Summary
Introduction de petites molécules à l'embryon de drosophile en développement offre un grand potentiel pour la caractérisation de l'activité biologique des nouveaux composés, des médicaments et des toxines ainsi que pour sonder les voies fondamentales de développement. Procédés décrits ici donnent un aperçu des mesures qui surmontent les barrières naturelles de cette approche, l'expansion de l'utilité du modèle de l'embryon de drosophile.
Abstract
L'embryon de drosophile a longtemps été un modèle de laboratoire puissant pour élucider les mécanismes moléculaires et génétiques qui contrôlent le développement. La facilité de manipulations génétiques avec ce modèle a supplanté les approches pharmacologiques qui sont monnaie courante dans d'autres modèles animaux et les tests cellulaires. Nous décrivons ici des progrès récents dans un protocole qui permet l'application de petites molécules à la mouche des fruits en développement embryonnaire. La méthode détails des mesures pour surmonter l'imperméabilité de la coquille tout en maintenant la viabilité des embryons. Coquille d'oeuf perméabilisation dans un large éventail de stades de développement est réalisée par application d'un embryon précédemment décrit d-limonène solvant perméabilisation (EPS 1) et par le vieillissement des embryons à température réduite (18 ° C) avant les traitements. En outre, on utilise un colorant rouge lointain (CY5) en tant qu'indicateur de perméabilisation est décrite, ce qui est compatible avec des applications en aval impliquant grippe rouge et vert standardcolorants orescent dans des préparations en direct et fixes. Ce protocole est applicable à des études utilisant des composés bioactifs pour sonder les mécanismes de développement ainsi que pour des études visant à évaluer l'activité tératogène ou pharmacologique de petites molécules non caractérisés.
Introduction
L'embryon de drosophile continue d'être un modèle de choix pour l'étude des mécanismes fondamentaux du développement 2. Ce modèle puissant est supporté par un large éventail d'outils génétiques moléculaires qui permettent des manipulations de quasiment n'importe quel gène à n'importe quel point dans le temps et dans le développement de n'importe quel organe. La petite taille, le développement rapide et une caractérisation de la morphogenèse de l'embryon de drosophile en font un modèle de choix pour les écrans génétiques, dont beaucoup ont découvert voies fondamentales de développement 3,4. De nombreux phénotypes dans l'embryon de drosophile ont été caractérisés et sont facilement interprétables, offrant souvent un moyen d'identifier les mécanismes génétiques moléculaires sous-jacents responsables d'un trait anormal.
Par le passé, un inconvénient du modèle d'embryon de mouche a été la difficulté d'introduire de petites molécules à des tissus embryonnaires. Cet obstacle a posé des limites à: 1) nousment connus petites molécules bioactives comme sondes d'interroger les mécanismes de développement et 2) l'utilisation de ce modèle mis en place pour évaluer l'activité tératogène ou pharmacologique de petites molécules non caractérisés. En conséquence, le potentiel de dépistage de l'embryon de mouche a été sous-utilisé dans la caractérisation de l'activité de petites molécules.
Livraison de petites molécules à l'embryon à la mouche peut être réalisé selon deux méthodes: 1) perméabilisation de la coquille d'oeuf et 2) la micro-injection. Cet article présente les progrès de la méthode de perméabilisation qui sont faciles à exécuter dans le cadre d'un laboratoire de Drosophila classique. Il convient de noter que les progrès récents dans les méthodes de micro-injection avec la technologie microfluidique contribue également à des méthodes d'introduction de composés de 5,6 sur l'embryon. Introduire des molécules de l'embryon est empêché par une couche de cire de la coquille 7. La coquille drosophile se compose de cinq couches. À partir del'intérieur vers l'extérieur, ils sont: la membrane vitelline, la couche de cire, la couche intérieure chorionique, la endochorion et la exochorion 8. Les trois couches choriales extérieures peuvent être éliminées par une brève émersion de l'embryon dans la javel, une étape appelée dechorionation. La couche cireuse exposé peut ensuite être compromise par l'exposition à des solvants organiques, tels que l'heptane et l'octane 7,9, ce qui rend l'embryon dechorionated perméable, alors qu'il reste enfermé dans la membrane vitelline sous-jacent. Cependant, l'utilisation de ces solvants introduit des complications en raison de leur toxicité et de la difficulté à réglementer leur action de perméabilisation forte, qui ont tous deux des effets négatifs sur la viabilité des embryons Stark 9,10.
Une méthode de perméabilisation utilisant une composition appelé embryon perméabilisation solvant (EPS) a été décrit précédemment 1. Ce solvant est constitué de d-limonène et les tensioactifs d'origine végétale qui permettent au solvant d'être miscible avec des tampons aqueux. La faible toxicité du d-limonène et de la capacité de diluer le solvant à des concentrations désirées a donné une méthode efficace pour générer des embryons perméables avec une viabilité élevée. Cependant, deux facteurs endogènes ont continué à apporter des limitations à l'application. Tout d'abord, les embryons montrent l'hétérogénéité de la perméabilité après le traitement EPS, même lorsque l'on prend soin de maintenir la mise en scène de développement à proximité. Deuxièmement, des embryons âgés de plus de huit heures environ se sont avérés difficiles à perméabiliser, conformément à un durcissement de la coquille qui se produit après la ponte 11.
Décrit ici sont les progrès de la méthode EPS que: 1) aider à identifier et analyser les embryons quasi-identique perméabilisées, même après fixation et immunomarquage étapes ont été exécutées et 2) permettre la perméabilisation des embryons à la fin des points de temps de développement (> 8 h, stade 12 ans et plus). Plus précisément, l'application d'un colorant rouge lointain,CY5 acide carboxylique, est décrite qui sert d'indicateur de la perméabilité, qui persiste dans l'embryon au cours du développement et de formaldéhyde, après fixation. En outre, il est démontré que l'élevage des embryons à 18 ° C maintient la coquille dans un état sensible EPS, permettant perméabilisation des embryons à un stade avancé (stades 12-16).
Ces progrès surmonter les limitations mentionnées ci-dessus à la méthodologie des EPS. Cette application va donc fournir aux enquêteurs un moyen d'introduire de petites molécules d'intérêt à l'embryon à des moments distincts de développement tout en maintenant la viabilité.
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Protocol
1. Préparation des cultures Fly, Solutions et périphériques embryon de manutention
- Préparer une culture de la cage de la drosophile. Placez 500 vol + accouplement de la souche souhaitée dans une cage de la population équipée d'une plaque de raisin-agar 10 cm et une tache de pâte de levure. Maintenir la culture dans un incubateur à 25 ° C contrôlée d'humidité. Remarque: cultures Cage besoin un jour ou deux de conditionnement pour obtenir des motifs de l'embryon pose cohérentes. plaques de raisin avec de la pâte de levure sont changés une fois le matin et une fois le soir au cours du conditionnement.
- Préparer EPS. Solutions chaudes de tensioactifs (cocamide DEA et d'alcool éthoxylé) à 37 ° C. Introduire à la pipette 18 ml de d-limonène à un flacon à scintillation en verre équipé d'un petit barreau d'agitation. Introduire à la pipette 1 ml de chacun des deux agents tensio-actifs (à 5% de concentration finale de chaque) à la d-limonène. Mélanger soigneusement et enlever une barre d'agitation. NOTE: Cette solution mère de EPS est bon pour environ 2 mois à température ambiante. La solutiondoit être réchauffé à 37 ° C et tourbillonné pour solubiliser entièrement les tensioactifs avant l'utilisation. EPS et le d-limonène doivent être stockés dans un récipient en verre où ils se dissoudront au cours du temps certains plastiques.
- Préparer la solution embryon dechorionation, médiums d'incubation, colorant et solutions médicamenteuses. Mélanger 25 ml d'eau de Javel avec 25 ml H 2 O et le placer dans un plat peu profond. Préparer milieu modifié de base d'incubation (MBIM) et MBIM-T selon la recette avant de 1,12. Préparer Shields et Sang M3 milieu de culture cellulaire et PBS selon le protocole du fabricant (voir liste matériaux). Préparer une solution stock de perméabilisation colorant à 10 mM dans le DMSO concentration.
- Assembler les appareils et fournitures embryon de manutention:
- Préparer dechorionation et panier de traitement des EPS (voir la figure 1A). Coupez une section de 3 cm d'un 50 ml polypropylène centrifugeuse / tube de culture jetable avec une scie à dents fines. Rendre la surface soudage chasse par le frottement de la section de tube sur du papier de verre colléà une surface de paillasse. Souder la section de tube à mailles de nylon Nitex par fusion de la jante de la section de tube à la flamme et en appuyant sur le maillage sur une plaque de verre. Laisser refroidir et couper en maille supplémentaire. REMARQUE: Les parois verticales et le fond permettent de rinçage rapide et complète de l'eau de Javel et EPS résiduelle aux étapes respectives. Les étapes de soudage doivent être effectuées sous une hotte.
- Préparer un panier de développement. Couper la partie supérieure d'une centrifugeuse / tube de culture de 50 ml en affleurement avec le bord de la calotte. Retirer le bouchon et modifier par découpe d'une ouverture centrale et des encoches le long de la jante comme sur la figure 1B. Visser le bouchon sur le maillage et sur les filets de la section de tube coupé et couper maille supplémentaire. NOTE: Le capuchon comporte des encoches dans le bord qui permet la diffusion dans le milieu en vrac lorsqu'il est positionné dans le réservoir de lave de 60 mm (figure 1B).
- Préparation des pièces d'une chambre de lame. Coupez un carré de membrane DO qui est plus grand quela chambre ouverture de diapositives. Appliquer une fine couche de graisse à vide à l'intérieur de la lèvre de l'ouverture. Fixez la membrane DO dans l'ouverture qu'il étanchéité contre la graisse avec la bague de retenue. Coupez membrane DO excès en le coupant de retour près de l'anneau de retenue. REMARQUE:. Spécifications pour la chambre de coulissement peuvent être trouvés dans Kiehart et al 13 Cette chambre n'est pas disponible dans le commerce et nécessite la fabrication sur mesure par un atelier d'usinage.
2. Staging, dechorionation, et le traitement des embryons EPS
- Mise en scène embryons par collection chronométré. Définir une plaque raisin / levure fraîche à la volée culture cage dans l'AM. Permettre embryons à poser pendant 1 heure à 25 ° C. Jeter cette plaque et la remplacer par une plaque raisin / levure fraîche pour un embryon pose ultérieure de 2 heures à 25 ° C. Recueillir cette plaque et le lieu dans 18 ° C incubateur pour de plus amples mise en scène du développement. REMARQUE: 1 heure de développement à 25 ° C est égale à 2 h du développementà 18 ° C. L'effet du vieillissement à 18 ° C contre 25 ° C sur le maintien de perméabilisation EPS dans des embryons de stade tardif peut être vu sur la figure 2.
- Dechorionation. Rincer délicatement les embryons hors de la plaque de raisin dans le panier de la maille à 25 ° C l'eau du robinet et un pinceau. Rincer excès de levure à partir des embryons dans le panier sous un léger courant d'eau du robinet. Plongez le panier dans l'eau de Javel à 50% pendant 2 min. Laver soigneusement les embryons sous un courant d'eau du robinet. REMARQUE: gicler doucement solution d'eau de Javel sur les embryons par intermittence en utilisant une pipette en plastique. Alors que 2 minutes est généralement suffisant pour dechorionation complète, ce temps d'incubation doit être vérifiée par examen direct et ajusté en conséquence. Maintenir embryons dechorionated dans le panier immergé dans l'eau du robinet et de procéder immédiatement à l'étape EPS.
- Traitement EPS
- Préparer six plats de 60 mm avec environ 10 ml de PBS dans chaque. Préparer la dilution EPS en dissolvant 75 EPS ul dans 2,925 ml MBIM (01h40) dans un bécher de 50 ml en verre avec tourbillonnant. Note: blanc forme une émulsion du mélange.
- Éponger l'eau en excès à partir du fond du panier à mailles avec une lingette laboratoire. Plongez panier en EPS diluées dans le bécher et agiter de se disperser immédiatement embryons dans la solution EPS dans le fond du panier. Continuer mouvement tourbillonnant pendant 30 sec. REMARQUE: dilutions EPS et des temps d'exposition peuvent être modifiées pour contrôler la perméabilité. Il est recommandé que les dilutions optimales de SPE et les temps de traitement sont établies de façon empirique avec des souches de mouches utilisés. L'augmentation du temps d'exposition à 60-90 sec est favorable pour l'étape 12 et embryons âgés.
- Retirer le panier, efface loin EPS excès avec un laboratoire essuyer. Procéder à six lavages successifs dans 10 ml de PBS dans les boîtes de 60 mm. Utiliser une pipette en matière plastique à injecter embryons doucement avec du PBS dans chacun des six lavages. Passez à teindre et les étapes de traitement de la toxicomanie. Remarque: EPS peuvent être jetés dans l'évier.
3. Dye et traitement de la toxicomanie de perméabilisées embryons
- Traitement colorant
- Ajouter 5 ul de 10 mM CY5 colorant acide carboxylique * à 1 ml de MBIM-T (50 uM de concentration finale) dans un tube à centrifuger de 1,5 ml et vortex pour mélanger. NOTE: * Choix du colorant dépend de l'analyse en aval. Acide carboxylique CY5 est efficace pour des analyses ultérieures utilisant fixation et immunologique. Rhodamine B est utile pour l'analyse des embryons vivants. L'émission rouge de la rhodamine B, et l'émission dans le vert de ses métabolites 1, peuvent présenter des complications avec des applications en aval par fluorescence. Médicament ou une toxine peuvent être ajoutés à la solution de colorant pour initier un traitement à ce stade, ou pour limiter le traitement de médicament / de la toxine à une impulsion à ce stade. Des précautions doivent être prises pour gérer et disposer de médicaments et de toxines selon la fiche signalétique et des normes de sécurité environnementale.
- Transférer les embryons dans le panier grillagé de la solution de colorant à l'aide d'un pinceau. Boucher le tube et inverser plusieurs fois pour assurer laembryons flottent librement en suspension dans la solution de colorant. Placer le tube sur une bascule de nutation pendant 15 min à température ambiante.
- Retirer le tube du nutator et permettent de régler les embryons. Retirer la solution de colorant avec une pipette fine et la remplacer par 1 ml de MBIM-T à laver. Inverser le tube pour remettre en suspension les embryons complètement. Laissez embryons à s'établir et à répéter avec trois lavages MBIM-T. Retirez tous les MBIM-T de rinçage final et passer à l'étape d'incubation.
- Incubation de l'embryon développement
- Transfert d'embryons à l'une des deux chambres: Le panier de développement ou la chambre de coulissement. REMARQUE: Le panier de développement est préféré pour des périodes de développement plus longs, et est nécessaire si fixation et immunomarquage étapes suivantes sont à exécuter. La chambre de coulissement est optimal pour une résolution plus élevée imagerie time-lapse et est plus efficace pour de courtes périodes de développement (par exemple, les événements embryonnaires). Médicament ou une toxine peuvent être ajoutées au milieu à différentes concentrations et d embryonéveloppement peut être contrôlé en temps réel avec des embryons vivants ou à un point de terminaison à l'aide de fixation standard et immunohistochimique protocoles.
- Développement dans Paniers
- Nettoyer un panier de développement en injectant 70% d'éthanol, rincer abondamment avec de l'eau déminéralisée et sécher avec laboratoire essuyer. Préparer 6 ml de milieu d'incubation à une concentration souhaitée du médicament ou une toxine. Placez le panier de développement en moyenne 60 mm prise de plat soin de ne pas de bulles d'air piège sous le sommier. REMARQUE: Deux médias sont couramment utilisés: MBIM seul, ou MBIM/M3 dans un mélange 50:50, ce dernier étant plus efficace pour des périodes de développement plus longs.
- Transfert d'embryons perméabilisées à maille surface dans la base de panier avec un pinceau. Gicler doucement les embryons avec les médias du réservoir environnante. Disperser les embryons avec le pinceau de sorte qu'ils se trouvent dans une monocouche sur le maillage. Remarque: Passez à l'imagerie microscopique et évaluer les caractéristiques de perméabilisation et la viabilité de la pra séparation (voir l'étape 4).
- Développement à la Chambre de diapositives
- Inverser chambre de coulissement et appliquer un petit cordon de graisse à vide sur le pourtour de l'ouverture. Placez 150 pi de milieu avec la quantité désirée de médicament ou une toxine sur la surface de la membrane DO dans l'ouverture. REMARQUE: Deux médias sont couramment utilisés: MBIM seul, ou MBIM/M3 dans un mélange 50:50, ce dernier étant plus efficace pour des périodes de développement plus longs.
- Transfert d'embryons perméabilisées à la baisse de médias avec un pinceau. Disperser les embryons rendant déposent sur la membrane dans la chute.
- Appliquer soigneusement une lamelle circulaire de 25 mm sur l'ouverture aplatissement ainsi le milieu. Presser doucement le long du périmètre de la lamelle couvre-objet pour former un joint avec la graisse. Remarque: Procéder à la microscopie imagerie pour évaluer les caractéristiques de perméabilisation et la viabilité de la préparation (voir l'étape 4).
4. Identition de perméabilisées embryons viables
- Identifier les embryons perméabilisées. Observer les embryons sous épifluorescence avec un microscope équipé d'une caméra numérique. Acquérir les images (dans la longueur d'onde bleue de déterminer le profil jaune autofluorescence) de plusieurs domaines à l'aide de microscope fixe et réglages de l'appareil.
- Déterminer la perméabilisation des embryons sur la base de l'intensité de fluorescence relative. Utiliser un microscope stéréoscopique avec une grande distance de travail pour accueillir le panier et pour permettre les manipulations des embryons. Le microscope doit être équipé d'une platine XYZ programmable, un éclairage à épifluorescence et d'une caméra numérique. L'image des embryons en prenant soin d'enregistrer l'exposition et les paramètres de position de scène de chaque image de l'embryon pour permettre la réévaluation des mêmes embryons à un moment ultérieur (voir résultat représentatif de la figure 3). Remarque: Les schémas de la montée du colorant peut varier en fonction du colorant utilisé, la durée de l'exposition et de l'âge de l'embryon. Une large gammede l'absorption de colorant à travers une seule préparation est typique et reflète la variation du degré de perméabilisation.
- Identifier les embryons viables. Après la position d'embryons perméabilisées marquage, continuer avec le développement de l'embryon à la température ambiante ou 25 ° C. Panier ou chambre de coulissement Retour à microscope. Observer en fluorescence du canal de bleu et d'acquérir l'image de jaune autofluorescence dans les embryons perméabilisées précédemment identifiés. Évaluer la viabilité selon la progression normale de la distribution de jaune (voir Rand et al. 1 et résultat représentatif de la figure 3). Remarque: D'autres caractéristiques morphologiques de l'embryon observé en microscopie en fond clair peuvent être utilisées pour évaluer la viabilité. Il est recommandé d'établir le niveau de perméabilité qui est compatible avec la viabilité être déterminée de manière empirique avec chaque colorant et de la souche de mouche utilisée.
- Évaluer les effets de la drogue ou à toxines dans les embryons viables perméabilisées.
- Embryons procéduressed avec le protocole ci-dessus sont prêts pour un certain nombre de classiques analyses découlant à la drogue ou l'exposition aux toxines. Plusieurs des différents types d'analyses sont pris en compte dans la discussion ci-dessous et comprennent l'observation directe de la morphogenèse des embryons vivants ainsi que des analyses post-fixation immunologique. Ces deux approches sont renforcées par l'utilisation de colorants vitaux (par exemple, GFP) qui révèlent des profils d'expression de gènes et la lignée cellulaire et les profils de morphologie.
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Representative Results
dispositifs de manipulation de l'embryon sont illustrés à la figure 1 pour aider à visualiser les dispositifs de "home-made" pour la manipulation dans les protocoles ci-dessus. Résultats observés dans la figure 2 illustrent l'effet robuste de l'élevage des embryons à 18 ° C sur leur capacité à être perméabilisées par EPS à des stades tardifs de développement. Cette condition est appliquée dans l'étape de protocole 2.1. L'efficacité de la teinture acide CY5 carboxylique pour révéler les divers niveaux de perméabilité typiquement observés dans EPS embryons traités se voit dans la figure 3. La dynamique du développement de la distribution de colorant dans le jaune est également visible dans la figure 3, indiquant un critère utilisé pour évaluer la viabilité , comme décrit dans le protocole étape 4.2. L'utilité du colorant CY5 dans la détermination ultérieure de l'embryon perméabilisation traitement par la toxine, le formaldéhyde et l'immunomarquage fixation est illustrée par le résultat sur la figure 4.
Dispositifs de manutention Figure 1. D'embryons pour la méthode EPS. Le panier à fond plat est utilisé dans dechorination et EPS étapes d'exposition (A, A '). Le panier de développement est utilisé pour des expositions plus longues développement de l'embryon perméabilisée (B, B '). La chambre de coulissement est utilisé pour les expositions de développement plus courts et de plus haute résolution imagerie d'embryons vivants (C, C '. Voir le texte pour une description plus détaillée).
Figure 2. Effet de vieillissement à 18 ° C sur l'efficacité des EPS dans les embryons à un stade avancé. Embryons ont été collectés pendant deux heures suivi par un vieillissement à 18 ° C pendant 20 heures (panneaux AA »,
Figure 3. Incorporation de CY5 embryons perméables et viables. Embryons ont été collectés à 25 ° C pendant 2 heures et vieilli pendant 14 heures à 18 ° C (équivalent à 7-9 embryons h à 25 ° C, étape 12). Après dechorination, EPS traitement a été effectué (01:40 en MBIM pendant 1 min) suivi d'une incubation à CY5 colorant (50 uM dans MBIM-T pendant 15 minutes). Les embryons ont été lavés trois fois dans MBIM-T et transférés dans le panier avec MBIM développement dans le réservoir. Développement a été autorisé à procéder pendant 8 heures à la température ambiante. L'absorption de CY5 (rouge) est imagé dans le canal rouge lointain immédiatement après le traitement de teinture et lavage (Groupe A) et après 8 heures de développement (Groupe B). Répartition de la jaune est considéré par autofluorescence dans le canal bleu. absorption de colorant, d'où la perméabilité, on voit varier de l'embryon à l'embryon. CY5 colorant (rouge) est considéré à localiser au jaune (bleu), qui devient concentré à la lumière de l'intestin à l'étape 16 (violet, partie B).
Figure 4. Détermination de la perméabilisation et méthylmercure effets dans les embryons fixes et immunocolorées. Embryons ont été collectés à 25 ° C pendant 2 heures et vieilli pendant 14 heures à 18 ° C (équivalent à 7-9 embryons h à 25 ° C, étape 12). Après dechorination, traitement des EPS a été fait (01h40 en MBIM pendant 1 min) suivie d'une incubation dansCY5 colorant (50 uM dans MBIM-T pour 15 min) avec le méthylmercure (MeHg 50 uM, partie B) ou du DMSO contrôle solvant (0,1% de concentration finale, partie A). Les embryons ont été lavés avec MBIM-T et placées dans un panier en développement avec MBIM: milieu M3 dans le réservoir et vieilli pendant 8 heures supplémentaires à la température ambiante. Les embryons ont ensuite été fixées dans une diphasique 4% de paraformaldéhyde-heptane préparation par un protocole standard 14. La coloration a été réalisée avec anti-fascicline II (vert en A, B et blanc en A ', B') pour étiqueter les neurones moteurs et des anticorps anti-ELAV (rouges en A, B) à étiqueter tous les corps cellulaires des neurones. CY5 colorant est révélée par fluorescence directe, qui nécessite une exposition prolongée en raison de l'intensité de fluorescence diminuée en raison de la fixation (CY5 est pseudo-couleur bleu dans tous les panneaux). Les effets du MeHg sont vus dans la structuration irrégulière et clusteanneau des corps cellulaires des neurones chordotonal latéraux (ELAV positif, marquées en rouge et désignées par des flèches blanches dans B par rapport à A). En outre, une ramification caractéristique du segment (SN) (flèches vertes solides en A ') est considérée comme très variable avec l'exposition au MeHg (flèches vertes solides B ") en accord avec les effets signalés précédemment, du MeHg sur l'embryon 15. Projection du intersegmentaire et segmentaire des nerfs au niveau de leurs racines sont vus pour être déplacé en arrière, avec l'exposition au MeHg (ouvert flèche verte en B '). Remarque: Le méthylmercure est un neurotoxique puissant. Il faut prendre soin de porter des gants et des lunettes de protection lors de la manipulation. L'élimination doit être effectuée par un dispositif de sécurité de l'environnement institutionnel et de service.
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Discussion
Le procédé ci-dessus décrit un moyen d'obtenir des embryons de drosophile viables qui sont accessibles aux petits soins de molécules dans un large éventail de développement. Cette méthode présente le roman et simple constatation que le vieillissement des embryons à 18 ° C permet la perméabilisation des embryons à un stade avancé avec la même efficacité que vu précédemment que dans les embryons à un stade précoce. En outre, l'utilisation de la CY5 colorant rouge lointain acide carboxylique comme un indicateur de perméabilité a prouvé son efficacité dans les applications de post-fix et ne pas interférer avec des marqueurs fluorescents rouges et verts classiques qui peuvent être utilisés pour révéler les phénotypes de développement. Ces résultats avancer de manière significative l'efficacité et l'utilité de la méthode EPS.
Cette méthode se prête à des analyses à la fois la vie et la préparation d'embryons fixes. En utilisant la microscopie en fond clair et la chambre de coulissement mis en place, les caractéristiques typiques de marquer dans la première moitié du développement de l'embryon sont tels mouvements morphogénétiquescellularisation du blastoderme, formation sillon céphalique, l'allongement et la rétraction germband germband 1. Avec GFP ou DP journalistes paramètres plus spécifiques peuvent être discernées, par exemple les modèles de segmentation début et la formation de structures neurales dans le développement ultérieur 1. GFP et RFP rapports permettent également l'observation des événements dans la vie de développement des embryons perméabilisées à la fois dans la chambre de coulissement et panier préparations de développement. Une méthode simple pour déterminer la toxicité d'un médicament brut ou chimique appliquée est de surveiller la configuration de la protéine de jaune d'auto-fluorescence dans le canal bleu pour déterminer un retard ou un arrêt de développement 1.
La méthodologie des EPS a aussi un grand potentiel pour élargir les outils d'investigation pour les insectes non-modèle, en particulier le moustique, qui partage une architecture similaire de la coquille. Application de petites molécules pour les embryons d'autres espèces d'insectes serait ouvrir une avenue de Investid'où des approches génétiques classiques à des études fonctionnelles font actuellement défaut. Embryons développés dans des paniers peuvent être traitées pour le formaldéhyde fixation, donc l'ouverture des analyses à la vaste gamme de réactifs d'immunomarquage disponibles pour des études chez la drosophile. Toutefois, cette étape nécessite qu'une détermination post-dose de perméabilisation être possible d'établir une corrélation entre les phénotypes avec des embryons qui avaient été rendus accessibles à la drogue. Application de colorant acide carboxylique CY5 s'est avéré très efficace pour cette approche. Acide carboxylique CY5 est efficacement prise en embryons perméabilisées (figure 3A). Au cours du développement CY5 est concentrée dans le jaune d'oeuf, qui est finalement séquestré dans le lumen de l'intestin, à l'étape de formage 14 et par la suite (figure 3B). Après fixation, CY5 fluorescence est nettement diminué, mais de façon fiable détectable dans l'intestin et sert de marqueur de ces embryons qui ont été perméabilisées efficacement au début (voir res représentativesult figure 4). Il convient de noter que la détection du CY5 à ce stade nécessite de plus longues expositions caméra (par exemple, 1 à 4 secondes) pour la détection. Ainsi, le ballon de phénotypes avec des motifs d'immunomarquage peut se dérouler en utilisant le signal de CY5 pour confirmer embryons perméabilisées de manière similaire avec des marqueurs spécifiques de tissus (par exemple, des anticorps spécifiques de neurones vus sur la figure 4).
Le plus grand défi de cette méthode est la sensibilité de la viabilité des embryons au processus de perméabilisation, quelque chose qui a longtemps troublé les tentatives antérieures pour développer cette méthode 9,10,16. Viabilité après perméabilisation dépend de l'âge nettement, et augmente considérablement le plus l'embryon est sur perméabilisation 9. Pourtant, comme nous l'avons montré précédemment, la perméabilité devient de plus en plus difficile avec l'âge 1. Un rapport récent montre maintenant la possibilité de perméabiliser les embryons à un stade avancé (stade 14) par l'hépatite ré-invoquertane comme solvant conjointement avec le d-limonène 17. La grande utilité de cette dernière méthode n'est pas clair comme un seul effet de la drogue a été caractérisée (nocodazole) et l'application d'embryons au stade antérieures n'a pas été décrite 17. En outre, l'application de l'étape de développement de 18 ° C décrite ci-dessus rendements perméabilité de stade tardif et en outre d'éviter l'utilisation de solvants organiques toxiques. L'enquêteur qui est nouveau pour le protocole EPS connaîtra variabilité dans perméabilisation et la viabilité des résultats sur les premières tentatives. Les étapes décrites ici donnent l'enquêteur les outils pour varier systématiquement les conditions de traitements de perméabilisation et étapes d'incubation suivantes pour optimiser les conditions de souches spécifiques de la drosophile ils travaillent dans leur propre laboratoire.
Une difficulté supplémentaire avec la méthode est la variabilité de l'absorption chimique connu de l'embryon à l'embryon. Cette variabilité se traduit par l'hétérogénéité deCY5 absorption de colorant visible dans les embryons immédiatement après le traitement de teinture (Figure 3A). En revanche, la rhodamine B colorant est plus rapidement et uniformément dispersés dans les tissus embryonnaires de CY5 colorant (figure 2B "). Ainsi, une certaine variabilité de l'embryon à l'embryon peut être hébergé dans les propriétés de diffusion de la substance chimique, un médicament ou une toxine d'intérêt et est inhérente à la méthode. Lorsque la quantification de dose est critique, il est recommandé que l'absorption du médicament ou une toxine d'intérêt est caractérisé par une méthode d'analyse alternative. Néanmoins, la facilité du protocole ci-dessus, et la capacité de filtrer des centaines d'embryons, permet à l'enquêteur d'évaluer les réponses de dose et marquer phénotypes caractéristiques avec peu d'investissement des ressources, ce qui pour une première approche puissante pour les médicaments qui caractérisent ou de toxines dans ce très développé système modèle.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25 mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu,, Reinitz, J.
- Kopczynski, C. C., et al. A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).
- Bejsovec, A., Chao, A. T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation. Development. 139, 690-698 (2012).
- Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens. Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).
- Delubac, D., et al. Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection. Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).
- Mahowald, A. P. Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos. Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).
- Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes. Cryobiology. 29, 210-239 (1992).
- Arking, R., Parente, A. Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique. The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).
- Li, J. S., Li, J. Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).
- Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos. Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).
- Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, Academic Press. San Diego. 518 (1994).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. Methods in Cell Biology. 44, Academic Press. 445-487 (1994).
- Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster. Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).
- Limbourg, B., Zalokar, M.
- Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos. Fly (Austin). 7, (2013).
