Summary
Indførelse af små molekyler til at udvikle Drosophila embryo et stort potentiale til at karakterisere den biologiske aktivitet af nye forbindelser, lægemidler og toxiner samt til sondering grundlæggende udviklingsmæssige veje. Heri beskrevne metoder skitsere skridt at overvinde naturlige barrierer for denne tilgang, udvide nytten af Drosophila embryo model.
Abstract
The Drosophila embryo har længe været en stærk laboratoriemodel til at belyse molekylære og genetiske mekanismer, der styrer udviklingen. Den lette genetiske manipulationer med denne model har fortrængt farmakologiske tilgange, der er almindelige i andre dyremodeller og cellebaserede assays. Her beskriver vi de seneste fremskridt i en protokol, der muliggør anvendelse af små molekyler til det udviklende bananfluen foster. Fremgangsmåden detaljer skridt til at overvinde den uigennemtrængelighed æggeskallen samtidig bevare levedygtigheden foster. Eggshell permeabilisering på tværs af en bred vifte af udviklingsstadier opnås ved anvendelse af en tidligere beskrevet d-limonen embryo permeabilization opløsningsmiddel (EPS 1), og som den aldrende embryoner ved reduceret temperatur (18 ° C), før behandlinger. Desuden er brugen af en langt rødt farvestof (CY5) som en permeabilisering beskrevne indikator, som er kompatibel med efterfølgende anvendelser involverer standard rød og grøn influenzaorescent farvestoffer i levende og faste præparater. Denne protokol gælder for undersøgelser ved hjælp af bioaktive forbindelser til sonde udviklingsmæssige mekanismer samt undersøgelser med henblik på at evaluere teratogene eller farmakologisk aktivitet af ukarakteriserede små molekyler.
Introduction
Drosophila embryo fortsætter med at være en førende model til undersøgelse af grundlæggende mekanismer i udvikling 2. Denne kraftfulde model er understøttet af en bred vifte af molekylære genetiske værktøjer, som tillader manipulation af i det væsentlige enhver gen på noget tidspunkt og inden for ethvert organ under udvikling. Den lille størrelse, hurtig udvikling, og omfattende karakterisering af morfogenese af Drosophila foster gør det til en model valg for genetiske skærme, hvoraf mange har afdækket grundlæggende udviklingsmæssige veje 3,4. Talrige fænotyper i Drosophila foster er blevet karakteriseret og er let fortolkelige, ofte giver et middel til at identificere de underliggende molekylære genetiske mekanismer, der er ansvarlige for en unormal egenskab.
Historisk set har en mangel af fluen embryo model været vanskeligheden ved at indføre små molekyler til embryonale væv. Denne hindring har stillet begrænsninger: 1) osning kendte bioaktive små molekyler som prober til at afhøre udviklingsmæssige mekanismer og 2) ved hjælp af dette etablerede model til at vurdere teratogene eller farmakologisk aktivitet af ukarakteriserede små molekyler. Som en konsekvens heraf har screening potentiale flueembryo blevet underudnyttet i karakterisering af lille molekyle aktivitet.
Levering af små molekyler til flueembryo kan opnås med to metoder: 1) permeabilisering af æggeskallen og 2) mikroinjektion. Denne artikel præsenterer forskud til metoden for permeabiliseringen, der er nemme at udføre i fastsættelsen af en konventionel Drosophila laboratorium. Det skal bemærkes, at de seneste fremskridt inden mikroinjektion metoder med MicroFluidics teknologi også bidrager til metoder til at indføre forbindelser til embryo 5,6. Introduktion molekyler embryonet forhindres af et voksagtigt lag af æggeskallen 7. Drosophila-æggeskal består af fem lag. Fraindefra og ud, de er: vitellinmembranen, den voksagtige lag, den inderste chorion lag, den endochorion og exochorion 8. De tre ydre chorion lag kan fjernes ved kort emersion af embryoet i fortyndet blegemiddel, der er nævnt et skridt til som dechorionation. Det eksponerede vokslag kan derefter blive kompromitteret ved udsættelse for organiske opløsningsmidler, såsom heptan og octan 7,9, hvilket gør dechorionated embryo gennemtrængelige, mens den forbliver indkapslet i den underliggende vitellinmembranen. Imidlertid er anvendelsen af disse opløsningsmidler indfører komplikationer på grund af deres toksicitet og vanskeligheden i reguleringen af deres stærke permeabilisering indsats, som begge har skarp negative virkninger på levedygtighed embryo 9,10.
En fremgangsmåde til permeabilisering anvendelse af en sammensætning betegnes embryo permeabilisering opløsningsmiddel (EPS) er tidligere blevet beskrevet 1. Dette opløsningsmiddel består af d-limonen og plante-afledte overfladeaktive stoffer, der gør det muligt for opløsningsmiddel for at være miscible med vandige buffere. Den lave toksicitet af d-limonen og evnen til at fortynde opløsningsmidlet ønskede koncentrationer har givet en effektiv metode til at generere permeable embryoner med høj levedygtighed 1. Imidlertid har to endogene faktorer fortsatte med at bringe begrænsninger for anvendelsen. Først embryoner demonstrere heterogenitet i permeabilitet efter EPS behandling, selv når der er sørget for at holde tæt udviklingsmæssige iscenesættelse. For det andet, embryoner ældre end cirka otte timer har vist sig vanskeligt at permeabilisere, i overensstemmelse med en hærdning af æggeskallen, der opstår efter æglægning 11.
Beskrevet her er fremskridt i EPS metode, der: 1) at bistå med at identificere og analysere nær-identisk permeabiliserede embryoner, selv efter fiksering og immunfarvning skridt er blevet henrettet, og 2) gør det muligt permeabilisering af embryoner på sene udviklingsmæssige tidspunkter (> 8 timer, scene 12 og ældre). Specifikt anvendes en langt rødt farvestof,CY5 carboxylsyre, er beskrevet, som tjener som en permeabilitet indikator, som fortsætter i foster under udvikling og efter formaldehyd fiksering. Desuden er det vist, at opdræt embryoner ved 18 ° C fastholder æggeskallen i en EPS følsom tilstand, så permeabilisering af sene embryoner (faser 12-16).
Disse fremskridt overvinde de tidligere nævnte begrænsninger for EPS metodologi. Dette program vil derfor give efterforskerne med et middel til at indføre små molekyler af interesse for embryo på forskellige udviklingsmæssige tidspunkter samtidig opretholde levedygtighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Udarbejdelse af Fly Cultures, løsninger og Embryo Håndtering Devices
- Forbered et bur kultur Drosophila. Anbring 500 + parring fluer af det ønskede stamme i en population bur udstyret med en 10 cm grape-agarplade og en plet af gær pasta. Opretholde kultur i et 25 ° C luftfugtighed kontrolleret inkubator. BEMÆRK: Cage kulturer kræver en dag eller to af konditionering til opnåelse af konsistente embryo om mønstre. Grape plader med gær pasta skiftes en gang om morgenen og en gang i aften under condition.
- Forbered EPS. Varm opløsninger af overfladeaktive midler (Cocamide DEA og ethoxyleret alkohol) ved 37 ° C. Der afpipetteres 18 ml af d-limonen til en glasscintillationshætteglas udstyret med en lille omrører. Der afpipetteres 1 ml af hver af de to tensider (5% slutkoncentration på hver) til d-limonen. Bland grundigt og fjerne omrørerstang. BEMÆRK: Denne stamopløsning af EPS er god for cirka 2 måneder ved stuetemperatur. Opløsningenbør opvarmes ved 37 ° C og skvulpet for at fuldt solubilisere overfladeaktive inden brug. EPS og d-limonen, bør opbevares i en glasbeholder, som de vil opløse nogle plast over tid.
- Forbered embryo dechorionation løsning, inkubations medier, farvestof og narkotika løsninger. Bland 25 ml blegemiddel med 25 ml H 2 O og sted i dyb tallerken. Forbered ændret grundlæggende inkuberingsmedium (MBIM) og MBIM-T i henhold til forudgående opskrift 1,12. Forbered Shields og Sang M3 cellekulturmedium og PBS i henhold til producentens protokol (se Materialer List). Forbered stamopløsning af permeabilization farvestof på 10 mM koncentration i DMSO.
- Saml embryo-håndtering enheder og forsyninger:
- Forbered dechorionation og EPS behandling kurven (se figur 1A). Skær et stykke af en engangs 50 ml polypropylen centrifuge / kultur rør med en fintandet sav 3 cm. Gør svejsning overflade flush ved at gnide røret afsnittet om sandpapir klæbeten bordplade overflade. Weld rørsektionen til Nitex nylonnet ved smeltning randen af rørafsnittet over en flamme og trykker mod masken på en glasplade. Lad afkøle og trimme ekstra mesh. BEMÆRK: De stejle sider og bund giver mulighed for hurtig og fuldstændig skylning af resterende blegemiddel og EPS på de respektive trin. Svejseprogrammerne trin skal udføres under en emhætte.
- Forbered en udvikling kurv. Skær øverste del af en 50 ml centrifuge / kultur rør flugter med kanten af hætten. Fjern og ændre hætten ved at skære en central åbning og hak langs kanten, som vist i figur 1B. Skru hætten over mesh og på gevindet på afskåret rør sektion og trim ekstra mesh. BEMÆRK: Hætten indeholder hak i fælgen, der tillader diffusion til hovedparten medium, når placeret i 60 mm reservoir fad (figur 1B).
- Forbered komponenter i et dias kammer. Skær en kvadrat af DO membran, der er større endslide kammer åbning. Påfør et meget tyndt lag af vakuum fedt på indersiden læbe af åbningen. Anbringer DO membranen i åbningen forsegling det mod fedt med holderingen. Trim overskydende DO membran ved at skære den tilbage tæt på holderingen. BEMÆRK:. Specifikationer for slide kammer kan findes i Kiehart m.fl. 13 Dette kammer er ikke kommercielt tilgængelig og kræver specialfremstilling af et maskinværksted.
2.. Staging, Dechorionation og EPS behandling af embryoner
- Iscenesættelse embryoner tidsindstillet samling. Sæt en frisk drue / gær plade til fluen kultur bur i AM. Tillad embryoner skal lægges i 1 time ved 25 ° C. Kassér denne plade og erstatte med en frisk drue / gær plade for en efterfølgende embryo udlægning af 2 timer ved 25 ° C. Saml denne plade og sted i 18 ° C inkubator for yderligere udviklingsmæssige iscenesættelse. BEMÆRK: 1 time udvikling ved 25 ° C er lig med 2 timer udviklingved 18 ° C. Effekten af ældning ved 18 ° C mod 25 ° C på at opretholde EPS permeabilisering i embryoer sene kan ses i figur 2.
- Dechorionation. Forsigtigt skylles embryoner fra drue plade i trådkurv hjælp 25 ° C vand fra hanen og en pensel. Skyl overskydende gær væk fra embryoner i kurven under en svag strøm af vand fra hanen. Fordyb kurven i 50% blegemiddel i 2 min. Vask embryoner grundigt i en strøm af vand fra hanen. BEMÆRK: Sprøjt forsigtigt blegemiddel løsning på embryoner med mellemrum ved hjælp af en plastik pipette. Mens 2 min er normalt tilstrækkeligt til fuldstændig dechorionation, bør inkubationstiden kontrolleres ved direkte undersøgelse og justeres i overensstemmelse hermed. Bevar dechorionated embryoner i kurven nedsænket i vand fra hanen og gå straks til EPS trin.
- EPS Behandling
- Forbered seks 60 mm skåle med ca 10 ml PBS i hver. Forbered EPS fortynding ved at opløse 75 gl EPS i 2.925 ml MBIM (1:40) i en 50 ml glas bægerglas med hvirvlende. Bemærk: En hvid emulsions formularer fra denne blanding.
- Dup overskydende vand fra bunden af trådkurv med en lab tørre. Fordyb kurven i fortyndede EPS i bægeret og straks swirl at sprede embryoner i EPS-løsning i bunden af kurven. Fortsæt slyngbevægelse i 30 sek. BEMÆRK: EPS fortyndinger og eksponeringstider kan varieres for at kontrollere permeabilitet. Det anbefales, at optimale EPS fortyndinger og behandlingstider etableres empirisk med stammer af fluer, der anvendes. Øget eksponering tid til 60-90 sek er gunstigt for trin 12 og ældre embryoner.
- Fjern kurven, skamplet væk overskydende EPS med en lab tørre. Fortsæt med seks sekventielle vask i 10 ml PBS i 60 mm skåle. Brug en plastpipette til forsigtigt sprøjte embryoner med PBS i hver af de seks vaske. Fortsæt til farvning og narkotikabehandling trin. BEMÆRK: EPS kan bortskaffes ned i vasken.
3.. Dye and Drug Behandling af permeabiliseres embryoer
- Dye Behandling
- Der tilsættes 5 ul 10 mM CY5 carboxylsyre farvestof * til 1 ml MBIM-T (50 uM slutkoncentration) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og vortex at blande. BEMÆRK: * Valg af farve afhænger af downstream analyse. CY5 carboxylsyre er effektiv for efterfølgende analyser ved hjælp af fiksering og immunfarvning. Rhodamin B er nyttig til analyse af levende embryoner. Den røde emission af Rhodamine B, og den grønne emission af dets metabolitter 1, kan præsentere nogle komplikationer med downstream applikationer ved hjælp af fluorescens. Lægemiddel eller toksin kan tilsættes til farveopløsningen at indlede behandling på dette tidspunkt, eller til at begrænse lægemiddel / toksin behandling til en puls på dette stadium. Der bør udvises omhu for at håndtere og bortskaffe lægemidler og toksiner ifølge MSDS og miljømæssige sikkerhedsstandarder.
- Overfør embryoner fra trådkurv til farvestoffet løsning med en pensel. Sæt låg på og bland flere gange for at sikre, atembryoner flyde frit i suspension i farvestoffet løsning. Placer røret på en nuterende rocker i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern røret fra nutator og lad embryoner afregne. Fjern farveopløsning med en fin pipette og erstatte med 1 ml MBIM-T at vaske. Vend røret for at re-suspendere fostre helt. Lad embryoner bosætte sig og gentag med yderligere tre MBIM-T-vaske. Fjern alle MBIM-T fra sidste skylning og fortsæt til inkubationstrinnet.
- Inkubation i Embryo Development
- Overfør embryoner til en af to kamre: Udviklingen kurv eller slide kammer. BEMÆRK: Udviklingen kurv foretrækkes til længere udviklingsmæssige perioder og er nødvendig, hvis de efterfølgende fikseringen og immunfarvning trin er at blive henrettet. Det dias kammer er optimal for højere opløsning time-lapse billeddannelse og er mest effektiv for korte udviklingsmæssige perioder (f.eks de tidlige embryonale begivenheder). Lægemiddel eller toksin kan tilsættes til mediet i forskellige koncentrationer og embryo ddvikling kan overvåges i realtid med levende fostre, eller ved et endepunkt ved hjælp af standard fiksering og immunfarvning protokoller.
- Udvikling i Kurve
- Rengør en udvikling kurv ved at sprøjte med 70% ethanol, skylles grundigt med deioniseret vand og duppes tørre med lab tørre. Forbered 6 ml inkubationsmedium med den ønskede koncentration af lægemiddel eller toksin. Placer udvikling kurv i medium i 60 mm skål idet man ikke fange luftbobler under masken base. BEMÆRK: To medier er almindeligt anvendt: MBIM alene eller MBIM/M3 i en blanding i forholdet 50:50, hvor sidstnævnte er mere effektivt for længere udviklingstid.
- Overfør permeabiliserede embryoner til mesh overflade i bunden af kurven med en pensel. Forsigtigt sprøjte embryoner med medier fra den omgivende reservoir. Dispergere embryoner med pensel, således at de er i et monolag på masken. BEMÆRK: Fortsæt til mikroskopi billedbehandling og evaluere permeabilisering og levedygtighed karakteristika PReparation (se trin 4).
- Udviklingen i Slide Afdeling
- Vend slide kammer og anvende en lille perle af vakuum fedt på kanten af åbningen. Placer 150 pi medium med den ønskede mængde af lægemiddel eller toksin på overfladen af DO membranen i åbningen. BEMÆRK: To medier er almindeligt anvendt: MBIM alene eller MBIM/M3 i en blanding i forholdet 50:50, hvor sidstnævnte er mere effektivt for længere udviklingstid.
- Overfør permeabiliserede embryoner til drop af medier med en pensel. Disperse embryoner gør dem slå sig ned på membranen i drop.
- Anvende forsigtigt en 25 mm cirkulær dækglas over åbningen og derved udfladning mediet. Tryk forsigtigt ned langs kanten af dækglasset for at danne en forsegling med fedt. BEMÆRK: Fortsæt til mikroskopi billedbehandling for at evaluere permeabilisering og levedygtighed karakteristika forberedelse (se trin 4).
4.. Identifiring af permeabiliserede Levedygtige embryoer
- Identificer permeabiliserede embryoner. Observere embryoner under epifluorescens med et mikroskop udstyret med et digitalt kamera. Anskaf billeder (i den blå bølgelængde til at bestemme profilen æggeblomme autofluorescens) af flere områder ved hjælp af faste mikroskop og kameraindstillinger.
- Bestem permeabilisering af embryoner er baseret på relative fluorescens intensitet. Brug et stereomikroskop med en stor arbejdsafstand til at rumme kurven og til at tillade manipulation af embryoner. Mikroskopet skal være udstyret med en programmerbar XYZ scene, epifluorescensbelysning og et digitalt kamera. Billede embryoner, der tager sig at optage eksponering og scene position parametre for hver embryo billede for at gøre det muligt for revurdering af de samme embryoner på et senere tidspunkt (se repræsentativt resultat i figur 3). BEMÆRK: Mønstre af farvestofoptagelse vil variere afhængigt af det anvendte farvestof, længde af eksponering og embryo alder. En bred viftefarvestof optagelse over et enkelt præparat er typisk og afspejler variationen i graden af permeabilisering.
- Identificer levedygtige fostre. Efter mærkning stilling permeabiliserede embryoner, fortsætter med embryo udvikling ved stuetemperatur eller 25 ° C. Retur kurv eller slide kammer til mikroskop. Overhold under blå kanal fluorescens og erhverve billede af æggeblomme autofluorescens i tidligere identificerede permeabiliserede embryoner. Vurdere levedygtigheden i overensstemmelse med normal progression af æggeblomme distribution (se Rand et al. 1 og repræsentativt resultat i figur 3). BEMÆRK: Andre morfologiske egenskaber af embryonet observeret med lysfeltmikroskopi, kan anvendes til at vurdere levedygtigheden. Det anbefales, at fastsættelsen af permeabilitet, der er kompatibel med levedygtighed bestemmes empirisk med hver farvestof og stamme af flue anvendes.
- Vurdere narkotika eller toksinvåben effekter i permeabiliserede levedygtige fostre.
- Embryoner processed med ovennævnte protokol er klar for en række konventionelle analyser efter lægemiddel eller toksin eksponering. Flere af de forskellige typer af analyser er behandlet i diskussionen nedenfor og omfatter direkte observation af morfogenese i levende fostre samt post-fiksering immunfarvning analyser. Begge disse fremgangsmåder er forbedret ved anvendelse af vitale farvestoffer (f.eks GFP), der afslører genekspression mønstre og cellelinie og morfologi profiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Embryo håndteringsindretninger er afbilledet i figur 1 for at hjælpe med at visualisere de "hjemmelavede" anordninger til manipulation i de ovennævnte protokoller. Resultaterne ses i figur 2 illustrerer robust effekt af opdræt embryoner ved 18 ° C på deres evne til at blive permeabiliseres af EPS på sene stadier af udvikling. Denne betingelse er anvendt i protokollen trin 2.1. Effekten af CY5 carboxylsyre farvestof for at vise de forskellige niveauer af permeabilitet typisk ses i EPS behandlede embryoner ses i fig. 3. De udviklingsmæssige dynamik farvestoffet fordeling i blommen ses også i figur 3, afslører et kriterium anvendt til at vurdere levedygtigheden som beskrevet i protokol trin 4.2. Anvendeligheden af CY5 farvestof i fastsættelsen embryo permeabilisering efter toksin behandlingen, formaldehyd fiksering og immunfarvning illustreres af resultatet i fig. 4.
Figur 1.. Embryo sådanne elementer, EPS-metoden. Den fladbundet kurv anvendes i dechorination og EPS eksponering trin (A, A '). Udviklingen kurven anvendes i længere udviklingsmæssige engagementer permeabiliserede embryo (B, B '). Det dias kammer bruges til kortere udviklingsmæssige engagementer og højere opløsning billeddannelse af levende fostre (C, C '. Se teksten for yderligere beskrivelse).
Figur 2.. Effekt af ældning ved 18 ° C på EPS effekt i embryoer sent. Embryonerne er indsamlet i to timer efterfulgt af ældning ved 18 ° C i 20 timer (Paneler AA "
Fig. 3. Inkorporering af CY5 i gennemtrængelige og levedygtige embryoer. Embryoer blev opsamlet ved 25 ° C i 2 timer og henstod i 14 timer ved 18 ° C (svarende til 7-9 hr embryoer ved 25 ° C, trin 12). Efter dechorination EPS behandling blev gjort (1:40 i MBIM for 1 min), efterfulgt af inkubering i CY5 farvestof (50 uM i MBIM-T i 15 min.) Embryoer blev vasket tre gange i MBIM-T og overføres til udvikling kurv med MBIM i reservoiret. Udvikling fik lov til at proceed i 8 timer ved stuetemperatur. Optagelse af CY5 (rød) er afbildet i den yderste røde kanal umiddelbart efter farvestof behandling og vask (Panel A) og efter 8 timers udvikling (Panel B). Fordeling af blommen ses af autofluorescens i den blå kanal. Farvestofoptagelse dermed permeabilitet, ses at variere fra embryon til foster. CY5 farvestof (rød) ses at lokalisere blommen (blå), som bliver koncentreret til lumen af tarmen ved trin 16 (lilla, panel B).
Figur 4.. Bestemmelse af permeabilisering og methylkviksølv virkninger i faste og immunofarvede embryoner. Embryoer blev opsamlet ved 25 ° C i 2 timer og henstod i 14 timer ved 18 ° C (svarende til 7-9 hr embryoer ved 25 ° C, trin 12). Efter dechorination blev EPS behandling gjort (1:40 i MBIM i 1 min) efterfulgt af inkubation iCY5 farvestof (50 uM i MBIM-T i 15 min) sammen med methylkviksølv (50 uM MeHg, panel B) eller DMSO solvent kontrol (0,1% slutkoncentration, Panel A). Embryoer blev vasket med MBIM-T og anbringes i en udvikling kurv med MBIM: M3 medium i reservoiret og ældet i yderligere 8 timer ved stuetemperatur. Embryoner blev derefter fikseret i et to-fase 4% paraformaldehyd-heptan forberedelse af en standard-protokol 14. Farvning blev udført med anti-fasciclin II (grøn i A, B og hvid A ', B') til at mærke motorneuroner og anti-elav antistoffer (rødt i A, B) at mærke alle neuron cellelegemer. CY5 farvestof er afsløret ved direkte fluorescens, som kræver forlænget eksponering på grund af nedsat fluorescens intensitet på grund af fiksering (CY5 er pseudo-farvet blå i alle paneler). Virkningerne af MeHg ses i uregelmæssige mønster og clustering af de laterale chordotonal neuron celle organer (elav-positive, mærket i rødt og betegnet med hvide pile i B versus A). Desuden er en karakteristisk forgrening af segmental (SN) (solide grønne pile i A ') ses at være meget varierende med MeHg eksponering (solide grønne pile i B ") i overensstemmelse med tidligere rapporterede effekter af MeHg på embryo 15.. Fremskrivning af intersegmental og segmentær nerverne ved deres rødder ses at blive forskudt bagud med MeHg eksponering (åben grøn pil i B «). Bemærk: Methylkviksølv er en potent nervegift. Der bør udvises omhu for at bære handsker og beskyttelsesbriller ved håndtering. Bortskaffelse bør ske gennem en institutionel miljøsikkerhed facilitet og service.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ovennævnte metode skitserer et middel til at opnå levedygtige Drosophila embryoner, der er tilgængelige for små molekyle behandlinger på tværs af en bred udviklingsmæssige område. Denne metode introducerer romanen og enkle konstatering, at aldrende embryoner ved 18 ° C muliggør permeabilisering af embryoer sent med det samme effekt som tidligere set kun i embryoer tidligt. Desuden har anvendelsen af langt rødt farvestof CY5 carboxylsyre som en indikator permeabilitet vist sig effektive i post-lave applikationer og ikke interfererer med traditionelle røde og grønne fluorescerende markører, der kan anvendes til at afsløre udviklingsmæssige fænotyper. Disse resultater væsentligt fremme effektivitet og anvendelighed af EPS-metoden.
Denne metode er modtagelig for analyser af både levende og faste præparater embryo. Brug lysfelt mikroskopi og slide kammer sat op, typiske træk at score i den første halvdel af embryo udvikling er morfogenetiske bevægelser såsomcellularization af blastoderm, cephalic fure dannelse, germband forlængelse og germband tilbagetrækning 1.. Med GFP eller RFP reportere mere specifikke endepunkter kan skelnes, fx tidlig segmentering mønstre og dannelse af neurale strukturer i senere udvikling 1. GFP og RFP rapporter også muliggøre observation af udviklingsmæssige begivenheder i levende permeabiliserede embryoner i både slide kammeret og udviklingsmæssige basket præparater. En simpel metode til at bestemme grov toksicitet en anvendt lægemiddel eller kemisk er at overvåge mønster af æggeblomme protein auto-fluorescens i den blå kanal til at bestemme en forsinkelse eller ophør af udvikling 1.
EPS metode har også stort potentiale for at udvide de efterforskningsmæssige værktøjer til ikke-model insekter, især myg, som deler en lignende arkitektur æggeskallen. Anvendelse af små molekyler til embryoner af andre insektarter ville åbne en allé af investigatiom, hvor standard genetiske tilgange til funktionelle undersøgelser er i øjeblikket mangler. Embryoner udviklet i kurve kan behandles for formaldehyd fiksering, derfor åbner analyser til den brede vifte af immunfarvning reagenser til rådighed for Drosophila studier. Dette trin forudsætter dog, at en post-fix bestemmelse af permeabilisering være muligt at korrelere fænotyper med embryoner, der var blevet gjort tilgængelige for lægemidlet. Anvendelse af CY5 carboxylsyre farvestof har vist sig meget effektivt til denne fremgangsmåde. CY5 carboxylsyre er effektivt taget op i permeabiliserede embryoner (figur 3a). Under udviklingen CY5 er koncentreret i æggeblommen, som i sidste ende er afsondret i lumen af den formende tarmen ved trin 14 og senere (figur 3B). Efter fiksering er CY5 fluorescens faldet markant, men pålideligt detekterbar i tarmen og fungerer som en markør for de embryoer, der var effektivt permeabiliseret i starten (se repræsentative opl.ult figur 4). Det skal bemærkes, at CY5 detektion på nuværende tidspunkt kræver længere kamera eksponering (fx, 1-4 sekunder) for detektion. Således kan scoring af fænotyper med immunofarvning mønstre videre ved hjælp CY5 signal at bekræfte tilsvarende permeabiliserede embryoner sammen med vævsspecifikke markører (f.eks neurale specifikke antistoffer ses i figur 4).
Den største udfordring i denne metode er den følsomhed levedygtighed foster til permeabilization proces, noget der længe har plaget tidligere forsøg på at udvikle denne metode 9,10,16. Levedygtighed efter permeabilisering er markant aldersafhængig, og stiger drastisk jo ældre fosteret er over permeabilization 9. Men som vi har vist tidligere, bliver stadig vanskeligere med alderen 1 permeabilitet. En nylig rapport viser nu mulighed for at permeabilisere sene embryoner (stadie 14) ved at re-påberåbe heptane som opløsningsmiddel i forbindelse med d-limonen 17. Den brede anvendelighed af denne sidstnævnte metode er ikke klart, da kun ét stof effekt blev karakteriseret (nocodazol) og anvendelse på tidligere stadier embryoner ikke blev beskrevet 17. Endvidere, anvendelsen af trin C udvikling 18 ° skitseret ovenfor udbytter sent permeabilitet og yderligere undgår anvendelse af toksiske organiske opløsningsmidler. Investigator der er ny i EPS-protokollen vil opleve variation i permeabilisering og levedygtighed resultater ved første forsøg. Trinene her giver undersøgeren redskaber til systematisk at variere betingelserne for permeabilisering behandlinger og efterfølgende inkubationstrinnene at optimere betingelserne for specifikke stammer af Drosophila de arbejder i deres eget laboratorium indstilling.
En yderligere udfordring med metoden er den variation i den kemiske optagelse set fra foster til foster. Denne variabilitet afspejles i heterogenitetCY5 farvestofoptagelse ses i embryoner umiddelbart efter farvestof behandling (figur 3A). I modsætning hertil Rhodamin B farvestof er hurtigere og mere jævnt fordelt over de embryonale væv end CY5 farvestof (figur 2B "). Således kan nogle embryo-til-embryo variabilitet blive næret i distributions egenskaber af kemiske, lægemiddel eller toksin af interesse og er uløseligt forbundet med metoden. Når kvantificering af dosis er kritisk, anbefales det, at optagelsen af lægemidlet eller toxin af interesse er kendetegnet ved en alternativ analysemetode. Ikke desto mindre, den lethed af ovennævnte protokol, og evnen til at screene hundredvis af embryoner, tillader investigator at evaluere dosisreaktionerne og score karakteristiske fænotyper med lidt investering af ressourcer, hvilket giver en stærk første tilgang til karakteristiske stoffer eller toksiner i dette højt udviklede modelsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25 mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu,, Reinitz, J.
- Kopczynski, C. C., et al. A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).
- Bejsovec, A., Chao, A. T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation. Development. 139, 690-698 (2012).
- Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens. Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).
- Delubac, D., et al. Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection. Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).
- Mahowald, A. P. Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos. Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).
- Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes. Cryobiology. 29, 210-239 (1992).
- Arking, R., Parente, A. Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique. The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).
- Li, J. S., Li, J. Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).
- Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos. Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).
- Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, Academic Press. San Diego. 518 (1994).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. Methods in Cell Biology. 44, Academic Press. 445-487 (1994).
- Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster. Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).
- Limbourg, B., Zalokar, M.
- Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos. Fly (Austin). 7, (2013).
