Summary
מבוא של מולקולות קטנות לעובר דרוזופילה הפיתוח מציע פוטנציאל גדול לאפיון פעילות ביולוגית של תרכובות רומן, סמים ורעלים כמו גם לחיטוט מסלולים התפתחותיים בסיסיים. שיטות שתוארו במסמך זה מתארים את שלבים שלהתגבר על מחסומים טבעיים לגישה זו, המרחיב את התועלת של מודל עובר דרוזופילה.
Abstract
עובר דרוזופילה כבר זמן רב מודל מעבדה רב עוצמה להבהרת מנגנונים מולקולריים וגנטיים המפקחים על פיתוח. הקלות של מניפולציות גנטיות עם המודל הזה החליפו גישות תרופתי כי הם דבר שבשגרה במודלים של בעלי חיים אחרים ומבחנים מבוססי תאים. כאן אנו מתארים ההתקדמות בפרוטוקול המאפשר יישום של מולקולות קטנות לעובר זבוב הפירות הפיתוח. השיטה מפרטת צעדים כדי להתגבר על האטימות של קליפת הביצה, תוך שמירה על כדאיות עובר. permeabilization קליפת הביצה על פני מגוון רחב של שלבי התפתחות מושגת על ידי יישום של permeabilization שתואר קודם לכן d-limonene עובר ממס (EPS 1) ועל ידי עוברי הזדקנות בטמפרטורה נמוכה (18 ° C) לפני טיפולים. בנוסף, שימוש בצבע מרחיק אדום (Cy5) כאינדיקטור permeabilization מתואר, אשר תואם עם יישומים במורד הזרם מעורבים שפעת אדומה וירוקה סטנדרטיתצבעי orescent בהכנות בשידור חי וקבועות. פרוטוקול זה הוא ישים למחקרים באמצעות תרכובות ביו לחקור מנגנוני התפתחות, כמו גם למחקרים שמטרתם להעריך את הפעילות טרטוגניות או תרופתי של מולקולות קטנות uncharacterized.
Introduction
עובר דרוזופילה ממשיך להיות מודל המוביל לחקירה של מנגנונים בסיסיים של פיתוח 2. מודל רב עוצמה זו נתמך על ידי מערך רחב של כלים גנטיים מולקולריים המאפשרים מניפולציות של מהות כל גן בכל נקודת זמן ובמסגרת כל איבר מתפתח. הגודל הקטן, התפתחות מהירה, ואפיון המקיף של המורפוגנזה של עובר דרוזופילה להפוך אותו למודל של בחירה עבור מסכי גנטיים, שרבים מהם נחשפו מסלולים התפתחותיים בסיסיים 3,4. פנוטיפים רבים בעובר דרוזופילה אופיינו ולפרש בקלות, לעתים קרובות מתן אמצעים לזיהוי מנגנונים גנטיים מולקולריים שבבסיס אחראי לתכונה חריגה.
מבחינה היסטורית, חסרון של מודל עובר הזבוב היה הקושי בהחדרת מולקולות קטנות לרקמות עובריים. מכשול זה מציב מגבלות על: 1)ing מולקולות קטנות ביו ידועות כמו בדיקות לחקור את מנגנוני התפתחות ו2) שימוש במודל שהוקם זה כדי להעריך פעילות טרטוגניות או תרופתי של מולקולות קטנות uncharacterized. כתוצאה מכך, פוטנציאל ההקרנה של עובר הזבוב כבר לא מנוצל באפיון של פעילות מולקולה קטנה.
משלוח של מולקולות קטנות לעובר הזבוב יכול להיות מושגת בשתי שיטות: 1) permeabilization של קליפת הביצה ו2) microinjection. מאמר זה מציג התקדמות לשיטה של permeabilization, כי הם קלים לביצוע בהגדרה של מעבדה דרוזופילה קונבנציונלית. יצוין, כי ההתקדמות בשיטות microinjection עם טכנולוגית מיקרופלואידיקה תורמת גם היא לשיטות של החדרת תרכובות ל5,6 העובר. היכרות עם מולקולות לעובר הוא למנוע על ידי שכבת שעווה של קליפת הביצה 7. קליפת הביצה דרוזופילה מורכבת מחמש שכבות. מןמבפנים החוצה הם: קרום vitelline, שכבת השעווה, שכבת כוריוני הפנימית, endochorion וexochorion 8. שלוש שכבות כוריוני חיצוניות ניתן להסיר על ידי emersion הקצר של העובר באקונומיקה מהולה, צעד המכונה dechorionation. שכבת השעווה נחשפה אז יכולה להיות בסכנה כתוצאה מחשיפה לממסים אורגניים, כגון heptane ויוקטן 7,9, טיוח את עובר dechorionated חדיר, בזמן שהוא נשאר עטוף בקרום vitelline הבסיסי. עם זאת, שימוש בממסים אלה מציג סיבוכים בשל רעילותם ואת הקושי בויסות פעולתם החזקה permeabilizing, אשר שניהם יש השפעות שליליות מוחלטת על 9,10 כדאיות עובר.
שיטה של permeabilization באמצעות permeabilization עובר הרכב כינה ממס (EPS) כבר תיארתי בעבר 1. ממס זה מורכב מחומרים פעילי שטח D-limonene וצמחי המאפשרים הממס להיות misciblE עם מאגרים מימיים. הרעילות הנמוכה של d-limonene והיכולת לדלל את הממס לריכוזים רצויים הניבה שיטה יעילה ליצירת עוברים חדירים עם כדאיות גבוהה 1. עם זאת, שני גורמים אנדוגני המשיכו להביא מגבלות ליישום. ראשית, עוברים להפגין את ההטרוגניות בחדירות לאחר טיפול EPS, גם כאשר הטיפול נלקח כדי לשמור על היערכות התפתחותיים קרובה. שנית, עוברים מבוגרים יותר משמונה שעות כ הוכיחו קשה permeabilize, עולה בקנה אחד עם התקשות של קליפת הביצה שמתרחשת לאחר הטלת הביצים 11.
שתואר כאן הן התקדמות בשיטת EPS כי: 1) לסייע בזיהוי וניתוח עוברי permeabilized כמעט זהה, גם לאחר צעדי הקיבעון וimmunostaining הוצאו להורג ו2) לאפשר permeabilization של עוברים בנקודות זמן התפתחותיים מאוחרות (> 8 שעות, שלב 12 ומעלה). באופן ספציפי, יישום של צבע מרחיק אדום,חומצה קרבוקסילית Cy5, מתוארת המשמשת כמחוון חדירות, שנמשך בעובר במהלך התפתחות ולאחר קיבוע פורמלדהיד. בנוסף, הוא הראה כי גידול עובר ב18 ° C שומר על קליפת הביצה במצב רגיש EPS, המאפשר permeabilization של עוברים בשלב מאוחר (שלבי 12-16).
מקדמות אלה להתגבר על המגבלות שהוזכרו קודם לכן למתודולוגיה EPS. יישום זה ולכן יספק לחוקרי אמצעי להציג את המולקולות קטנות של עניין לעובר בנקודות זמן התפתחותיים שונים, תוך שמירה על כדאיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תרבויות טוס, פתרונות, ומכשירי טיפול בעובר
- הכן את תרבות כלוב של דרוזופילה. הנח 500 זבובים + הזדווגות של הזן הרצוי במצוידים בצלחת ענבים אגר 10 סנטימטר ומקום של שמרים להדביק כלוב אוכלוסייה. לשמור על התרבות בחממה מבוקרת C לחות 25 °. הערה: תרבויות כלוב דורשות יום או ימים של אוויר, כדי לרכוש דפוסי עובר הנחת עקביים. צלחות ענבים עם שמרים להדביק משתנות פעם בבוקר ופעם בערב באוויר.
- הכן EPS. פתרונות חמים של חומרים פעילי שטח (DEA cocamide ואלכוהול Ethoxylated) ב 37 ° C. פיפטה 18 מיליליטר של d-limonene לבקבוקון נצנץ זכוכית מצויד בבר ומערבב קטן. פיפטה 1 מיליליטר כל אחד משני החומרים פעילי השטח (5% הריכוז סופי של כל אחד) לd-limonene. מערבבים היטב ולהסיר בר ומערבב. הערה: פתרון מניות זה של רווח למניה הוא טוב לכ 2 חודשים בטמפרטורת חדר. הפתרוןיש לחמם על 37 מעלות צלזיוס והסתחרר לsolubilize מלוא שטח לפני השימוש. EPS ו-D-limonene צריך להיות מאוחסן במכל זכוכית כפי שהם יהיו לפזר כמה פלסטיקים לאורך זמן.
- הכן פתרון dechorionation העובר, מדיומים דגירה, צבע ופתרונות בסמים. מערבבים 25 מיליליטר של אקונומיקה עם 25 מיליליטר H 2 O ומקום בצלחת רדודה. להכין מדיום שונה בסיסי דגירה (MBIM) וMBIM-T על פי מתכון שלפני 1,12. הכן ילדס וסאנג בינוני M3 תא התרבות וPBS על פי הפרוטוקול של היצרן (ראה חומרי רשימה). הכן פתרון מניות של צבע permeabilization ב10 מ"מ ריכוז בDMSO.
- להרכיב מכשירי עובר טיפול ובאספקה:
- הכן dechorionation וסל טיפולי EPS (ראה איור 1 א). חותכים את סעיף 3 סנטימטר של צנטריפוגות תרבות צינור חד פעמי 50 מיליליטר פוליפרופילן / עם מסור עדין שיניים. הפוך את סומק ריתוך משטח על ידי שפשוף קטע הצינור על נייר זכוכית דבקלמשטח המעבדתיים. ולד קטע הצינור לרשת ניילון Nitex ידי התכת שולי סעיף הצינור על אש ולחיצה על לרשת על צלחת זכוכית. בואו מגניב ולקצץ את רשת נוספת. הערה: הצדדים ותחתונים העצום לאפשר לשטיפה מהירה ומלאה משל אקונומיקה והרווח למניה שיורית בצעדים המתאימים. צריכה להתבצע פעולות הריתוך מתחת למכסת מנוע קטר.
- הכן את סל פיתוח. חותכים את החלק העליון של צנטריפוגות / תרבות צינור 50 מיליליטר מיושר עם שולי הכובע. להסיר ולשנות את הכובע על ידי חיתוך פתיחה מרכזית וחריצים לאורך השפה כפי שמוצג באיור 1. הברג את הכובע על הרשת ועל האשכולות של סעיף הצינור מנותק ולקצץ רשת נוספת. הערה: הכובע מכיל חריצים בשפה המאפשרות דיפוזיה למדיום בתפזורת כשהוא מוצב בצלחת המאגר 60 מ"מ (איור 1 ב ').
- הכן את מרכיבי תא שקופיות. לחתוך רבוע של קרום לעשות את זה הוא גדול יותר מאשרקאמרי פתיחת השקופית. למרוח שכבה דקה מאוד של שומן ואקום לשפה הפנימית של הפתח. להדביק את קרום DO לתוך הפתח איטומו נגד הגריז עם הטבעת המייצבת. לקצץ קרום DO עודף על ידי קיצוץ אותו קרוב לטבעת המייצבת. הערה:. ניתן למצוא מפרט לקאמרי השקופית בKiehart et 13 אל חדר זה אינו זמין באופן מסחרי ודורש ייצור מותאם אישית על ידי חנות מכונה.
2. Staging, dechorionation, והרוויחו למניה טיפול בעוברים
- Staging עוברים על ידי אוסף מתוזמן. הגדר ענבים / שמרים טרי צלחת לכלוב התרבות לטוס בבוקר. אפשר לעוברים להיות מונחים לשעה 1 ב25 ° C. בטל צלחת זו ולהחליף עם ענבים / שמרים טרי לצלחת הנחת עובר הבאה של שעה 2 ב 25 ° C. לאסוף צלחת זו ומקום ב18 חממת מעלות צלזיוס למשך בימוי התפתחותיים נוסף. הערה: 1 שעות של פיתוח ב ° C25 שווה לשעה 2 בפיתוחב18 ° C. ההשפעה של הזדקנות על 18 מעלות צלזיוס לעומת 25 ° C ב שמירת permeabilization EPS בעוברים בשלב מאוחר ניתן לראות באיור 2.
- Dechorionation. לשטוף בעדינות עוברים מצלחת ענבים לתוך סל רשת באמצעות 25 מים מעלות צלזיוס ברז ומכחול. יש לשטוף את השמרים עודפים מהעוברים בסל מתחת לזרם עדין של מים ברז. לטבול את הסל באקונומיקת 50% למשך 2 דקות. שטוף ביסודיות עובר תחת זרם של מים ברז. הערה: בעדינות להשפריץ פתרון אקונומיקה על העוברים לסירוגין באמצעות פיפטה פלסטיק. בעוד 2 דקות בדרך כלל מספיק עבור dechorionation מלא, זמן דגירה זה צריך להיבדק על ידי בדיקה ישירה ובהתאם. לשמור עובר Dechorionated בסל השקוע במים ברז ולפנות מייד לצעד EPS.
- EPS טיפול
- הכן שש מנות 60 מ"מ עם כ 10 מיליליטר של PBS בכל אחד. הכן את הדילול הרווח למניה על ידי המסת 75 EPS μl ב2.925 מיליליטר MBIM (1:40) בכוס זכוכית מיליליטר 50 עם מתערבל. הערה: צורות תחליב לבנים מתערובת זו.
- כתם מים עודפים מתחתית סל הרשת עם מעבדה לנגב. לטבול את הסל ברווח למניה מדוללת בכוס ומייד מערבולת כדי לפזר עוברים בפתרון EPS בחלק התחתון של הסל. המשך מתערבל בקשה ל30 שניות. הערה: יכולים להיות מגוונים דילולים EPS וזמני חשיפה לשלוט חדירות. מומלץ כי דילולים EPS האופטימלי וזמני טיפול שיוקמו באופן אמפירי עם הזנים של זבובים בשימוש. הגדלת זמן חשיפה ל60-90 שניות היא חיובית לבמה 12 ועוברים מבוגרים יותר.
- הסר סל, למחוק משם EPS העודף עם מעבדה לנגב. להמשיך עם שש שטיפות רציפים ב10 מיליליטר של PBS במנות 60 מ"מ. השתמש פיפטה פלסטיק להשפריץ בעדינות עוברים עם PBS בכל אחד מששת שוטף. המשך לצבוע וצעדים לטיפול בסמים. הערה: יכולה להיות מסולקת למניה של את הכיור.
3. דיי והתרופות טיפול בעוברי permeabilized
- דיי טיפול
- הוסף 5 μl של 10 מ"מ Cy5 * צבע חומצה קרבוקסילית ל1 מיליליטר של MBIM-T (50 מיקרומטר ריכוז סופי) בצינור 1.5 מיליליטר microfuge ומערבולת לערבב. הערה: * בחירה של צבע תלוי בניתוח במורד הזרם. חומצה קרבוקסילית Cy5 היא יעילה לניתוחים שלאחר מכן באמצעות קיבוע וimmunostaining. Rhodamine B הוא שימושי עבור ניתוח של עוברי חיים. הפליטה האדומה של Rhodamine B, והפליטה הירוקה של מטבוליטים שלה 1, יכולים להציג כמה סיבוכים עם יישומים במורד הזרם באמצעות הקרינה. תרופה או רעלן ניתן להוסיף לפתרון הצבע להתחיל בטיפול בשלב זה, או להגביל את הטיפול תרופתי / רעל לדופק בשלב זה. יש להקפיד לטפל ולהיפטר מתרופות ורעלים על פי MSDS ותקני בטיחות סביבתית.
- העבר את העוברים מסל הרשת לפתרון לצבוע באמצעות מכחול. שווי הצינור ולהפוך שוב ושוב על מנת להבטיח אתעוברים לצוף בחופשיות בתרחיף בתמיסת הצבע. הנח צינור על כיסא נדנדה nutating 15 דקות בטמפרטורת חדר.
- הסר את הצינור מnutator ולתת עובר להתיישב. הסר את פתרון צבע עם טפטפת קנס ולהחליף עם 1 מיליליטר של MBIM-T כדי לשטוף. הפוך לצינור מחדש להשעות עוברים לחלוטין. בואו עוברים להתיישב וחזור עם עוד שלוש שטיפות MBIM-T. הסר את כל MBIM-T משטיפה סופית ולהמשיך לשלב דגירה.
- דגירה של התפתחות עובר
- העברה עובר לאחד משני תאים: סל הפיתוח או קאמרי שקופיות. הערה: סל הפיתוח עדיף לתקופות ארוכות יותר התפתחותית, והיא נדרשת לצעדי קיבעון וimmunostaining הבאים הם להיות מוצא להורג. קאמרי השקופיות הוא אופטימלי עבור הזמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר, והוא יעיל ביותר לתקופות קצרות התפתחותית (למשל, האירועים העובריים המוקדמים). תרופה או רעלן ניתן להוסיף לבינונית בריכוזים שונים וד העוברevelopment ניתן לנטר בזמן אמת עם עוברים בשידור חי או בנקודתי קצה באמצעות קיבוע סטנדרטי וimmunostaining פרוטוקולים.
- פיתוח בסלסלות
- יש לנקות את סל פיתוח על ידי התזה עם 70% אתנול, לשטוף היטב במים דה מיונן וכתם יבש עם מעבדה לנגב. הכן 6 מיליליטר של מדיום דגירה עם ריכוז רצוי של תרופה או רעלן. הנח את סל הפיתוח במדיום בטיפול נטילת מנה 60 מ"מ לא לבועות אוויר מלכודת מתחת לבסיס הרשת. הערה: שני כלי תקשורת נפוצות: MBIM לבד, או MBIM/M3 בתערובת 50:50, האחרון להיות יעילים יותר לתקופות פיתוח ארוכות יותר.
- העבר את עוברי permeabilized לרשת פני השטח בבסיס של סל עם מכחול. בעדינות להשפריץ את העוברים עם תקשורת מהמאגר שמסביב. לפזר את העוברים עם המכחול, כך שהם בשכבה על הרשת. הערה: המשך להדמיה מיקרוסקופית ולהעריך את מאפייני permeabilization ויכולת קיום של יחסי הציבורeparation (ראה שלב 4).
- פיתוח בלשכת השקופיות
- הפוך תא שקופיות ולהחיל חרוז קטן של שומן ואקום על המערכת של הפתיחה. הנח 150 μl של מדיום עם כמות רצויה של תרופה או רעלן על פני השטח של קרום לעשות בתוך הפתח. הערה: שני כלי תקשורת נפוצות: MBIM לבד, או MBIM/M3 בתערובת 50:50, האחרון להיות יעילים יותר לתקופות פיתוח ארוכות יותר.
- העבר את עוברי permeabilized לירידה של תקשורת עם מכחול. לפזר את העוברים שהופך אותם להתיישב על הקרום בירידה.
- בזהירות להחיל coverslip מעגלי 25 מ"מ מעל הפתח ובכך משטח את המדיום. לחץ כלפי מטה בעדינות לאורך ההיקף של coverslip כדי ליצור חותם עם הגריז. הערה: המשך כדי מיקרוסקופיה הדמיה כדי להעריך את מאפייני permeabilization וכדאיות של ההכנה (ראה שלב 4).
4. Identification של עוברי קיימא permeabilized
- לזהות עוברי permeabilized. שים לב עוברים תחת epifluorescence עם מיקרוסקופ מצויד במצלמה דיגיטלית. לרכוש תמונות (באורך הגל הכחול כדי לקבוע את autofluorescence חלמון הפרופיל) של מספר שדות באמצעות מיקרוסקופ קבוע והגדרות מצלמה.
- לקבוע permeabilization של עוברים המבוססים על עוצמת הקרינה היחסית. השתמש בסטראו עם מרחק עבודה גדול כדי להכיל את הסל ולאפשר למניפולציות של העוברים. המיקרוסקופ צריך להיות מצויד בשלב תכנות XYZ, תאורת epifluorescence ומצלמה דיגיטלית. תמונת העוברים דואגים להקליט חשיפה ופרמטרי עמדת במה של כל תמונת עובר כדי לאפשר הערכה מחדש של אותו עובר בנקודת זמן מאוחרת יותר (ראו תוצאת נציג באיור 3). הערה: דפוסי ספיגת צבע ישתנו בהתאם לצבען המשמש, משך חשיפה וגיל עובר. מגוון רחבשל ספיגת צבע על פני הכנה אחת אופיינית ומשקפת את השונות במידת permeabilization.
- לזהות עוברים ובת קיימא. לאחר סימון מיקום של עוברי permeabilized, להמשיך בפיתוח עובר בטמפרטורת חדר או 25 ° C. חזור סל או תא שקופיות למיקרוסקופ. שים לב תחת הקרינה ערוץ כחולה ולרכוש תמונה של autofluorescence חלמון בזוהו בעבר עוברי permeabilized. להעריך את הכדאיות לפי התקדמות רגילה של הפצת חלמון (ראה ראנד et al. 1 ותוצאת נציג באיור 3). הערה: תכונות מורפולוגיות אחרות של העובר נצפה עם מיקרוסקופ brightfield ניתן להשתמש כדי להעריך את הכדאיות. מומלץ כי קביעת הרמה של חדירות התואמת את הכדאיות להיקבע באופן אמפירי עם כל צבע ומתח של זבוב בשימוש.
- להעריך את השפעות תרופה או רעלן בעוברי קיימא permeabilized.
- עוברי processed עם הפרוטוקול הנ"ל עומדים על מספר הניתוחים הקונבנציונלי לאחר סמים או חשיפת רעלן. כמה סוגים השונים של ניתוחים נחשבים בדיון שלהלן וכוללים תצפית ישירה של המורפוגנזה בעוברת לחיות כמו גם immunostaining הודעה הקיבעון-מנתח. שתי גישות אלה משופרים על ידי שימוש בצבעים חיוניים (למשל, ה-GFP) החושפים דפוסי ביטוי גנים ושושלת תא ופרופילי מורפולוגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מכשירי טיפול בעובר הם בתמונה באיור 1 על מנת לסייע בלדמיין את המכשירים "תוצרת הבית" למניפולציה בפרוטוקולים לעיל. תוצאות ניתן לראות באיור 2 ממחישות את ההשפעה החזקה של גידול עובר ב18 מעלות צלזיוס ביכולת שלהם להיות permeabilized ידי EPS בשלבים מאוחרים של התפתחות. מצב זה מיושם בשלב הפרוטוקול 2.1. יעילות של צבע החומצה קרבוקסילית Cy5 כדי לחשוף את הרמות השונות של חדירות לראות בדרך כלל בEPS עוברי מטופלים לראות באיור 3. הדינמיקה ההתפתחותית של חלוקת הצבע בחלמון הוא ראתה גם באיור 3, חושפת קריטריון המשמש להערכת כדאיות , כפי שתואר בפרוטוקול צעד 4.2. השירות של צבע Cy5 בקביעת permeabilization עובר לאחר טיפול רעלן, קיבעון פורמלדהיד וimmunostaining בא לידי ביטוי בתוצאה באיור 4.
: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
התקני איור 1. טיפול עובר לשיטת EPS. הסל השטוח קרקעי משמש בdechorination וEPS צעדי חשיפה (, '). סל הפיתוח משמש לחשיפות ארוכות יותר התפתחותיות של עובר permeabilized (ב ', ב'). קאמרי השקופיות משמשת עבור חשיפות קצרות התפתחותיים והדמיה ברזולוציה גבוהה יותר של עוברים בשידור חי (C, C '. ראה טקסט עבור תיאור נוסף).
איור 2. השפעת הזדקנות על 18 מעלות צלזיוס ביעילות EPS בעוברים בשלב מאוחר. עוברים נאספו במשך שעות ואחרי הזדקנות ב18 מעלות צלזיוס למשך 20 שעה (AA פנלים ",
איור 3. התאגדות של Cy5 בעוברים חדירים ובת קיימא. עוברים נאספו ב25 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות והתיישנו במשך 14 שעות ב18 מעלות צלזיוס (שווה ערך ל 7-9 עוברי שעה 25 מעלות צלזיוס, שלב 12). לאחר dechorination, EPS טיפול נעשה (1:40 בMBIM דקות 1) ואחריו דגירה בצבע Cy5 (50 מיקרומטר בMBIM-T ל15 דקות). עוברים נשטפו שלוש פעמים בMBIM-T והועברו לסל פיתוח עם MBIM במאגר. פיתוח הורשה proceed במשך 8 שעות בטמפרטורת חדר. ספיגה של Cy5 (אדום) הוא צילם בערוץ מרחיק האדום מייד לאחר טיפול צבע וכביסה (לוח א ') ולאחר פיתוח שעות 8 (לוח ב'). הפצה של החלמון נתפס על ידי autofluorescence בערוץ הכחול. ספיגת צבע, ולכן חדירות, נתפסת להשתנות מעובר לעובר. צבע Cy5 (אדום) הוא ראה בתרגום לחלמון (הכחול), שהופך להיות מרוכז ללומן של המעי בשלב 16 (סגול, לוח ב ').
איור 4. קביעת השפעות permeabilization והתיל כספי בעוברים קבועים וimmunostained. עוברים נאספו ב25 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות והתיישנו במשך 14 שעות ב18 מעלות צלזיוס (שווה ערך ל 7-9 עוברי שעה 25 מעלות צלזיוס, שלב 12). לאחר dechorination, טיפול EPS נעשה (1:40 בMBIM דקות 1) ואחריו דגירה בצבע Cy5 (50 מיקרומטר בMBIM-T ל15 דקות) יחד עם מתיל כספי (50 מיקרומטר MeHg, לוח ב ') או שליטת ממס DMSO (0.1% ריכוז סופי, לוח א'). עוברים נשטפו עם MBIM-T והניחו בסל פיתוח עם MBIM: בינוני M3 במאגר והתיישן במשך 8 שעות נוספות בטמפרטורת חדר. עוברים אז היו קבועים ב4% הכנת paraformaldehyde-heptane שני שלבים על ידי פרוטוקול סטנדרטי 14. צביעה בוצעה עם אנטי Fasciclin השני (ירוק ב, לינה ולבנה ב', ב ') לתייג תאי עצב מוטוריים ונוגדנים נגד elav (אדום בA, B) לתייג את כל גופי תא העצב. צבע Cy5 מתגלה על ידי הקרינה ישירה, אשר דורשת חשיפה ממושכת בשל עוצמת הקרינה פחתה בשל קיבעון (Cy5 הוא פסאודו בצבע כחול בכל הלוחות). ההשפעות של MeHg נתפסות בדפוסים וcluste סדיריםטבעת של הגופים לרוחב תא נוירון chordotonal (elav חיובי, שכותרת באדום ומסומנים בחצים לבנים בB לעומת). בנוסף, הסתעפות אופיינית למגזרי (SN) (חיצים ירוקים מוצקים ב') נתפסת להיות משתנה מאוד עם חשיפת MeHg (חיצים ירוקים מוצקים בB ") עולה בקנה אחד עם השפעות שדווחו בעבר של MeHg על העובר 15. השלכה של ינמיגזריות ומגזרית עצבים בשורשיהם נתפסות להיות עקורות בדיעבד עם חשיפת MeHg (חץ ירוק פתוח בב '). הערה: מהתיל הכספי הוא עצבי חזק. יש להקפיד ללבוש כפפות ומשקפי מגן בעת טיפול. רשות צריכה להיעשות דרך מתקן בטיחות סביבתית מוסדי ושירות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה הנ"ל מתארת אמצעי להשגת עוברי דרוזופילה קיימא, כי הם נגישים לטיפולי מולקולה קטנים על פני מגוון רחב התפתחותית. שיטה זו מציגה את הרומן וממצא פשוט שהזדקנות עוברים על 18 מעלות צלזיוס מאפשר permeabilization של עוברים בשלב מאוחר באותה היעילות כפי שניתן לראות בעבר רק בעוברים בשלב מוקדם. בנוסף, שימוש בחומצה מרחיק האדומה צבע Cy5 קרבוקסיליות כאינדיקטור חדירות הוכחה כיעילה ביישומים שלאחר תיקון, ואינו מתערב בסמני ניאון אדומים וירוקים קונבנציונליים שניתן להשתמש בם כדי לחשוף פנוטיפים התפתחותית. ממצאים אלה לקדם באופן משמעותי את היעילות ותועלת של שיטת EPS.
שיטה זו ניתנת לניתוח של שניהם חיים והכנות עובר קבועים. באמצעות מיקרוסקופ brightfield וקאמרי השקופיות להגדיר, תכונות אופייניות להבקיע במחצית הראשונה של התפתחות עובר הן תנועות morphogenetic כזהcellularization של blastoderm, היווצרות תלם cephalic, התארכות germband והכחשת germband 1. עם כתבי GFP או RFP ניתן להבחין בנקודתי קצה ספציפיות יותר, למשל דפוסי פילוח מוקדם והיווצרות של מבנים עצביים בפיתוח 1 מאוחר יותר. דיווחי ה-GFP ו RFP גם לאפשר תצפית של אירועים התפתחותיים בחיים עובר permeabilized בשני קאמרי שקופיות והכנות סל התפתחותית. שיטה פשוטה כדי לקבוע רעילות ברוטו של תרופה או כימי מיושמת היא לפקח את הדפוס אוטומטי הקרינה חלבון חלמון בערוץ הכחול כדי לקבוע עיכוב או הפסקה של פיתוח 1.
EPS המתודולוגיה יש גם פוטנציאל גדול להרחבת כלי החקירה לחרקים שאינם מודל, בפרט נגד היתושים, אשר מניות ארכיטקטורה דומה של קליפת הביצה. היישום של מולקולות קטנות לעוברים של מיני חרקים אחרים היה לפתוח את שדרה של investigatiעל איפה גישות גנטיות סטנדרטיות ללימודים תפקודיים כרגע חסרות. עוברים שפותחו בסלים יכולים להיות מעובד לקיבעון פורמלדהיד, ולכן נפתחו ניתוחים למגוון הרחב של חומרים כימיים immunostaining זמינים ללימודי דרוזופילה. עם זאת, צעד זה מחייב קביעת הודעה תיקון של permeabilization להיות ריאלי, כדי לקשר בין פנוטיפים עם עוברים שנעשו נגיש לתרופה. יישום של צבע חומצה קרבוקסילית Cy5 הוכח כיעיל ביותר לגישה זו. החומצה קרבוקסילית Cy5 הוא נלקחה ביעילות בעוברי permeabilized (איור 3 א). במהלך פיתוח Cy5 מרוכז בחלמון, אשר מוחרם סופו של דבר בלומן של מעי ויוצר בשלב 14 ומאוחר יותר (איור 3 ב). לאחר קיבוע, הקרינה Cy5 היא במידה ניכרת ירד, ובכל זאת באופן אמין לגילוי במעי ומשמשת כסמן של אלה עוברים שpermeabilized ביעילות בתחילת הדרך (ראה מיל נציגאיור ult 4). יש לציין כי זיהוי Cy5 בשלב זה דורש חשיפות ארוכות מצלמה (למשל, 1-4 שניות) לצורך זיהוי. לכן, ניקוד של פנוטיפים עם דפוסי immunostaining יכול להמשיך להשתמש באות Cy5 כדי לאשר עוברי permeabilized דומה יחד עם סמני רקמות ספציפיים (למשל, נוגדנים ספציפיים עצביים לראות באיור 4).
האתגר הגדול ביותר בשיטה זו הוא הרגישות של כדאיות עובר לתהליך permeabilization, משהו שהטריד את הניסיונות קודמים לפתח שיטה זו 9,10,16 ארוכה. כדאיות לאחר permeabilization היא תלוי גיל בוטה, ועולה באופן דרמטי מבוגר העובר הוא על permeabilization 9. עם זאת, כפי שהראינו בעבר, חדירות הופכת להיות קשות יותר ויותר עם גיל 1. לאחרונה דווח החברה מדגימה את יכולת permeabilize עוברי שלב מאוחר (שלב 14) על ידי בעניינים מחדש פנייהTane כממס בשיתוף עם D-limonene 17. השירות הרחב של שיטה השנייה זה לא ברור כמו שרק אחד השפעת הסמים התאפיינה (nocodazole) ויישום לעוברי שלב מוקדם יותר לא תואר 17. יתר על כן, יישום של שלב פיתוח C ° 18 שתואר לעיל תשואות חדירות בשלב מאוחר ועוד יותר מונע שימוש בממסים אורגניים רעילים. החוקר שהוא חדש לפרוטוקול EPS חווה השתנות בתוצאות permeabilization וכדאיות על ניסיונות ראשוניים. השלבים המתוארים כאן נותנים לחוקר את הכלים להשתנות באופן שיטתי תנאים של טיפולי permeabilization וצעדי דגירה לאחר מכן כדי לייעל את התנאים לזנים ספציפיים של דרוזופילה שהם עובדים בסביבה המעבדה שלהם.
אתגר נוסף עם השיטה הוא ההשתנות בספיגה כימית ראתה מעוברים לעובר. השתנות זו באה לידי ביטוי בהטרוגניות שלראתה את ספיגת צבע Cy5 בעוברים מייד לאחר טיפול צבע (איור 3 א). לעומת זאת, Rhodamine B הצבע הוא במהירות רבה יותר ובאופן שווה, מפוזר ברקמות העוברית מאשר צבע Cy5 (איור 2 "). לכן, כמה השתנות עובר לעובר עשויות להיות טיפחו במאפייני ההפצה של החומר הכימי, תרופה או רעלן של עניין, והוא טבועים בשיטה. איפה כימות של מינון היא קריטית, מומלץ שספיגה של התרופה או רעלן של עניין מאופיינת באמצעות שיטה אנליטית חלופית. יחד עם זאת, את הקלות של הפרוטוקול הנ"ל, ואת היכולת לסנן מאות עוברים, מאפשר לחוקר להעריך את תגובות מינון ולהבקיע פנוטיפים אופייניים עם השקעה קטנה של משאבים, מה שהופך לגישה חזקה ראשונה לסמים או רעלים המאפיינים בזה מפותח מאוד מערכת מודל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25 mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu,, Reinitz, J.
- Kopczynski, C. C., et al. A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).
- Bejsovec, A., Chao, A. T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation. Development. 139, 690-698 (2012).
- Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens. Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).
- Delubac, D., et al. Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection. Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).
- Mahowald, A. P. Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos. Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).
- Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes. Cryobiology. 29, 210-239 (1992).
- Arking, R., Parente, A. Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique. The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).
- Li, J. S., Li, J. Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).
- Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos. Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).
- Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, Academic Press. San Diego. 518 (1994).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. Methods in Cell Biology. 44, Academic Press. 445-487 (1994).
- Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster. Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).
- Limbourg, B., Zalokar, M.
- Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos. Fly (Austin). 7, (2013).
