Abstract
وقد تم إحراز تقدم كبير في تحديد آلية تحرير RNA الميتوكوندريا في المثقبيات. وبالمثل، تم إحراز تقدم كبير في تحديد مكونات معقدة editosome التي تحفز تحرير الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح كيف تعمل هذه البروتينات معا. المركبات الكيميائية التي تم الحصول عليها من شاشة عالية الإنتاجية ضد editosome قد تمنع أو تؤثر على الخطوات واحدة أو أكثر في دورة التحرير. وبالتالي، فإن تحديد مركبات كيميائية جديدة تولد تحقيقات الجزيئية قيمة للتشريح وظيفة editosome والتجمع. في دراسات سابقة، أجريت في المختبر تحرير المقايسات خارج باستخدام الحمض النووي الريبي المسمى الراديو. هذه المقايسات هي مضيعة للوقت وغير فعالة وغير مناسبة لأغراض الإنتاجية العالية. هنا، واستنادا مضان متجانسة "خلط وقياس" المطرقة ribozyme في المختبر مراسل مقايسة لمراقبة التحرير الحمض النووي الريبي، ويرد. فقط نتيجة لتحرير الحمض النووي الريبيوribozyme المطرقة نقل الطاقة مضان الرنين (الحنق) oligoribonucleotide الركيزة يخضع الانقسام. هذا بدوره يؤدي إلى فصل من fluorophore من فاكهه تقضي بالتالي إنتاج إشارة. في المقابل، عندما يتم تثبيط وظيفة editosome، سيتم تطفئ إشارة مضان. هذا هو الاختبار حساسة للغاية والبسيطة التي يجب أن تكون قابلة للتطبيق عموما لمراقبة التحرير في الحمض النووي الريبي المختبر أو إنتاجية عالية الفرز من المواد الكيميائية التي يمكن أن تحول دون وظيفة editosome.
Introduction
عملية تحرير الحمض النووي الريبي، تعديل مرنا ما بعد النسخي، اكتشفت لأول مرة في trypanosomatids 1. منذ ذلك الحين، وقد أجريت أعمال كبيرة في دراسة آلية وراء تحرير الحمض النووي الريبي في المثقبية البروسية 2،3. في سلسلة من التفاعلات الإنزيمية، وeditosome، وهو مجمع الأساسية من حوالي 20 البروتينات، ويخلق mRNAs والميتوكوندريا ناضجة لمكونات متعددة من الأكسدة الفسفرة نظام توليد الطاقة. ترتيب الأحداث الحفاز هو الانقسام endonucleolytic، uridylate (U) بالإضافة أو الحذف، والربط، وفقا لما تمليه الرنا دليل (gRNAs) 4.
بالإضافة إلى البروتينات الأساسية المعقدة editosome، كما تم تحديد عدد من العوامل التبعي 5-7. وتعتبر هذه البروتينات معظمها مجمعة في المجمعات مستقلة. ومع ذلك، من اجل تجميع البروتين في مجمع editosome الأساسية وأنماط التفاعل بين مجمع الأساسية مع ملحقالمجمعات هي لم يتحدد بعد. تستهدف عملية تحرير الحمض النووي الريبي في trypanosomatids قد توفر dissectors الكيميائية التي تساعد في دراسة التجمع وظيفة معقدة editosome. علاوة على ذلك، أظهرت دراسات عدة بروتينات وظيفية على editosome الإستخدامات الأساسية عبر مراحل الحياة المختلفة، مشيرا إلى قدرتها كأهداف المخدرات 8-12. وبالتالي، فإن مثبطات جدت من editosome قد تعمل أيضا مركبات الرصاص ضد trypanosomatids. هذا هو الوقت المناسب، والأدوية المتاحة حاليا ضد الأمراض التي تسببها trypanosomatid سامة، غير فعالة ومكلفة 13،14.
مقايسة فعالة ومريحة في المختبر من الضروري استكشاف الكون الكيميائية لمثبطات معينة التي تعمل على منع تحرير الحمض النووي الريبي. وقد وضعت ثلاثة فحوصات وتستخدم لمراقبة editosome الأنشطة: (أ) جولة كاملة في المختبر فحص الحمض النووي الريبي تحرير 15، (ب) المشقوق مسبقا في المختبر فحص الحمض النووي الريبي تحرير 16،17، والثانية (ج) المطرقة ribozyme (HHR) مقايسة 18 القائم. المقايسات الأولين تعتمد على رؤية مباشرة من المنتج تحريرها (أتباز 6 مرنا) مع مساعدة من النشاط الإشعاعي. يستخدم فحص مقرها HHR-نسخة معدلة من مرنا أتباز 6 التي على غرار لتتصرف كما ribozyme على التحرير. وribozyme وظيفية ثم يشق تحديدا ركيزة الحمض النووي الريبي رديولبلد، بمثابة المراسل. في الآونة الأخيرة، مشيري وآخرون ضعت 'خلط وقياس' المستندة إلى HHR في المختبر مراسل فحص الحمض النووي الريبي لمراقبة التحرير حيث يتم استبدال الركيزة الحمض النووي الريبي رديولبلد مع نقل الطاقة مضان الرنين (الحنق) الركيزة 19. مزايا مبدأ هذا الاختبار هي: (أ) هو مزيج سريع ومريحة ونوع مقياس الفحص، حيث أن إنتاج ribozyme نشطة والركيزة الانقسام تحدث في وقت واحد في نفس الأنبوب في انخفاض حجم (أي 20 ميكرولتر)، (ب ) فإنه يتجنب استخدام المواد المسمى بالإشعاع، (ج) الحساسية التي هيfforded من قبل الأجهزة مضان في شكل لوحة عيار الصغيرة، و (د) إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء. باستخدام هذا الاختبار، تم تأكيد تأثير الحمض النووي الريبي معروفة التحرير مثبطات يغاز ضد editosome النقية 19. هذه التجربة التحقق من صحة الاختبار لتحديد السريع لمثبطات تحرير الحمض النووي الريبي، في المقام الأول ضد editosomes كله من T. البروسية.
الرقم 1 هو خطوة بخطوة تخطيطي مفصل للفي المختبر فحص الحمض النووي الريبي التحرير القائم على مضان. هذا البروتوكول يمكن إما أن تستخدم لرصد تحرير الحمض النووي الريبي في المختبر أو يتم تكييفه لفحص المكتبات مركب من المقاييس المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يصف بروتوكول تحت الإجراء لأداء القائم على مضان الحمض النووي الريبي تحرير مقايسة. الفحص لا يمكن أن يؤديها في PCR أنبوب واحد، 96 جيدا، أو لوحات 384 جيدا تبعا لنطاق التجربة. في وقت لاحق إشارة مضان يمكن قراءتها على الوقت الحقيقي PCR نظام الكشف مناسبة. يوصف الفحص هنا في سياق لوحات 384 جيدا.
1. التثقيف T. خلايا البروسية
- إعداد المتوسطة النمو لT. البروسية procyclic الخلايا النموذج. ل1 لتر من المتوسط:
- حل ز 25.4 مسحوق SDM-79 في المياه 800 مل miliQ.
- إضافة 2 غرام من NaHCO 3 و الرقم الهيدروجيني إلى 7.3 مع هيدروكسيد الصوديوم M 10.
- إضافة الماء nanopure إلى الحجم النهائي من 900 مل، فلتر تعقيم.
- إضافة مصل بقري جنيني (FBS)، البنسلين الستربتوميسين حل وهيمن (2.5 ملغ / مل) لتركيزات النهائي من 10٪ (ت / ت)، و 100 U / مل و 7.5 ملغم / لتر على التوالي.
- تنمو 300 مل من T. <م> البروسية 1.7A النوع البري (شكل procyclic) الخلايا عند 28 درجة مئوية، والهز في 70 دورة في الدقيقة لكثافة 1.5 × 10 7 خلية / مل. ملاحظة: هذا يجب أن ينتج 3 مل من editosome نشطة مع ~ 0.5 ملغ من البروتين الكلي، وتكون كافية ل600 ردود الفعل التحرير.
- حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- غسل بيليه مع 50 مل من العازلة PBSG المبرد (10 ملي نا 2 هبو 4، 10 ملم ناه 2 ص 4، 145 مم كلوريد الصوديوم، و 6 ملي الجلوكوز)، وتدور باستمرار الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 ° C.
2. عزل الخام الميتوكوندريا
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات على الجليد أو على 4 درجات مئوية للحفاظ على editosome النشاط.
- resuspend الخلايا تحصد في 30 مل من العازلة DTE (1 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0 و 1 ملم EDTA). استخدام 40 مل العقيمة الخالط Dounce (قبل المبردة) لتعطيل غشاء الخلية عن طريق التمسيد صعودا وهبوطا 10 مرات على الأقل على الجليد. على الفور إضافة 4.3 مل من 60٪ سكروز (ث / ت، أي 1.75 م) إلى جناسة إلى تركيز النهائي من 0.25 م الطرد المركزي في 15،800 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، لتحقيق تفضيلي أسفل الميتوكوندريا.
- resuspend الكرية الميتوكوندريا في 4.6 مل من STM العازلة (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 250 ملي السكروز و 2 ملي MgCl 2). إضافة 13.8 ميكرولتر من 0.1 M و CaCl 2 و 4 ميكرولتر من الدناز ريبونوكلياز خالية من الأول إلى تركيزات النهائي من 0.3 ملي و 9 U / مل، على التوالي. احتضان الخليط لمدة 1 ساعة على الجليد.
- إضافة 4.6 مل من العازلة STE (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 250 ملي السكروز و 2 ملي EDTA) لإبطال نشاط الدناز أولا الطرد المركزي في 15،800 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- resuspend وبيليه في 400 ميكرولتر من تحلل العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.2 و 10 ملي MgCl 2، 100 ملي بوكل، 1 ميكروغرام / مل pepstatin، 1 ملم DTT، و 1X كاملة خالية من مثبط البروتياز EDTA) ونقل إلى microfuge أنبوب.
- إضافة 10٪ تريتون X-100 إلى تركيز النهائي من 1٪ ل الثانية احتضان المحللة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية على محور دوار الأنبوب.
- مسح المحللة الميتوكوندريا بواسطة الطرد المركزي مرتين في 17،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية؛ الاحتفاظ طاف تطهيرها في كل مرة.
3. Editosome تنقية
- صب 10 مل 10٪ -30٪ (V / V) التدرج الجلسرين الخطي (الجدول 1) في أنبوب نابذة فائقة السرعة باستخدام 2X العازلة HHE التدرج (40 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.9، 20 ملي المغنيسيوم (سلا) 2، 100 ملي بوكل، و 2 مم EDTA) وصانع التدرج باتباع دليل التعليمات.
- إزالة بعناية 500 ميكرولتر من الحل من أعلى التدرج الجلسرين وتحميل بلطف 500 ميكرولتر من المحللة الميتوكوندريا تطهيرها. تدور في 178،000 x ج لمدة 6 ساعة في 4 درجات مئوية باستخدام نابذة فائقة السرعة.
- جمع الكسور 500 ميكرولتر بالتسلسل من أعلى إلى أسفل الانحدار عند 4 درجات مئوية. ثم المفاجئة تجميد الكسور باستخدام النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
ق = "jove_title"> 4. إعداد RNA
- يصلب القالب الحمض النووي منها تحتوي على تسلسل مكملة لتسلسل T7 المروج (الجدول 2) مع قليل النوكليوتيد T7 المروج (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') في نسبة المولي 1:1 من التدفئة في 90 درجة مئوية لمدة 3 دقائق والتبريد في RT لمدة 10 دقيقة على الأقل.
- نسخ الحمض النووي الريبي باستخدام النسخ عدة في المختبر عن طريق اتباع دليل التعليمات.
- وقف رد فعل النسخ عن طريق إضافة حجم مساو من 7 M اليوريا صبغ (7 M اليوريا، 0.05٪ الزيلين Cynol، و 0.05٪ برموفينول الأزرق). تعمل على تصفية تعقيمها 9٪ هلام بولي أكريلاميد تغيير طبيعة (9٪ الأكريلاميد، 7 M اليوريا، 1X TBE).
- استخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV) التظليل مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية قصيرة الموجة لتحديد مكان والمكوس RNA منها. وضع قطعة هلام رفعه في أنبوب microfuge وإضافة 400 ميكرولتر من هلام شطف العازلة (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 250 ملي NaOAc، 1 ملم EDTA و0.25٪ SDS). أزل بين عشية وضحاها في RT على محور دوار الأنبوب.
- PRECIpitate الحمض النووي الريبي مزال بإضافة 1 مل من البرد الإيثانول بنسبة 100٪ واحتضان إما في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو -20 درجة مئوية خلال الليل.
- أجهزة الطرد المركزي في 16،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، لتكوير أسفل الحمض النووي الريبي.
- غسل بيليه مع 1 مل من الإيثانول بنسبة 75٪. أجهزة الطرد المركزي في 16،000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- resuspend الكرية RNA مناسب في ريبونوكلياز المياه مجانا لتحقيق تركيزات المطلوب، كما هو مبين في الجدول رقم 2.
5. مضان القائم على الفحص-RNA التحرير
- لفعل واحد، والجمع بين 1 بمول (1 ميكرولتر) من preA6Rbz و 2.5 بمول (1 ميكرولتر) من gA6Rbz (نسبة المولي 1:2.5) في أنبوب microfuge، احتضان عند 70 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، والسماح لها الجلوس على RT لفي لا يقل عن 10 دقيقة.
- وفي الوقت نفسه إعداد مزيج الرئيسي باستخدام الجدول 3، من دون preA6Rbz وgA6Rbz، للتفاعل التحرير التي تحتوي على 1X العازلة HHE (25 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.9، 10 ملي المغنيسيوم (سلا) 2، 50 ملي بوكل و 10 ملي EDTA)، 1 ملمATP، 5 مم CaCl 2، 16 نانوغرام / ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المستخفية الخميرة، 0.1٪ تريتون X-100، وeditosome المنقى.
- إضافة صلب preA6Rbz وgA6Rbz لإكمال مزيج الرئيسي.
- الاستغناء 18 ميكرولتر من مزيج الرئيسي (الجدول 3) في الآبار التي تحتوي إما 2 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه (الآبار مع عدم وجود مركبات) أو 2 ميكرولتر من 200 ميكرومتر المركبات الكيميائية وتشمل عينات السيطرة في لوحة وفقا لشكل 5.
- ختم اللوحة مع لوحة سداده وتدور لوحة أسفل، لإزالة أي فقاعات الهواء. احتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 4 ساعة.
- إضافة 25 بمول (2 ميكرولتر) من gA6Rbz منافس إلى كل بئر. وضع سداده الطازجة، وتدور لوحة أسفل ووضعه على الوقت الحقيقي PCR الجهاز. برنامج التجربة التالية:
الخطوة 1: 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ الخطوة 2: 24 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة؛ الخطوة 3: إيقاف. - إضافة 15 بمول (1 ميكرولتر) من الحنق الركيزة إلى كل بئر إلى الحجم النهائي من 23 ميكرولتر. ختم لوحة مع السداده الطازجة.تدور بسرعة لوحة ووضعه مرة أخرى على الوقت الحقيقي PCR الجهاز.
- البرنامج تجربة جديدة مع الخطوات التالية:
الخطوة 1: 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ الخطوة 2: اقرأ؛ الخطوة 3: اذهب إلى الخطوة 1، 40 مرة؛ الخطوة 4: إيقاف. - إعداد لوحة عن طريق تحديد جميع الآبار التي تتطلب القراءة واختيار المرشح FAM. حجم المدخلات إلى 23 ميكرولتر وبدء التشغيل.
- حساب المنحدر من القيم التي تم الحصول عليها من كل جانب / عينة للحصول على قياس الحركية من خلال التآمر المنحدرات على الرسم البياني شريط للتحليل. ملاحظة: قراءة الحركية يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء بين العينة والخلفية؛ كما العينة الخلفية سيكون له منحدر قريبة من الصفر. قراءة نقطة النهاية لديها أعلى من الضوضاء في الخلفية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لشرح الخطوات اللازمة لإنشاء شاشة واسعة النطاق، أرقام 2-5 لتجارب السيطرة ممثل تتعلق نوعية الفحص. هذه هي التجارب التحكم الأساسية للمقايسة متسقة على مدى عدة أيام من فحص أو للمقارنة بين شاشات مختلفة.
تقييم الإسفار نسبة الإشارة إلى الضوضاء
لضمان الاستقرار ونوعية oligoribonucleotide الركيزة المسمى فلوريسئين في إعداد نطاق واسع، وقد حسبت Z'عامل، الذي يعرف بأنه الفرق بين الخلفية فحص والحد الأقصى للإشارة باستخدام جزيء ribozyme النشط (A6Rbz). . المقايسات مع Z'عامل تعتبر> 0.5 مقبولة للشاشة عالية الإنتاجية الشكل 2 يوضح بيانات تمثيلية باستخدام الركيزة الحنق المسمى مع 5 'فلوريسئين (FAM؛ باعث) و 3' N، N 'tetramethylrhodamine (TAMRA؛ فاكهه تقضي) (A6Rbz_F / T). أنتجت هذه الركيزة على عامل Z'من 0.64 عند حسابها باستخدام 72 مكررات في حضور وغياب A6Rbz.
في هذا الاختبار الركيزة البديلة باستخدام أيوا الأسود فاكهه تقضي الظلام (A6Rbz_F/Ib) يمكن أن يحقق نسبة أفضل إشارة إلى الضجيج مقارنة TAMRA. وذلك لأن ولاية ايوا الأسود، على عكس TAMRA، استوعبت تنبعث الطاقة في شكل حرارة وضوء لا. كان عامل Z'الحصول عليها باستخدام FAM / أيوا الأسود (F / رطل) المسمى الركيزة 0.68. التحسن في Z'عامل لالركيزة F / رطل المسمى على الركيزة TAMRA المسمى هو بسبب الخلفية أقل نسبيا. تظهر هذه النتائج أن كلا من ممثل ركائز هي الخيارات الممكنة لاستخدامها في شاشة عالية الإنتاجية.
تحديد الأنشطة التحرير من الجلسرين التدرج الكسور
لتحديد واختيار الكسور editosome الأكثر نشاطا للتجارب، وglycero تم اختبار كسور ل التدرج في المختبر لتحرير باستخدام مقايسة على أساس مضان (الخطوة V). تظهر هذه البيانات (الشكل 3) 7-12 الكسور مثل كسور الأكثر نشاطا (≥ 50٪ النشاط التحرير؛ مع جزء الأكثر نشاطا إلى 100٪). ويمكن الجمع بين هذه الكسور عندما يكون مطلوبا أكثر editosome.
حساب عامل Z'عندما تم الجمع بين الكسور Editosome
لتحديد تأثير combinig الكسر editosome، تم حساب قيمة Z'عامل من 0.6 عندما استخدمت الكسور الأكثر نشاطا (F8 F9 + + F10) كمصدر للeditosome. لحساب تم اختبار 72 مكررات في حضور وغياب editosome (الشكل 4) Z'عامل. تم استخدام الركيزة F / رطل في هذه التجربة. هذه البيانات تظهر أنه استنادا إلى Z'عامل، والجمع بين الكسور التدرج الجلسرين لها تأثير ضئيل على نوعية الفحص.
الحمار = "jove_content"> تجربة مراقبة الممثل للفحص
واستخدمت بيانات تمثيلية مقارنة عينات مراقبة مختلفة لتحليل المتغيرات في الفحص. كما هو مبين في الشكل (5)، وردود الفعل فقدان أي مكونات تحرير الحمض النووي الريبي (ردود الفعل 1-4) لا يلتصق الركيزة. ويلاحظ انشقاق الركيزة مقاسا مضان والنسبية النشاط التحرير إلا في وجود جميع مكونات ردود الفعل التحرير في حال عدم وجود المانع (رد فعل 5) أو في وجود جميع مكونات التحرير ومركب نشط (رد فعل 6). في المقابل، يمكن للمجمع المثبطة منع تحرير الحمض النووي الريبي، ويستخدم كعنصر تحكم إيجابية (رد فعل 7). هنا، كانت تستخدم الأسود جارح (MRB) ومركبات C53 كما الضوابط الإيجابية والسلبية، على التوالي.
ghres.jpg "العرض =" 500 "/>
الشكل 1. في المختبر فحص الحمض النووي الريبي التحرير القائم على ribozyme المطرقة. أ) الخطوة بخطوة التمثيل التخطيطي للفحص في المختبر التحرير القائم على مضان: (أ) تهجين من المطرقة ribozyme (تحرير قبل A6Rbz) تحريرها مسبقا مع دليل الحمض النووي الريبي لها (gA6Rbz). (ب) الاعتراف والتفاعل بين الحمض النووي الريبي مزدوج من قبل المجمع editosome المنقى. (ج) حذف تحرير الحمض النووي الريبي التي حفزتها editosome. (د) التفكك من A6Rbz تحريرها من editosome وgA6Rbz عن طريق التسخين في 85 درجة مئوية وإضافة دليل الحمض النووي الريبي منافس (gA6Rbz_comp). (ه) التهجين الركيزة الحنق مع المطرقة النشط ribozyme A6 (A6Rbz النشط). (و) ويظهر الكشف عن إشارات FAM التالية الانقسام الركيزة الحنق من قبل ribozyme نشطة. ب) ribozyme المطرقة تحريرها مسبقا (قبل تحريرها A6Rbz) بالتعاون مع gA6Rbz التي تحدد حذف ثلاثة بنا (ARRO برأسينث) من موقع التحرير (ES). نتيجة لتحرير الحمض النووي الريبي في وجود editosome وظيفية يتم تحرير ribozyme غير نشط في شكله النشط (تحرير A6Rbz) التي يمكن أن يلتصق الآن الركيزة الحنق (موقع الانقسام المشار إليها بواسطة السهم). وحفظها يتم تمييز 5'-CUGA-3 'من A6Rbz تحريرها في جوهر الحفاز الأساسية للنشاط ribozyme (موقع تحريرها) (تم تعديل هذا الرقم من مشيري 19). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. إشارة إلى نسبة الضوضاء مقارنة بين ركائز الحنق إيواء quenchers مختلفة. Ribozyme (A6Rbz) النشاط باستخدام FAM / TAMRA (F / T) وFAM / أيوا الأسود فيصل القاسم (F / رطل) ركائز. وreprese المحور الصادياليلة مضان حدة التعسفي (FAU) في الدقيقة الواحدة.
الرقم 3. النشاط تحرير الحمض النووي الريبي من كسور حدد الحصول عليها من الجلسرين التدرج الطرد المركزي من المحللة الميتوكوندريا. جزء رقم 9 (F9) لديها أعلى نشاط. يمثل المحور الصادي النشاط التحرير النسبي في نسبة، معتبرا F9 إلى 100٪.
تم الحصول على الرقم 4. حساب Z'عامل باستخدام الكسور الأكثر نشاطا (F8 F9 + + F10) كمصدر editosome. الاختلاف التجريبية من 72 مكررات لكل نوع من التفاعل. تم حساب Z'عامل 0.6. يمثل المحور الصادي النشاط التحرير النسبي.
الرقم 5. تجربة الممثل لمضان القائم على RNA التحرير الفحص. أجريت ردود الفعل في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر لكل بئر وCFX384 TouchTM الوقت الحقيقي PCR نظام الكشف كان يستخدم لقياس إشارة مضان. ويعرض الرسم البياني الضوابط المختلفة بالإضافة إلى رد فعل التحرير الكامل الذي يحتوي على جميع المكونات اللازمة للفحص (# 5). تم قياس مضان في وجود الركيزة الحنق وحده (رقم 1) لتقييم سلامة الركيزة. تم تنفيذ نموذج رقم 2 في غياب editosome لرصد أي نشاط ribozyme قبل التحرير. لتقييم تأثير editosome التشويه والتحريف على الركيزة، تم قياس مضان في وجود editosome والحنق الركيزة فقط (# 3). لاختبار الموجه دليل تحرير خصوصية، وسام التنوير القائل في غياب gA6Rbz كان يستخدم (رقم 4). A غير المثبطة (C53، رقم 6) ومركب المثبطة (MRB، رقم 7) كانت تستخدم لاختبار تأثير على فحص التحرير. في حين تحول دون تحرير الحمض النووي الريبي بشكل كبير من MRB، C53 لديها تأثير يذكر. أشرطة الخطأ تتوافق مع اختلاف التجريبية (الانحراف المعياري) بين 10 مكررات. يمثل المحور الصادي النشاط التحرير النسبي في نسبة، معتبرا أن رد فعل كاملة (# 5) إلى 100٪.
| 10٪ | 30٪ | |
| 2X العازلة HHE التدرج | 5 مل | 5 مل |
| الغليسيرول | 1 مل | 3 مل |
| DEPC H 2 O | 4 مل | 2 مل |
| 1 M DTT | 10 ميكرولتر | 10 ميكرولتر |
ن = صفحة "دائما"> الجدول رقم 1. 10٪ وبنسبة 30٪ الجلسرين الحل (10ML لكل منهما).
| قبل تحرير A6 Ribozyme (preA6Rbz) | |
| قالب preA6Rbz الحمض النووي | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCA TCAAAAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTT CC CCCTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| preA6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUUUUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGA UCAAAUGU-3 ' |
| RNA الأسهم اضرب. | 1 ميكرومتر |
| دليل A6 Ribozyme (gA6Rbz) | |
| قالب gA6RBz الحمض النووي | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATAATTATCATATCACTGT CAAGGGAAAGTTGTGAGGGTGATGAGTCCGTGTATATCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz RNA | 5'-GGGAUAUACACGGACUCAUCACCCUCACAACUU UCCCUUGACAGUGAUAUGAUAAUUAUUUUUUUUUUUUUUUUU-3 ' |
| RNA الأسهم اضرب. | 2.5 ميكرومتر |
| دليل A6 Ribozyme المنافس (gA6RBz_comp) | |
| قالب gA6Rbz_comp الحمض النووي | 5'-GGATATACACGGACTCATCACCCTCACAACTTTC CCTTGACAGTGATATGATAATTATTTTTTTTTTTTTTTTT CCCTAT AGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz_comp RNA | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAUAAUUAUCAUAUCACUG UCAAGGGAAGUUGUGAGGGUGAUGAGUCCGUGUAUAUCC-3 ' |
| RNA الأسهم اضرب. | 12.5 ميكرومتر |
| نشط A6 Ribozyme (A6RBz) | |
| قالب الحمض النووي A6Rbz | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCAT CAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTTCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| A6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGAUCA AAUGU-3 ' |
| RNA الأسهم اضرب. | 1 ميكرومتر |
| الحنق الركيزة | |
| TAMRA فاكهه تقضي | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-TAMRA-3 '(Eurogentec) |
| أيوا الأسود فاكهه تقضي | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-أيوا الأسود 3 '(IDT) |
| RNA الأسهم اضرب. | 15 ميكرومتر (على حد سواء) |
الجدول 2. قوالب الحمض النووي والحمض النووي الريبي ركائز.
| تركيب | رد فعل التحرير (ميكرولتر) |
| 10X HHE | 1.5 |
| 0.1 M و CaCl 2 | 1 |
| 100 ملي ATP | 0.2 |
| 10٪ Tritonx-100 | 0.2 |
| 500 نانوغرام / ميكرولتر الحمض النووي الريبي المستخفية الخميرة | 1 |
| Editosome | 5 |
| ريبونوكلياز مجانا H 2 O | 7.1 |
| 1 ميكرومتر preA6Rbz | 1 |
| 2.5 ميكرومتر gA6Rbz | 1 |
| مجموع | 18 |
الجدول 3. تكوين رد الفعل، وماجستير ميكس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقدم الإنتاجية العالية طريقة الفرز رواية لتحديد مثبطات ضد مجمع التحرير الحمض النووي الريبي من المثقبيات، وتوفير وسيلة جديدة لاكتشاف الأدوية لمواجهة الأمراض التي تسببها trypanosomatids. وقد استند الحنق-ribozyme الفحص المستخدمة على نطاق واسع لأغراض مختلفة 20-22؛ ومع ذلك، لقد استخدمت قدرات الفحص ribozyme مقرها الحنق لرصد النشاط في المختبر من الحمض النووي الريبي تحرير 19. يحتمل أن تتكيف هذا الاختبار على أنواع أخرى من تحرير الحمض النووي الريبي في حقيقيات النوى، مثل تحرير استبدال النوكليوتيدات من الرنا ترميز نواة الثدييات 23.
الجدة من هذا الاختبار ليس في وضع المقايسات ribozyme مقرها الحنق، في حد ذاته، ولكن في وضع الأسلوب الذي يدمج هذه التقنية إلى تحرير مقايسة الحمض النووي الريبي التي هي قابلة للالفرز الفائق الإنتاجية للمواد الكيميائية ضد editosome. الأسلوب القائم على الفحص ribozyme ديها العديد من المزايا أكثر من غيرها من الشاشات والحمارAYS تستخدم حاليا لهذا الغرض. على وجه التحديد، والتقنية يقدم مقايسة حساسة وقابلة للتكرار "المزيج والتدبير" الاعتماد على ركيزة الفلورسنت بدلا من واحدة رديولبلد، مما يجعل من يصلح لالفرز الفائق الإنتاجية 19. رصد في الوقت الحقيقي للإشارة مضان بعد إضافة الركيزة بدلا من إشارة بسيطة نقطة النهاية يجعل من الممكن تحديد أكثر دقة IC 50 قيم المركبات يعاير 19. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح اختبار من التأثيرات المثبطة للمركبات على مجمع كامل editosome بدلا من البروتينات المؤتلف الفردية. نظرا للطبيعة الديناميكية للتفاعلات داخل المجمعات البروتين، ويمكن اقترح أن هذا الأسلوب يسمح تحديد مثبطات ضد editosome البروتينات في أكثر ممثل بيولوجيا وضع 24. بالإضافة إلى ذلك، استهدفت مجمع كامل editosome يوفر فرصة لاعتقال يحتمل تطور تحرير الحمض النووي الريبيعلى مختلف الخطوات عابرة التي لم يتم تحديدها سابقا. وبالتالي، فإن هذه التقنية تسمح تكتسب منظورا أفضل لتفاعلات والأنشطة التي تعتبر حاسمة بالنسبة لعملية تحرير الحمض النووي الريبي. وقد وجد هذا النهج لتكون ناجحة في الماضي كما يتضح من استجلاء بدائية النواة التجمع المعقدة الريبوسوم وظيفة باستخدام المضادات الحيوية، مثل فيوميسين والاريثروميسين، بوصفها مثبطات مجمع 24،25.
لضمان الانتهاء بنجاح من الأسلوب، قد بعض التعديلات في بروتوكولات تكون ضرورية. الأولى، واختيار المناسب الجلسرين التدرج استخراج جزء الميتوكوندريا أمر بالغ الأهمية. هنا، والكسور من 7 إلى 11، والمقابلة لمنطقة ~ 20S من التدرج، أظهرت أعلى نشاط والتحرير، مع جزء 9 واظهار أقصى قدر من النشاط. على الرغم من أن تم اختيار هذا الكسر لكافة الاختبارات المقدمة، فمن الضروري اختبار جميع الكسور مسبقا من أجل تقييم الذي FRAكشن القمم النشاط التحرير. الثانية، للتحقق من صحة اختيار جزء، فمن الأهمية بمكان لأداء الاختبارات الأولية لتقييم نسبة الإشارة إلى الضوضاء عن طريق حساب قيمة Z'عامل. إذا كان قد تم الانتهاء السليم الميتوكوندريا استخراج الجلسرين التدرج تجزئة، يمكن تحقيق القيمة Z'0.6. المقبل، فمن المستحسن لإعادة تقييم حجم رد الفعل من استخراج الميتوكوندريا اللازمة لتحقيق النشاط تحرير الأقصى عبر المعايرة 19.
قيود هامة للتقنية المقدمة في هذه الورقة تتعلق عملية شاقة وتستغرق وقتا طويلا للتجزئة الميتوكوندريا استخراج الجلسرين التدرج التي يتم من خلالها تنقية معقدة editosome 19. على الرغم من هذه العيوب، ويقترح هذا الأسلوب تفضيلي للحصول الكسور editosome الخام نظرا لانخفاض تكلفتها المحتملة مقابل العائد، وبالتالي تأهيله للتطبيق على الفرز الفائق الإنتاجية. في المقابل، وسائل أخرى مثل TAP-العلامة بوrification، والتي هي قادرة على إعطاء المزيد من الكسور editosome النقية، هي الأفضل لانخفاض الإنتاجية إلى فحوصات المتوسطة مثل في حالة المقايسات الثانوية. علاوة على ذلك، من أجل ضمان تأثير مثبط محددة من المركبات، فمن الضروري أن تشمل الضوابط لاختبار لهم ضد نشاط ribozyme (A6Rbz) في غياب editosome. تجدر الإشارة إلى أن دراسات سابقة قد سلطت الضوء أن هذه الطريقة قد تكون غير فعالة في حساب القيم IC50 للمركبات مثل صبغ بسبب تداخل محتمل في تركيزات عالية مركب 19.
لزيادة حساسية هذه التقنية HTS قدم، ووضع مقايسة على أساس مضان مماثلة تشمل ما قبل المشقوق ribozyme تحريرها قبل هو مفيد. هذا من شأنه أن يسمح تجاوز endonucleolytic خطوة الانقسام معدل الحد يحفزه endonucleases في مجمع editosome. سيكون ميزة أخرى لهذا الاختبار أن يكون التطبيق تعديل كأداة فحص الثانويةلرصد تأثير مثبطات تحديدها من خلال الشاشة الرئيسية على ExoUase، TUTase وربط الأنشطة الحفازة. مقايسة المقترحة حاليا يقتصر على الكشف عن مثبطات ضد نوع حذف تحرير الحمض النووي الريبي. وبالتالي، فإن سبيلا آخر لاستكشاف يكون التعديل للمقايسة قدم لتمكين رصد آثار مجمع على نوع الإدراج التحرير الحمض النووي الريبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDM-79 Medium | Gibco by Life Technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 | heat inactivation at 55 °C for 1 hr |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2 ml | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1 kg | Life Technologies | AM9902 |
References
- Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
- Hajduk, S., Ochsenreiter, T.
- Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).
- Seiwert, S. D., Stuart, K. RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro. Science. 266, 114-117 (1994).
- Weng, J., et al. Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids. Molecular. 32, 198-209 (2008).
- Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex. RNA. 14, 970-980 (2008).
- Ammerman, M. L., et al. Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1. Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).
- Huang, C. E., O'Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein. Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).
- Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes. Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).
- Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).
- Schnaufer, A., et al. An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Science. 291, 2159-2162 (2001).
- Tarun, S. Z., et al. KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei. RNA. 14, 347-358 (2008).
- Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A.
- Denise, H., Barrett, M. P. Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness. Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).
- Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84, 831-841 (1996).
- Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing. Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).
- Igo, R. P. Jr, et al. Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing. Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).
- Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing. RNA. 8, 548-554 (2002).
- Moshiri, H., Salavati, R. A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens. Nucleic Acids Res. 38, e138 (2010).
- Jenne, A., et al. Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology. Nature. 19, 56-61 (2001).
- Hartig, J. S., et al. Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time. Nature. 20, 717-722 (2002).
- Famulok, M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).
- Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein. Science. 260, 1816-1819 (1993).
- Jurica, M. S. Searching for a wrench to throw into the splicing machine. Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).
- Spahn, C., Prescott, C. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus. Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).
