Summary
Införande av små molekyler till utvecklings Drosophila embryot erbjuder stora möjligheter för karakterisering av biologisk aktivitet av nya föreningar, läkemedel och gifter liksom för sondering grundläggande utvecklingsvägar. Metoder beskrivs häri beskriva åtgärder som övervinner naturliga hinder för detta tillvägagångssätt, utöka nyttan av Drosophila embryon modellen.
Abstract
Drosophila embryot har länge varit en kraftfull laboratoriemodell för att belysa molekylära och genetiska mekanismer som styr utvecklingen. Den enkla genetiska manipulationer med denna modell har ersatt farmakologiska metoder som är vanliga i andra djurmodeller och cell-baserade analyser. Här beskriver vi de senaste framstegen inom ett protokoll som möjliggör tillämpning av små molekyler till utvecklingsfruktflugor embryo. Metoden information steg för att övervinna den ogenomtränglighet av äggskal medan embryoviability upprätthållande. Äggskal permeabilisering över ett brett spektrum av utvecklingsstadier uppnås genom tillämpning av en tidigare beskriven d-limonen embryo permeabilization lösningsmedel (EPS 1) och genom åldrande embryon vid reducerad temperatur (18 ° C) innan behandlingar. Dessutom är användning av ett långt rött färgämne (CY5) som en permeabilization indikator beskrivs, som är kompatibel med tillämpningar nedströms involverar standard röd och grön influensaorescent färgämnen i levande och fasta beredningar. Detta protokoll är tillämpligt på studier med bioaktiva föreningar att söka utvecklingsmekanismer samt för studier som syftar till att utvärdera teratogen eller farmakologisk aktivitet av okarakteriserade små molekyler.
Introduction
Drosophila embryot fortsätter att vara en ledande modell för undersökning av grundläggande mekanismer för utveckling 2. Denna kraftfulla modellen stöds av ett brett spektrum av molekylära genetiska verktyg som tillåter manipulationer av i huvudsak vilken gen som helst punkt och inom alla utvecklings organ. Den lilla storleken, snabb utveckling, och omfattande karakterisering av morfogenes av Drosophila embryon gör det en modell av val för genetiska skärmar, varav många har upptäckt grundläggande utvecklingsbanor 3,4. Många fenotyper i Drosophila embryot har karakteriserats och är lätt tolkningsbara, ofta ger ett medel för att identifiera bakomliggande molekylära genetiska mekanismer som är ansvariga för en onormal egenskap.
Historiskt sett har en brist av flugan embryot modellen varit svårigheten att införa små molekyler till embryonala vävnader. Detta hinder har ställt begränsningar: 1) ossning kända bioaktiva små molekyler som sönder för att förhöra utvecklingsmekanismer och 2) med hjälp av denna etablerade modell för att utvärdera teratogena eller farmakologisk aktivitet av okarakteriserade små molekyler. Som en följd av detta har screening potential flugan embryot varit underutnyttjade i karakterisering av små molekyler aktivitet.
Leverans av små molekyler till flyga embryot kan åstadkommas med två metoder: 1) permeabilisering av äggskalet och 2) mikroinjektion. I denna artikel presenteras förskott till metoden för permeabilization som är lätta att utföra i inställningen av en konventionell Drosophila laboratorium. Det bör noteras att den senaste tidens framsteg inom mikroinjektion metoder med mikrofluidik teknik bidrar också till metoder för att införa föreningarna till embryot 5,6. Introduktion av molekyler till embryot förhindras av ett vaxartat skikt av äggskalet 7. Drosophila äggskal består av fem skikt. Fråninifrån och ut är de: vitellinmembranet, det vaxartade skiktet, det inre chorionic skiktet, endochorion och exochorion 8. De tre yttre chorionic skikt kan avlägsnas genom kortvarig emersion av embryot i utspädd blekmedel, avses ett steg till så dechorionation. Den exponerade vaxartat skikt kan sedan äventyras genom exponering för organiska lösningsmedel, såsom heptan och oktan 7,9, rendering dechorionated embryo genomsläpplig, medan det fortfarande är innesluten i den underliggande vitellinmembranet. Men användningen av dessa lösningsmedel introducerar komplikationer på grund av deras giftighet och svårigheten att reglera sina starka permeabilisering handling, som båda har skarp negativa effekter på embryo bärkraft 9,10.
Förfarande för permeabilisering med användning av en komposition benämnd embryo permeabilization lösningsmedel (EPS) har tidigare beskrivits 1. Detta lösningsmedel består av d-limonen och växt-härledda ytaktiva ämnen som gör att det lösningsmedel som skall miscible med vattenbaserade buffertar. Den låga toxiciteten av d-limonen och förmåga att späda ut lösningsmedlet för att önskade koncentrationer som gav en effektiv metod för att generera permeabla embryon med hög viabilitet 1. Däremot har två endogena faktorer fortsatte att föra begränsningar till ansökan. Först, embryon visar heterogenitet i permeabilitet efter EPS behandling, även om försiktighet vidtas för att upprätthålla ett nära utvecklings iscensättning. För det andra, embryon äldre än cirka åtta timmar har visat sig svårt att permeabilize, i linje med en härdning av äggskal som inträffar efter äggläggningen 11.
Beskrivs här är framsteg i EPS-metoden som: 1) hjälpa till att identifiera och analysera nästan identiskt permeabilized embryon, även efter fixering och immunfärgning åtgärder har verkställts och 2) möjliggöra permeabilisering av embryon vid sena utvecklings tidpunkter (> 8 tim, scen 12 och äldre). Närmare bestämt applicering av ett långt rött färgämne,CY5 karboxylsyra, beskrivs som fungerar som en permeabilitet indikator, som kvarstår i embryot under utveckling och efter formaldehydfixering. Dessutom visas att uppfödning av embryon vid 18 ° C upprätthåller äggskal i en EPS känsligt tillstånd, som möjliggör permeabilisering av sena skede embryon (stadier 12-16).
Dessa framsteg övervinna de tidigare nämnda begränsningarna för EPS-metodik. Det här programmet kommer därför att ge utredarna med ett medel för att införa små molekyler av intresse för embryot vid tydliga utvecklings tidpunkter med bibehållen lönsamhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av Fly kulturer, Lösningar och Embryo Handling Devices
- Bered en bur kultur av Drosophila. Placera 500 + parning flugor av den önskade stammen i en population bur försedd med en 10 cm druva-agarplatta och en fläck av jäst pasta. Upprätthålla kultur i en 25 ° C luftfuktighet kontrollerad inkubator. OBS! Cage kulturer kräver en dag eller två av konditionering för att få konsekventa embryo om mönster. Grape plattor med jäst pasta byts en gång på morgonen och en gång på kvällen under konditioneringen.
- Förbered EPS. Varma lösningar av ytaktiva medel (kokamid DEA och etoxylerad alkohol) vid 37 ° C. Pipettera 18 ml av d-limonen till en glasskintillationsflaska försedd med en liten omrörarstav. Pipettera 1 ml av vardera av de två ytaktiva medel (5% slutkoncentration av vardera) och d-limonen. Blanda noggrant och avlägsna omrörarstav. OBS: Denna förrådslösning av EPS är bra under ca två månader vid rumstemperatur. Lösningenskall värmas vid 37 ° C, och virvlades för att fullständigt solubilisera ytaktiva före användning. EPS-och d-limonen bör förvaras i en glasbehållare, eftersom de kommer att lösa upp vissa plaster med tiden.
- Förbered embryo dechorionation lösning, inkubation medier, färg-och läkemedelslösningar. Blanda 25 ml blekmedel med 25 ml H2O och placera i flat tallrik. Förbered modifierade grund inkubationsmedium (MBIM) och MBIM-T enligt tidigare recept 1,12. Förbered Shields och Sang M3 cellodlingsmedium och PBS enligt tillverkarens protokoll (se Material List). Bered stamlösning av permeabilization färgämne vid 10 mM koncentration i DMSO.
- Montera embryo-hanteringsanordningar och tillbehör:
- Förbered dechorionation och EPS behandlings korg (se figur 1 A). Klipp av en 3 cm sektion av en engångs 50 ml polypropylen centrifug / kultur rör med en fintandad såg. Gör svetsytan spola genom att gnugga röret avsnittet om sandpapper följstill en bänkytan. Weld rörsektionen till Nitex nylonnät genom smältning av fälgen på rörsektionen över en låga och pressning på att maskan på en glasplatta. Låt svalna och trimma bort extra nät. OBS: Det stora sidor och botten möjliggör snabb och fullständig sköljning bort av resterande blekmedel och EPS vid respektive steg. Svets steg bör utföras under en huv.
- Förbered en utveckling korg. Klipp av övre delen av en 50 ml centrifug / kultur rör i jämnhöjd med kanten av locket. Avlägsna och modifiera locket genom att skära ut en central öppning och skårorna längs kanten, såsom visas i figur 1B. Skruva på locket över nätet och på gängorna på avskurna röret avsnitt och trimma extra nät. OBS: Locket innehåller hack i kanten som tillåter diffusion till bulkmediet då placerad i 60 mm behållaren skålen (Figur 1B).
- Förbered komponenter i ett glidkammaren. Klipp en fyrkant av DO membran som är större änglidkammarens öppning. Applicera ett mycket tunt skikt av vakuum fett till insidan läppen av öppningen. Fäst DO membran i öppningen tätning den mot fettet med låsringen. Klipp bort överflödigt DO membran genom att skära tillbaka nära hållarringen. OBS:. Specifikationer för glidkammaren finns i Kiehart et al 13 är denna kammare inte är kommersiellt tillgängliga och kräver anpassade tillverkning av en mekanisk verkstad.
2. Staging, Dechorionation och EPS Behandling av embryon
- Staging embryon genom tids samling. Ställ en färsk druv / jäst platta till flugan kultur bur i AM. Tillåt embryon som skall fastställas för en timme vid 25 ° C. Släng den här plattan och ersätta med en färsk druv / jäst platta för en efterföljande embryo läggning av 2 timmar vid 25 ° C. Samla den här plattan och placera i 18 ° C inkubator för ytterligare utvecklings iscensättning. OBSERVERA: 1 h av utveckling vid 25 ° C är lika med 2 h av utvecklingvid 18 ° C. Effekten av åldring vid 18 ° C jämfört med 25 ° C för att bibehålla EPS permeabilization i embryon sent skede kan ses i figur 2.
- Dechorionation. Skölj försiktigt embryon från druv plattan i mesh korg använder 25 ° C kranvatten och en pensel. Skölj bort från embryona i korgen under en försiktig ström av kranvatten överskott jäst. Sänk ned korgen i 50% blekmedel under 2 min. Tvätta embryon noggrant under rinnande kranvatten. OBS: sprutar försiktigt blekmedel på embryona intermittent med en plast pipett. Medan 2 minuter är vanligen tillräcklig för fullständig dechorionation bör denna inkubationstid kontrolleras genom direkt undersökning och anpassas därefter. Upprätthålla dechorionated embryon i korgen nedsänkt i kranvatten och omedelbart gå till EPS steget.
- EPS Behandling
- Förbered sex 60 mm skålar med cirka 10 ml PBS i varje. Förbered EPS utspädning genom att lösa 75 il EPS i 2.925 ml MBIM (01:40) i en 50 ml glasbägare med omskakning. OBS: En vit emulsion blanketter från denna blandning.
- Blot överflödigt vatten från botten av gallerkorgen med en lab torka. Doppa korg i utspädda EPS i bägare och omedelbart snurra att dispergera embryon i EPS-lösning i botten av korgen. Fortsätt virvlande rörelse i 30 sekunder. OBSERVERA: EPS utspädningar och exponeringstider kan varieras för att styra permeabiliteten. Det rekommenderas att optimala EPS späd och behandlingstider fastställas empiriskt med stammar av flugor som används. Ökad exponeringstid till 60-90 sek är gynnsamt för etapp 12 och äldre embryon.
- Ta bort korg, blot bort överflödigt EPS med en lab torka. Fortsätt med sex sekventiella tvättar i 10 ml PBS i 60 mm skålar. Använd en plast pipett för att försiktigt spruta embryon med PBS i var och en av de sex tvättar. Fortsätt att färga och drogbehandlingssteg. OBS! EPS kan avyttras i vasken.
3. Dye och drogbehandling av Permeabilized embryon
- Dye Behandling
- Lägg 5 ul av 10 mM CY5 karboxylsyra färgämne * till 1 ml MBIM-T (50 | iM slutlig koncentration) i ett 1,5 ml mikrofugrör och virvel för att blanda. OBS: * Val av färg beror på efterföljande analys. CY5 karboxylsyra är effektiv för efterföljande analyser med fixering och immunfärgning. Rodamin B är användbar för analys av levande embryon. Den röda utsläpp av rodamin B, och den gröna emissionen av dess metaboliter 1, kan ha vissa komplikationer med efterföljande tillämpningar med användning av fluorescens. Drog-eller toxin kan tillsättas till färglösningen att påbörja behandling i detta skede, eller för att begränsa drog / toxin behandling för att en puls i detta skede. Försiktighet bör vidtas för att hantera och göra sig av droger och gifter i enlighet med säkerhetsdatablad och miljösäkerhetsstandarder.
- Överför embryon från gallerkorgen till färgämneslösningen med användning av en pensel. Förslut röret och vänd upprepade gånger för att säkerställa attembryon flyta fritt i suspension i färgämneslösningen. Placera röret på en nuterande rocker under 15 min vid rumstemperatur.
- Ta bort röret från nutator och låt embryon lösa. Ta bort färglösningen med en fin pipett och ersätta med 1 ml MBIM-T för att tvätta. Vänd röret för att åter avbryta embryon helt. Låt embryon bosätta sig och upprepa med ytterligare tre MBIM-T tvättar. Ta bort alla MBIM-T från slutsköljning och fortsätt till inkuberingssteget.
- Inkubation under embryoutveckling
- Överför embryon till en av två kammare: Utvecklingen korg eller glidkammaren. ANMÄRKNING: utveckling korg är föredraget för längre utvecklingsperioder, och är nödvändig om efterföljande fixering och immunfärgning steg som skall exekveras. Glidkammaren är optimal för högre upplösning time-lapse avbildning och är mest effektiv för korta utvecklingsperioder (t.ex. de tidiga embryonala händelser). Drog eller toxin kan läggas till mediet vid olika koncentrationer och embryo dtveckling kan övervakas i realtid med levande embryon eller vid en ändpunkt med användning av standard-fixering och immunfärgning protokoll.
- Utvecklingen i korgar
- Rengör en utveckling korg genom att spruta med 70% etanol, skölj noggrant med avjoniserat vatten och torka med lab torka. Förbered sex ml inkubationsmedium med önskad koncentration av läkemedel eller toxin. Placera utvecklingen korgen i medium i 60 mm skålen noga med att inte fälla luftbubblor under sängbotten. NOTERA: Två medier används vanligen: MBIM enbart eller MBIM/M3 i en 50:50-blandning, varvid den senare är mer effektivt för längre utvecklingsperioder.
- Överför permeabilized embryon att maska yta i botten av korgen med en pensel. Spruta försiktigt embryon med media från omgivande reservoaren. Dispergera embryona med pensel så att de är i ett monoskikt på maskan. OBS! Gå vidare till mikroskopi avbildning och utvärdera permeabilisering och livskraft egenskaper preparation (se steg 4).
- Utvecklingen i Slide kammaren
- Vänd slide kammare och applicera en liten sträng av vakuum fett på kanten av öppningen. Placera 150 l av medium med önskad mängd läkemedel eller toxin på ytan av DO-membran i öppningen. NOTERA: Två medier används vanligen: MBIM enbart eller MBIM/M3 i en 50:50-blandning, varvid den senare är mer effektivt för längre utvecklingsperioder.
- Överför permeabilized embryon till droppe media med en pensel. Skingra embryon gör dem bosätta sig på membranet inuti droppen.
- Applicera försiktigt en 25 mm rund täckglas över öppningen därmed plattas mediet. Tryck ner försiktigt längs omkretsen av täckglas för att bilda en tätning med fettet. OBS! Gå vidare till mikroskopi avbildning att utvärdera permeabilisering och livskraft egenskaper beredningen (se steg 4).
4. Identifiering av Permeabilized livsdugliga embryon
- Identifiera permeabiliserade embryon. Observera embryon i epifluorescence med ett mikroskop utrustat med en digitalkamera. Förvärva bilder (i den blå våglängden för att bestämma profil äggulan autofluorescens) av flera fält med fast mikroskop och kamerainställningar.
- Bestäm permeabilisering av embryon som baseras på relativa fluorescensintensiteten. Använd ett stereomikroskop med ett stort arbetsavstånd för att rymma korgen och för att tillåta manipulation av embryon. Mikroskopet bör vara utrustad med en programmerbar XYZ skede epifluorescence belysning och en digitalkamera. Bild embryona tar hand för att spela in exponering och scen positionsparametrarna för varje embryo bilden för att göra det möjligt för omvärdering av samma embryon vid en senare tidpunkt (se representativa resultat i figur 3). OBS! Mönster av färgämnesupptag kommer att variera beroende på det färgämne som används, längden av exponering och embryo ålder. Ett brett utbudav färgupptagning över en enda beredning är typiskt och reflekterar variationen i graden av permeabilisering.
- Identifiera livsdugliga embryon. Efter märkning ställning permeabilized embryon, fortsätt med embryoutveckling vid rumstemperatur eller 25 ° C. Retur korg eller glida kammare till mikroskop. Observera under blå kanal fluorescens och få bilden av äggula autofluorescens i tidigare identifierade permeabilized embryon. Bedöma viabiliteten enligt normal progression av äggula distribution (se 1 och representativt resultat i figur 3 Rand et al.). OBS! Andra morfologiska egenskaper hos embryot observerats med brightfield mikroskopi kan användas för att bedöma livsduglighet. Det rekommenderas att fastställa nivån på permeabilitet som är kompatibel med lönsamheten bestämmas empiriskt med varje färg och stam av fluga som används.
- Utvärdera drogen eller toxineffekter i permeabilized livskraftiga embryon.
- Embryon förfassed med ovanstående protokoll är redo för ett antal konventionella analyser efter läkemedel eller toxin exponering. Flera av de olika typer av analyser beaktas i diskussionen nedan och innefattar direkt observation av morfogenes i levande embryon samt post-fixering immunanalyser. Båda dessa tillvägagångssätt har förbättrats genom användning av vitala färgämnen (t.ex. GFP) som avslöjar genuttryck mönster och cellhärstamning och morfologi profiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Embryo hanteringsanordningar är avbildade i figur 1 för att hjälpa till att visualisera de "hemgjorda" anordningar för manipulation i ovan nämnda protokoll. Resultaten ses i figur 2 illustrerar robusta effekten av uppfödning embryon vid 18 ° C på deras förmåga att permeabiliseras av EPS i sen utvecklingsfas. Detta villkor tillämpas i protokollet steg 2.1. Effektivitet av Cy5 karboxylsyra färgämne för att avslöja de olika nivåerna av genomtränglighet typiskt sett i EPS-behandlade embryon framgår av fig. 3. De utvecklande dynamik färgämnesfördelning i äggulan är också ses i fig. 3, avslöjar ett kriterium som används för att bedöma viabiliteten , såsom beskrivs i protokollet steg 4,2. Användbarheten av Cy5-färgämne vid bestämning embryo permeabilization efter toxinbehandling, formaldehyd fixering och immunofärgning illustreras av resultatet i figur 4.
Hantering Embryo Figur 1. Anordningar för EPS-metoden. Den flatbottnade korgen används i dechorination och EPS exponeringssteg (A, A '). Utvecklingen korgen används för längre utvecklings exponeringar permeabiliserad embryo (B, B '). Glidkammaren används för kortare utvecklings exponeringar och högre upplösning avbildning av levande embryon (C, C ". Se text för ytterligare beskrivning).
Figur 2. Effekt av åldring vid 18 ° C på EPS-effekt hos embryon sent skede. Embryon uppsamlades efter två timmar, följt av åldring vid 18 ° C under 20 h (Paneler AA "
Figur 3. Inkorporering av CY5 i permeabla och livsdugliga embryon. Embryon uppsamlades vid 25 ° C under 2 h och åldrades under 14 h vid 18 ° C (ekvivalent med 7-9 hr embryon vid 25 ° C, steg 12). Efter dechorination, EPS-behandling utfördes (01:40 i MBIM för 1 min) följt av inkubation i CY5-färgämne (50 | iM i MBIM-T till 15 min). Embryon tvättades tre gånger i MBIM-T och överförs till utveckling korg med MBIM i reservoaren. Utvecklingen fick proceed för 8 timmar vid rumstemperatur. Upptag av CY5 (Röd) avbildas i långt-röda kanalen direkt efter färg behandling och tvätt (panel A) och efter 8 h utveckling (panel B). Fördelning av äggulan ses av autofluorescens i den blå kanalen. Dye-upptag, hence permeabilitet, ses att variera från embryo till embryot. CY5 färgämne (röd) ses att lokalisera till äggulan (blå), som blir koncentrerad till lumen i tarmen vid steg 16 (lila, panel B).
Figur 4. Fastställande av permeabilisering och metylkvicksilver effekter i fasta och immun embryon. Embryon samlades upp vid 25 ° C under 2 h och åldrades under 14 h vid 18 ° C (ekvivalent med 7-9 hr embryon vid 25 ° C, steg 12). Efter dechorination ades EPS behandling gjort (01:40 i MBIM för 1 min) följt av inkubation iCY5-färgämne (50 | iM i MBIM-T under 15 min) tillsammans med metylkvicksilver (50 pM MeHg, fält B) eller DMSO lösningsmedel kontroll (0,1% slutkoncentration, Panel A). Embryon tvättades med MBIM-T och placerades i en utveckling korg med MBIM: M3-medium i reservoaren och åldrades under ytterligare 8 h vid rumstemperatur. Embryon fixerades sedan i en två-fas 4% paraformaldehyd-heptan framställning av ett standardprotokoll 14. Färgning utfördes med anti-Fasciclin II (grön i A, B och vitt i A ', B') för att märka motoriska nervceller och anti-elav antikroppar (röd i A, B) för att märka alla neuron cell organ. CY5 färgämne avslöjas genom direkt fluorescens, vilket kräver utökad exponering på grund av minskad fluorescensintensiteten på grund av fixering (CY5 är pseudo-färgade blått i alla paneler). Effekterna av MeHg ses i oregelbundna mönster och clustering av de laterala organ chordotonal neuron cell (elav-positiva, märkta i rött och markerade med vita pilar i B kontra A). Dessutom är en karakteristisk förgrening av segmentell (SN) (fyllda gröna pilar i A ') sett att vara mycket varierande med MeHg exponering (fasta gröna pilar i B ") i överensstämmelse med tidigare rapporterade effekterna av MeHg på embryot 15. Projektion av intersegmental och segment nerver på sina rötter ses att förskjutas posteriort med MeHg exponering (öppna gröna pilen i B '). OBS: Metylkvicksilver är ett potent nervgift. Försiktighet bör vidtas för att bära handskar och skyddsglasögon vid hantering. Avfallshantering bör ske genom en institutionell miljösäkerhet anläggning och service.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden ovan beskriver ett sätt att få livskraftiga Drosophila embryon som är tillgängliga för små molekyler behandlingar över ett brett utvecklings sortiment. Denna metod introducerar nya och enkla konstaterande att åldras embryon vid 18 ° C möjliggör permeabilisering av embryon sent skede med samma effekt som tidigare bara sett i embryon tidigt stadium. Dessutom har användningen av långt röda färgämnet CY5 karboxylsyra som en permeabilitet indikator visat sig effektiv i post-sätta fast och inte interfererar med konventionella röda och gröna fluorescerande markörer som kan användas för att avslöja utvecklingsstörningar fenotyper. Dessa rön avancera avsevärt effektiviteten och nyttan av EPS-metoden.
Denna metod är mottaglig för analyser av både levande och fasta beredningar embryo. Använda bright mikroskopi och glidkammaren inrättas, typiska drag att göra mål i första halvlek av embryoutveckling är morfogenetiska rörelsercellularization av BLASTODERM, cefaliska fåra bildning, germband töjning och germband indragnings 1. Med GFP eller RFP reportrar mer specifika endpoints kan skönjas, t.ex. tidiga segmenteringsmönster och bildandet av neurala strukturer i senare utveckling 1. GFP och RFP rapporter möjliggör också observationer av utvecklings händelser i levande permeabilized embryon i både glidkammaren och utvecklings korg preparat. En enkel metod för att bestämma brutto toxiciteten av en tillämpad läkemedel eller kemikalier är att följa mönstret av guleprotein auto-fluorescens i den blå kanalen för att bestämma en försening eller upphörande av utveckling 1.
EPS-metoden har också stor potential för att bredda de utredningsverktyg för icke-modell insekter, framför allt myggor, som delar en liknande arkitektur av äggskal. Tillämpning av små molekyler till embryon av andra insektsarter skulle öppna en allé av investigatipå var vanliga genetiska metoder för funktionella studier saknas för närvarande. Embryon som utvecklats i korgar kan behandlas för formaldehydfixering, alltså öppna analyser till det stora utbudet av immunfärgning reagenser tillgängliga för Drosophila studier. Detta kräver dock steget att en post-fix bestämning av permeabilization vara möjligt att korrelera fenotyper med embryon som hade gjorts tillgängliga för drogen. Tillämpning av CY5 karboxylsyra färgämne har visat sig mycket effektiv för detta tillvägagångssätt. CY5 karboxylsyra effektivt upptogs i permeabiliserade embryon (figur 3A). CY5 är under utveckling koncentrerades i gulan, som i slutändan är isolerat i hålrummet i formnings tarmen vid steg 14 och senare (figur 3B). Efter fixering, är CY5 fluorescens markant minskat, men ändå tillförlitligt påvisas i tarmen och fungerar som en markör för de embryon som effektivt permeabiliserades från början (se representativa result Figur 4). Det bör noteras att CY5 upptäckt i detta skede kräver längre kameraexponeringar (t.ex., 1-4 sekunder) för att upptäcka. Sålunda kan poängsättning av fenotyper med immunfärgning mönster ske med Cy5 signal för att bekräfta på liknande permeabiliserade embryon tillsammans med vävnadsspecifika markörer (t.ex. neurala specifika antikroppar som ses i figur 4).
Den största utmaningen i denna metod är känslighet embryoviability till permeabilization processen, något som länge har bekymrat tidigare försök att utveckla denna metod 9,10,16. Livskraft efter permeabilization är brutalt åldersberoende och ökar dramatiskt ju äldre embryot är på permeabilisering 9. Men, som vi har visat tidigare, blir permeabilitet allt svårare med åldern 1. En färsk rapport visar nu möjlighet att permeabilize sent skede embryon (stadium 14) genom att på nytt åberopa heptane som lösningsmedel i samband med d-limonen 17. Den breda användningen av den här sistnämnda metoden är inte klart eftersom endast en läkemedelseffekt präg (nokodazol) och tillämpning på tidigare embryon scenen var inte beskrivs 17. Vidare tillämpning av 18 ° C utvecklingssteg som beskrivs ovan ger sen permeabilitet och vidare undviker användningen av giftiga organiska lösningsmedel. Den utredare som är ny i EPS-protokollet kommer att uppleva variationen i permeabilisering och lönsamhetsutfall vid första försök. De steg som beskrivs här ger utredaren verktyg för att systematiskt variera villkor permeabilization behandlingar och efterföljande inkubation steg för att optimera förhållandena för specifika stammar av Drosophila de arbetar i sitt eget laboratoriemiljö.
Ytterligare en utmaning med metoden är variationen i kemisk upptag sett från embryo till embryo. Denna variabilitet återspeglas i heterogenitetCY5 färgämne upptag ses i embryon omedelbart efter färg behandling (Figur 3A). Däremot är Rhodamine B färgämne snabbare och jämnt spridda över de embryonala vävnader än CY5 färgämne (Figur 2B "). Således kan vissa embryo till embryo variabilitet vara hyste i distributions egenskaperna hos kemiska, läkemedel eller toxin av intresse och är inneboende i metoden. När kvantifiering av dosen är kritisk, rekommenderas att upptaget av läkemedlet eller toxinet av intresse karakteriseras genom en alternativ analysmetod. Trots enkelheten i det ovannämnda protokollet, och förmågan att avskärma hundratals embryon, medger utredaren att bedöma dos svar och poäng karakteristiska fenotyper med liten investering av resurser, vilket leder till en kraftfull första metod för att karakterisera droger eller gifter i detta högt utvecklade modellsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25 mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu,, Reinitz, J.
- Kopczynski, C. C., et al. A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).
- Bejsovec, A., Chao, A. T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation. Development. 139, 690-698 (2012).
- Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens. Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).
- Delubac, D., et al. Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection. Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).
- Mahowald, A. P. Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos. Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).
- Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes. Cryobiology. 29, 210-239 (1992).
- Arking, R., Parente, A. Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique. The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).
- Li, J. S., Li, J. Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).
- Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos. Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).
- Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, Academic Press. San Diego. 518 (1994).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. Methods in Cell Biology. 44, Academic Press. 445-487 (1994).
- Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster. Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).
- Limbourg, B., Zalokar, M.
- Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos. Fly (Austin). 7, (2013).
