印迹分析:50微克狒狒HPR和50μg差异的6xHis标签的狒狒APOL-I基因。小鼠注射盐水载体作为阴性对照。以确认HGD的成功,该实验显示了狒狒HPR蛋白的循环血浆水平,如狒狒APOL-I是难以察觉。收集小鼠的血浆样品后2天HGD和蛋白表达水平通过免疫印迹(血浆稀释1:20)在变性,非还原条件下的10%Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。使用兔多克隆抗体抗人触珠蛋白(HP),其中还RECO HPR检测gnizes狒狒HPR。标签bAPOL - 我使用的是兔多克隆抗体对6xHis标签检测。包含的6xHis蛋白质控制的分子量是40和50 kDa的。 A.)面板显示了分泌蛋白(HPR),当在一个组中的所有小鼠注射成功的免疫印迹分析的一个例子。注意,在第二His-标记的基团(bAPOL-I的6xHis第2组),其中注入是非常成功的均匀的高表达。在第一组(bAPOL-I的6xHis组1),从小鼠的1蛋白的表达是显着的,但有些降低,可能是由于注射的降低速度。 B.)面板显示了当注射(在bAPOL我的6xHis第3组)中的一个是不成功的蛋白表达水平的例子。 C.)面板显示包括示踪蛋白(BHPR)监测HGD成功时的利息bAPOL-I蛋白()的检测是不确定的重要性。尽管HGD的bAPOL我的成功确认
图3。存活小鼠表达狒狒APOL我的6xHis变种和狒狒HPR的。五周龄,雌性,瑞士Webster小鼠在相同的注射组合接收50微克每两个独立的质粒由HGD。在本实验中使用的小鼠对应于图2中所分析的血浆。在后第2天注射,小鼠被感染了5000人感染TBB-SRA寄生虫和寄生虫血症进行了监测。当寄生虫达到10 9个寄生虫/毫升,处死小鼠。生存期显著差异生理盐水对照特别注明(* - p <0.05,对数秩和检验)。小鼠存活于寄生虫的挑战是如何HGD的成功影响从随后的实验中获得的数据的示例。当狒狒APOL-I的成功注入,基因产物分泌到血液中鼠标的地方是采取了由和杀死人类感染锥虫。生存曲线表明,老鼠注射了狒狒的6xHis标签3版APOL我对TBB-SRA是显著的保护。唯一的过早死亡在这一组对应于鼠标未成功注射该质粒携带转基因的(参见图2)。这款鼠标应该被排除在生存分析其对寄生虫的生存挑战不属于转基因的接收差异,而是以基因传递的失败。
K4)APOL-I的转基因。质粒载体(pRG977)是相同的所有基因变异。小鼠血浆标本采集HGD两天后。 AST水平分别使用市售的试剂盒比色测定。请注意,在AST水平升高是与APOL-I基因,而不是HGD本身的创伤序列变异有关。数据是从一个代表性的实验使用下列数血浆样品的测定一式三份:盐水(n = 6),K4(N = 4)和WT(N = 3)。误差条表示标准偏差。 B.)血浆从那些在面板A.蛋白表达水平进行免疫印迹(血浆1:40稀释)用在变性10%Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳分析评估AST水平收集小鼠后第2天HGD Western blot分析,在非还原条件。 APOL,我使用的是检测兔多克隆抗体对N端的人APOL我的。
图5。单一氨基酸替换在APOL-I序列结果在不同层次的组织病理学。由图可知,给予生理盐水车辆(A)的水动力注射50微克人类WT APOL-I(B),或50微克APOL-I,K4(C)的合成突变的变种西南小鼠的肝脏。被拆除的第5天注射后肝脏和处理的苏木精伊红染色。代表性的实例示测定AST水平在图4。组件(DF)的相同小鼠显示受损区域中的WT小鼠的附加例子。在板(B)坏死灶,(DF)都标有黑色的矩形和被放大。白色箭头在这些面板指向的巨噬细胞浸润的区域。为了进行比较,从盐水注射赋形剂的小鼠的肝脏中的代表性区域的正常组织的特点是淡蓝色的矩形,并且还扩大了。板(B)和(D)是代表性图像从相同的WT小鼠,同时面板(E)和(F)是从两个不同的WT小鼠中。
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Discussion
当正确执行,HGD是一个非常安全和有效的转基因运载工具。的关键步骤,以成功HGD是:1)提供的DNA适量在一个大体积的盐水车辆2)插入到小鼠尾静脉3)在小于8秒。
虽然注射过程本身无可否认需要一些手巧,这半年的第二个过程的成功往往在于精心准备实验。必要的,以达到最大的基因表达的质粒DNA的量会有很大的改变取决于所用的质粒,也可以因此表达的基因,DNA被注入的最佳量应根据实验为每个应用程序确定的。对于小鼠,一般推荐的DNA范围是5-50微克,超过这一基因的表达可能会达到一个平台期。在我们的手中,注射50微克pRG977携带无论是APOL-I或HPR基因导致高水平型循环的克蛋白水平在最初两天后HGD。两种蛋白的血液水平在未来几天内显著下降,直到蛋白水平低于约10天(38和未发表的数据)检测水平。 DNA的最佳量应该在生理溶液相当于被传递到的体重鼠标1,2的8-12%。虽然大多数研究人员,包括我们,用生理盐水注射车辆,林格氏液已用于HGD相媲美的成功2。注意,虽然它并不需要在无菌环境中进行HGD,就必须避免在整个过程中的注射液的内毒素污染。为此,用于注射的生理盐水溶液应该是优越的纯度,也可以注入的DNA应该使用市售的试剂盒,去除内毒素的制备。另一个重要的准备步骤是小鼠的仔细权衡。由于注射量是HGD成功的关键环节之一,重要的是要确保鼠标既不欠剂量,也不过度服用生理盐水。前者错误的结果不理想的转染,而后者则在该动物的可能死亡。为了进一步确保动物的安全,我们建议装载注射器用小针头,以避免引入小气泡,是很难摆脱的。如在协议中所述针头 - HGD应该用27来进行。
正确的注射被大大促进,如果尾静脉都清晰可见。通过鼠标轻轻加热扩张血管可能有助于静脉的可视化,如果用尾巴照明器的抑止不可用。将鼠标笼上一个隔热垫几分钟或控股尾部与温暖,潮湿的布工作以及在我们的手中。如果使用热灯,必须谨慎行事不要过热老鼠。我们发现,我们ing一个加热灯使小鼠不必要的压力和不适感,因此,应该避免。擦尾用70%乙醇通过增加尾部静脉和皮肤之间的对比度进一步有助于可视化。这一步也很关键,以避免注射过程中的细菌污染。一旦鼠标准备用于注射,尾静脉可使用在此协议中描述的手的位置中的任一个被注入。注意,同时位置2似乎更容易和更直接的,也可能是更为困难,而无需移动注射器注入的液体的全部体积。与此相反,采用第一种方式建立良好的针的位置是比较麻烦的,但是,一旦该针头套管被压在尾部可靠地保持,注射很少发生故障。第一种方法还建议为最大速度,虽然成功转染可以用任意一只手的位置。
HGD注射液对小鼠的推荐速度为6-8秒,虽然许多作者认为,更快的注射产生更好的结果1,12。缓慢注射会导致显着降低基因的表达。然而,最常见的原因完全缺乏的基因表达是未交付喷射的全部体积。发生这种情况时,将针移动时,在注射开始后。正确地定位,所述针进入静脉,没有阻力。要检查针正确插入静脉,人们可以充分注射前注入极少量(100微升)的液体进入静脉。如果向下压柱塞会见极端抵抗,针是在错误的位置和液体进入尾部组织。如果针头离开静脉中注射,校正不成功HGD后鼠标被允许休息了几个小时,可以尝试。重新注射后休息不足会导致痛苦的鼠标,并可能导致水动力PRESSUR损失Ë通过开放的第一个缠绕在鼠标的尾部。如果重复注射是必要的,鼠标可以与盐水的全部体积(和DNA的量)或更靠近尾部在同一静脉或对侧静脉基部注入。以下HGD,鼠标应在笼子放置在一个热垫为至少一小时进行观察。 HGD导致在血管内的压力导致心脏功能,肝扩张,肝细胞,窦状隙和窗孔12,14,43的膜孔的一个中断的一种急性凹凸的急剧增加。尽管他们在几秒钟内血容量增加一倍,小鼠耐受HGD非常好。的心脏速率恢复到正常的2分钟,并在血管内的压力,这在注射后不久迅速减小,接近基线水平在3分钟12,43。被破坏的肝细胞重新密封在不到2分钟,并扩大肝脏大小回报在30分钟,随后在约24小时43正弦函数的恢复正常大小。虽然许多研究人员成功地使用麻醉,在我们的手中,异氟烷麻醉小鼠加剧的呼吸窘迫由于HGD。我们发现,麻醉小鼠需要更长的时间来恢复,偶尔需要复苏的生存。如果注射了一大群使用麻醉小鼠,可能需要有一个额外的人在房间里,致力于监督福祉复苏的动物。不用麻醉,即使经过多次注射,小鼠存活为100%,恢复时间小于5分钟。
这里描述的协议可被用来提供范围广泛的分子对小鼠肝。使用分泌蛋白APOL-I作为一个例子,我们展示了如何HGD可以用来建立的小鼠模型,研究的保护蛋白质的功能。当比较不同的基因产物的功能,帅客该HGD的SS应分摊只要有可能。对于分泌的蛋白质,很容易通过使用蛋白质印迹分析小鼠血浆来监测表达水平( 图2和图4B),以确保HGD的成功测定治疗性蛋白质的天然或合成的变体时,作为转染效率特别重要的是能严重影响疾病的转归( 图2和图3)。实施例是为了显示如何应用此方法可扩展到分析引起APOLI,这是一种成孔蛋白( 图4和5)的肝损伤。 APOL-1在相同的质粒背景结果中明显不同的损坏访问序列变体。这表明组织损伤是与蛋白质的功能和不表达载体或注射本身的创伤相关联。应当指出的是,在我们手中,AST水平是普遍高的第1天注射后(数据未显示)。小鼠在第2天,然而,AST水平在投射用生理盐水恢复正常和中基因变异的差异都能看到( 图4)。由第3天注射后,AST在各处理测量返回其基础水平(数据未示出)。由于在肝坏死组织和炎症是显而易见长于AST短暂升高,由于持续的基因表达的肝损伤,可以更可靠地评估,尽管是定性地,通过收集在5天注射后肝组织的染色。实施例中给出显示,变体APOL-I引起的AST释放增多2天注射后也导致更持久的肝损伤的评估,用苏木精和曙红染色。
流体力学基因递送允许在体内基因表达的快速分析。它需要简单的结构所研究的基因插入真核表达载体,并执行如上文所述的注射能力。 transge的一代使用其他形式的基因递送,如来自HIV-1或重组腺相关病毒载体的重组慢病毒载体NIC小鼠,需要更多的专门知识。然而,他们的优势是持续的基因表达,虽然病毒基因的表达往往造成由于主机检测病毒感染和应对15-19炎症反应。此外,病毒载体具有有限的封装能力,因此,在基因的大小是有限的,而150KB的BAC的已成功在HGD 4中使用。掌握该技术后,用户可以转染的任何核酸(cDNA或基因组DNA或RNA) 的体内 ,并按照蛋白质的生产和生物学后果。该蛋白质可以是细胞内的,膜结合的或胞外;它可以被标记或修饰的核酸,从而氨基酸水平。最重要的是,这是一个非常快速和简单的技术。
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Disclosures
作者宣称,他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我们感谢刘霞(Regeneron公司制药)的最初教我们的HGD技术和罗素汤姆逊博士(医学阿尔伯特·爱因斯坦学院),他在技术的各个方面不断的指导。这项工作是由亨特学院,纽约市立大学启动基金和国家科学基金会颁发的面包IOS-1249166。我们感谢NYULMC病理组织学核心NYUCI中心支援津贴,NIH / NCI 5 P30CA16087-31为组织学上的小鼠肝脏。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
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