Abstract
Um progresso substancial foi feito para determinar o mecanismo de edição de RNA mitocondrial em tripanossomas. Da mesma forma, um progresso considerável foi feito na identificação dos componentes do complexo editosome que catalisam edição RNA. No entanto, ainda não está claro como as proteínas funcionam juntos. Os compostos químicos obtidos a partir de uma tela de alto rendimento contra o editosome pode bloquear ou afectar um ou mais passos no ciclo de edição. Portanto, a identificação de novos compostos químicos que geram sondas moleculares valiosos para dissecar a função editosome e montagem. Em estudos anteriores, os ensaios in vitro de edição foram realizadas utilizando ARN marcado com rádio. Estes ensaios são demorados, ineficiente e inadequado para fins de alto rendimento. Aqui, um baseado em fluorescência homogênea "misturar e medir" ensaio repórter martelo ribozyme in vitro para monitorar a edição de RNA, é apresentado. Apenas como conseqüência da edição de RNAa ribozima uma transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) do substrato oligoribonucleotide sofre clivagem. Isto por sua vez resulta na separação do fluoróforo do extintor, produzindo assim um sinal. Em contraste, quando a função editosome é inibida, o sinal de fluorescência será extinta. Este é um método altamente sensível e simples, que devem ser aplicadas para controlar a edição de ARN in vitro ou elevado rendimento de rastreio de produtos químicos que podem inibir a função editosome.
Introduction
O processo de edição de RNA, uma modificação mRNA pós-transcricional, foi descoberto pela primeira vez em tripanosomatídeos 1. Desde então, o trabalho substancial foi realizada em estudar o mecanismo por trás edição de RNA em Trypanosoma brucei 2,3. Em uma série de reacções enzimáticas, a editosome, um complexo de núcleo de cerca de 20 proteínas, cria mRNAs mitocondriais maduros para vários componentes do sistema de geração de energia a fosforilação oxidativa. A ordem dos eventos catalíticos é clivagem endonucleolítica, uridylate (U) adição ou exclusão, e ligadura, como ditado por RNAs guia (gRNAs) 4.
Além das proteínas complexas editosome núcleo, um certo número de factores acessórios também foram identificadas 5-7. Estas proteínas são vistas principalmente agrupadas em complexos independentes. No entanto, a ordem de montagem de proteínas no complexo editosome núcleo e os padrões de interacção do complexo de núcleo com o acessóriocomplexos estão ainda a ser determinado. Visando o processo de edição de RNA em tripanosomatídeos pode fornecer dissectores químicas que ajudam no estudo do conjunto e de função do complexo editosome. Além disso, estudos funcionais em várias proteínas editosome mostraram essencialidade em diferentes fases da vida, indicando o seu potencial como droga atinge 8-12. Portanto, os inibidores da editosome encontrados também podem actuar como compostos de chumbo contra tripanosomatideos. Este é oportuna, como drogas atualmente disponíveis contra doenças causadas por tripanossomatídeo são tóxicos, ineficiente e caro 13,14.
Um ensaio eficiente e conveniente in vitro é necessário explorar o universo químico para inibidores específicos que bloqueiam edição RNA. Três ensaios foram desenvolvidos e utilizados para monitorar editosome atividades: (a) volta completa em ensaio edição de RNA in vitro 15, (b) pré-clivada em ensaio edição de RNA in vitro 16,17, umª ensaio 18 (c) martelo ribozyme (HHR)-based. Os dois primeiros ensaios de contar com visualização direta do produto editado (ATPase 6 mRNA) com a ajuda de radioatividade. O ensaio baseia-HHR utiliza uma versão modificada da ATPase 6 ARNm que é modelada para se comportar como um ribozima mediante edição. A ribozima funcional então cliva especificamente um substracto de ARN marcado radioactivamente, que serve como um repórter. Recentemente, Moshiri et al. Desenvolveu um "misturar e medir 'HHR-base no ensaio in vitro repórter para monitorizar a edição de ARN em que o substrato de RNA marcado radioactivamente é substituído por uma transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) do substrato 19. As principais vantagens deste ensaio são os seguintes: (a) é uma mistura rápida e conveniente e medida do tipo de ensaio, como a produção de ribozima activa e substrato de clivagem ocorrer simultaneamente no mesmo tubo em baixo volume (isto é, 20 mL), (b ) que evita a utilização de materiais marcados radioactivamente, (c), que é uma sensibilidadefforded por instrumentação de fluorescência em um formato de placa de micro-titulação, e (d) um sinal de alta-ruído. Utilizando este ensaio, o efeito de inibidores conhecidos de ligase de RNA de edição contra editosome purificada foi confirmada 19. Este experimento validou o ensaio para a rápida identificação de inibidores de edição de RNA, principalmente contra editosomes inteiros de T. brucei.
A Figura 1 é um esquema detalhado passo-a-passo do ensaio na edição de ARN in vitro baseados em fluorescência. Este protocolo pode ser utilizado para monitorizar a edição de ARN in vitro ou ser facilmente adaptado para o rastreio de bibliotecas de compostos de diversas escalas.
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Protocol
O protocolo que se segue descreve o processo para a realização do ensaio de edição de ARN baseada em fluorescência. O ensaio pode ser realizado num tubo de PCR, 96 bem-, ou placas de 384 poços, consoante o âmbito da experiência. Subsequentemente, o sinal de fluorescência pode ser lida em tempo real, um sistema de detecção de PCR adequados. O ensaio aqui descrito no contexto de placas de 384 poços.
1. T. A cultura brucei Células
- Prepare um meio de crescimento para T. brucei procíclicos formam células. Para 1 litro de meio:
- Dissolver 25,4 g SDM-79 em pó em 800 ml de água MiliQ.
- Adicionar 2 g de NaHCO3 e o pH para 7,3 com NaOH 10 M.
- Adicionar água nanopura para um volume final de 900 ml, filtro de esterilizar.
- Adicionar Soro Fetal Bovino (FBS), penicilina-estreptomicina a solução e hemina (2,5 mg / ml) para uma concentração final de 10% (v / v), 100 U / ml e 7,5 mg / L, respectivamente.
- Crescer 300 ml de T. <in> brucei 1.7A tipo selvagem (forma procíclicos) as células a 28 ° C, agitando a 70 rpm para uma densidade de 1,5 x 10 7 células / ml. NOTA: Este deve produzir 3 ml de editosome activo com ~ 0,5 mg de proteína total, suficiente para 600 reacções de edição.
- Colher as células por centrifugação a 6000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Lavar o sedimento com 50 ml de tampão de PBSG gelado (10 mM de Na 2 HPO 4, 10 mM de NaH 2 PO 4, NaCl 145 mM, e glucose 6 mM), e girar as células novamente por centrifugação a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
2. Isolamento de mitocôndrias Crude
NOTA: Todos os passos devem ser realizados em gelo ou a 4 ° C para preservar editosome actividade.
- Ressuspender as células colhidas em 30 ml de tampão de DTE (1 mM Tris-HCl pH 8,0 e EDTA 1 mM). Use um 40 ml homogeneizador Dounce estéril (pré-refrigerados) para interromper a membrana celular acariciando cima e para baixo pelo menos 10 vezes no gelo. Imediatamente adicionar 4,3 ml de 60% de sacarose (w / v, ou seja 1,75 M) ao homogenato para uma concentração final de 0,25 M. Centrifuga-se a 15.800 xg durante 10 min a 4 ° C, para trazer para baixo, preferencialmente mitocôndrias.
- Ressuspender o sedimento mitocondrial em 4,6 ml de tampão STM (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM de sacarose e 2 mM de MgCl 2). Adicionar 13.8 ul de 0,1 M de CaCl2 e 4 ul de ADNase I isenta de RNase para concentrações finais de 0,3 mM e 9 U / ml, respectivamente. Incubar a mistura durante 1 hora em gelo.
- Adicionar 4,6 ml de tampão STE (20 mM Tris-HCl pH 8,0, sacarose 250 mM e EDTA 2 mM), para inactivar a DNase I. Centrifugar a 15.800 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Ressuspender o sedimento em 400 ul de tampão de lise (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 10 mM MgCl 2, KCl 100 mM, 1 ug / ml de pepstatina, 1 mM de DTT, e 1 x completo de inibidor da protease livre de EDTA) e transferência para uma tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 10% de Triton X-100 para uma concentração final de 1% de umnd incubar o lisado durante 15 minutos a 4 ° C num rotor de tubo.
- Limpar o lisado mitocondrial por centrifugação duas vezes a 17,000 xg durante 15 min a 4 ° C; mantendo o sobrenadante clarificado de cada vez.
3. Editosome Purificação
- Despeje a 10 ml de 10% -30% (v / v), gradiente linear de glicerol (Tabela 1) em um tubo de ultracentrifugação usando tampão de gradiente de HHE 2x (40 mM de HEPES pH 7,9, 20 mM de Mg (OAc) 2, KCl 100 mM, e EDTA 2 mM) e uma máquina de gradiente, seguindo o manual de instruções.
- Remover cuidadosamente 500 mL de solução a partir do topo do gradiente de glicerol e carregar suavemente 500 ul de lisado mitocondrial apagada. Girar em 178.000 xg durante 6 horas a 4 ° C usando uma ultracentrífuga.
- Recolha fracções de 500 ul sequencialmente a partir do topo para o fundo do gradiente, a 4 ° C. Em seguida, encaixe congelar as frações, utilizando nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C até o uso.
- Recozer o molde de ADN contendo respectiva sequência complementar à sequência do promotor de T7 (Tabela 2) com um oligonucleótido do promotor de T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') numa razão molar de 1:1 por aquecimento a 90 ° C durante 3 min e arrefecer à TA durante pelo menos 10 min.
- Transcrever RNA usando um kit de transcrição in vitro, seguindo o manual de instruções.
- Parar a reacção de transcrição por adição de um volume igual de 7 M corante ureia (ureia 7 M, 0,05% de xileno Cynol, e 0,05% de azul de bromofenol). Correr num filtro esterilizado 9% desnaturante em gel de poliacrilamida (9% de acrilamida, 7 M de ureia, 1 x TBE).
- Use o sombreamento ultravioleta (UV) com uma lâmpada UV de ondas curtas para localizar e respectivo RNA especial de consumo. Coloque o pedaço de gel excisado num tubo de microcentrífuga e adicionar 400 ul de tampão de eluição em gel (20 mM Tris-HCl pH 7,5, NaOAc 250 mM, EDTA 1 mM e 0,25% de SDS). Eluir a noite à temperatura ambiente num rotor tubo.
- Precipitate o ARN eluído por adição de 1 ml de etanol frio a 100% e incubação, quer a -80 ° C durante 30 min ou a -20 ° C durante a noite.
- Centrifugar a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C, para precipitar o ARN para baixo.
- Lava-se a pelete com 1 ml de etanol a 75%. Centrifugar a 16000 xg durante 20 min a 4 ° C.
- Ressuspender o sedimento de ARN apropriada em RNase isenta de água para atingir as concentrações desejadas, como se mostra na Tabela 2.
5. Baseado em fluorescência Edição RNA Assay
- Para uma única reacção, combinar 1 pmol (1 ul) de preA6Rbz e 2,5 pmol (1 ul) de gA6Rbz (proporção molar 1:2,5), num tubo de microcentrífuga, incubar a 70 º C durante 3 min e deixar repousar à TA durante a pelo menos, 10 min.
- Enquanto isso preparar uma mistura principal utilizando a Tabela 3, sem o preA6Rbz e gA6Rbz, para a reacção de edição contendo tampão 1x EHH (25 mM de HEPES pH 7,9, 10 mM de Mg (OAc) 2, 50 mM de KCl e 10 mM de EDTA), 1 mMATP, 5 mM de CaCl2, 16 ng / mL de ARN de levedura Torula, 0,1% de Triton X-100, e o editosome purificada.
- Adicionar recozido preA6Rbz e gA6Rbz para completar a mistura principal.
- Dispensar 18 ul da mistura principal (Tabela 3) em poços contendo 2 ul de água isenta de RNase (poços sem compostos) ou 2 ul de 200 uM e compostos químicos incluem amostras de controlo na placa de acordo com a Figura 5.
- Selar a placa com o selador de placa e girar a placa para baixo, para remover as bolhas de ar. Incubar a 28 ° C durante 4 h.
- Adicionar 25 pmol (2 ul) de competidor gA6Rbz a cada poço. Coloque um novo aferidor, girar a placa para baixo e coloque-o em uma máquina de PCR em tempo real. Programe o seguinte experimento:
Passo 1: 85 ° C durante 5 min; Passo 2: 24 ° C durante 10 min; Passo 3: Pare. - Adicionam-se 15 pmol (1 ul) de substrato de FRET para cada poço a um volume final de 23 ul. Selar a placa com um novo aferidor.Girar rapidamente a placa e coloque-a de volta na máquina de PCR em tempo real.
- Programe um novo experimento com os seguintes passos:
Passo 1: 37 ° C durante 1 min; Passo 2: Leia; Passo 3: Vá para a Etapa 1, 40 vezes; Passo 4: Pare. - Instalação da placa, selecionando todos os poços que exigem leitura e escolher o filtro FAM. Volume de entrada de 23 mL e começar a correr.
- Calcular o declive dos valores obtidos a partir de cada poço / amostra para obter uma medição de cinética traçando as pistas sobre um gráfico de barras para análise. NOTA: A leitura cinética melhora a razão sinal-para-ruído entre a amostra e o fundo; como a amostra de fundo teria uma inclinação perto de zero. Uma leitura ponto final tem maior ruído de fundo.
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Representative Results
Para demonstrar os passos necessários para a criação de uma tela em grande escala, as Figuras 2-5 são experiências representativas de controlo relacionados com a qualidade do ensaio. Estas são experiências de controlo essenciais para um ensaio consistente ao longo de vários dias ou de rastreio para a comparação de diferentes telas.
Avaliação da fluorescência Relação sinal-ruído
Para assegurar a estabilidade e a qualidade do substrato oligoribonucleotide marcado com fluoresceína numa configuração de larga escala, Z'-fator, definida como a diferença entre o fundo do ensaio e do sinal máximo foi calculado usando a molécula de ribozima activa (A6Rbz). . Ensaios com Z'-factor de> 0,5 são considerados aceitáveis para a tela de alto rendimento A Figura 2 mostra os dados representativos, utilizando o substrato de FRET marcado com 5 'fluoresceína (FAM; emissor) e 3' de N, N '-tetramethylrhodamine (TAMRA; supressor) (A6Rbz_F / T). Este substrato produzido um factor-Z'de 0,64, quando calculada utilizando 72 repetições na presença e na ausência de A6Rbz.
Neste ensaio um substrato alternativo usando Iowa Preto supressor escuro (A6Rbz_F/Ib) pode render uma melhor relação sinal-ruído em comparação com TAMRA. Isso ocorre porque Iowa Preto, ao contrário TAMRA, emite energia absorvida na forma de calor e não de luz. O Z'fator obtido usando o FAM / Iowa Preto (F / Ib) marcado com substrato foi de 0,68. A melhoria da Z'-fator para o substrato F / Ib marcado sobre substrato TAMRA marcado é por causa de seus antecedentes relativamente menor. Estes resultados representativos mostram que ambos os substratos são opções viáveis para utilização em uma tela de alto rendimento.
Determinar as atividades de edição de glicerol Gradiente Frações
Para determinar e selecionar as frações editosome mais ativos para os experimentos, o glycerol fracções de gradiente foram testados para a edição in vitro utilizando o ensaio baseado em fluorescência (Passo V). Estes dados mostram (Figura 3) fracções 7-12 que as fracções mais activas (≥ 50% de actividade de edição; com a fracção mais activa como 100%). Estas fracções podem ser combinadas, quando mais editosome é necessária.
Calculando o fator Z'quando as frações Editosome foram combinados
Para determinar o efeito de combinig a fracção editosome, o valor Z'-fator de 0,6 foi calculada quando as fracções mais activas (F8 + + F9 F10) foram usados como a fonte de editosome. Para calcular o factor-Z'72 repetições foram testados na presença e ausência do editosome (Figura 4). O substrato F / Ib foi utilizado neste experimento. Estes dados mostram que, com base no factor de Z'-, combinando as fracções do gradiente de glicerol tem um efeito mínimo sobre a qualidade do ensaio.
ass = "jove_content"> Experiência de Controle Representante para a Assay
Dados representativos comparando diferentes amostras de controle foram utilizados para analisar as variáveis do ensaio. Como mostrado na Figura 5, as reacções ausentes quaisquer componentes de edição de ARN (reacções 1-4) não clivar o substrato. A clivagem do substrato tal como medido por fluorescência e em relação a actividade de edição é observado apenas na presença de todos os componentes das reacções de edição, na ausência de um inibidor (reacção 5) ou na presença de todos os componentes de edição e um composto inactivo (reação 6). Em contraste, um composto inibidor pode bloquear a edição de ARN e é utilizada como um controle positivo (de reacção 7). Aqui, o preto mordente (MrB) e compostos C53 foram utilizadas como controlos positivos e negativos, respectivamente.
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Figura 1. Hammerhead no ensaio de edição de ARN in vitro baseados em ribozima. A) representação Passo-a-passo esquemática do ensaio em edição vitro baseados em fluorescência: (a) A hibridização do ribozima pré-editado (A6Rbz pré-editado) com o seu guia de RNA (gA6Rbz). (B) O reconhecimento ea interação do duplex RNA pelo complexo editosome purificada. (C) Eliminação de edição de ARN catalisada pela editosome. (D) A dissociação do A6Rbz editado do editosome e gA6Rbz por aquecimento a 85 ° C e adição de guia concorrente ARN (gA6Rbz_comp). (E) A hibridização do substrato FRET com a ribozima ativo A6 (A6Rbz ativa). (F) A detecção de sinais FAM seguintes clivagem do substrato de FRET pela ribozima activo. B) A ribozima pré-editado (pré-editado A6Rbz) é mostrada em associação com gA6Rbz que especifica a deleção de três nós (arro de duas pontasw) a partir do local de edição (ES). Como um resultado de edição de ARN na presença de editosome funcional da ribozima inactiva é editado na sua forma activa (A6Rbz editado), que agora podem clivar o substrato FRET (local de clivagem indicado pela seta). O conservada é destaque 5'-CUGA-3 'do A6Rbz editado no núcleo catalisador essencial para a atividade ribozyme (local editado) (Este valor foi modificado a partir Moshiri 19). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Signal-to-noise comparação razão entre substratos FRET abrigando quenchers diferente. Ribozyme (A6Rbz) atividade usando FAM / TAMRA (F / T) e FAM / Iowa Preto FQ (F / Ib) substratos. A represe eixo ynts fluorescência unidade arbitrária (FAU) por minuto.
RNA atividade edição Figura 3. Dos selecionados frações obtidas a partir de gradiente de glicerol centrifugação do lisado mitocondrial. Fração # 9 (F9) tem a maior atividade. O eixo y representa a actividade relativa de edição em percentagem, considerando F9 como 100%.
Variação experimental Figura 4. Cálculo Z'-fator usando as fracções mais activas (F8 + + F9 F10) como a fonte editosome. Foi obtido a partir de 72 réplicas de cada tipo de reacção. Z'fatores foi calculada como 0,6. O eixo y representa a atividade de edição relativo.
Figura 5. Experimento representativas para o ensaio de edição de ARN baseada em fluorescência. Reacções foram realizadas num volume final de 20 ul por cavidade e CFX384 TouchTM em tempo real, o sistema de detecção de PCR foi utilizado para medir o sinal de fluorescência. O gráfico apresenta os vários controlos para além de uma reacção de edição completo que contém todos os componentes para o ensaio (# 5). A fluorescência foi medida na presença de substrato de FRET sozinho (# 1) para avaliar a integridade do substrato. Amostra # 2 foi realizado na ausência do editosome para monitorizar qualquer actividade ribozima antes da edição. Para avaliar o efeito de editosome desnaturado sobre o substrato, a fluorescência foi medida na presença do substrato e editosome FRET apenas (n º 3). Para testar a edição especificidade dirigida-guia, um samplo, na ausência de gA6Rbz foi usado (# 4). Um não-inibição (C53, # 6) e um composto inibidor (MrB, # 7) foram usados para testar o efeito sobre o ensaio de edição. Durante a edição de RNA é significativamente inibida por MrB, C53 tem efeito desprezível. As barras de erros correspondem a uma variação experimental (desvio padrão) entre 10 repetições. O eixo y representa a actividade relativa em percentagem de edição, considerando a reacção completa (# 5) como 100%.
| 10% | 30% | |
| Tampão gradiente 2x HHE | 5 ml | 5 ml |
| Glicerina | 1 ml | 3 ml |
| DEPC H2O | 4 ml | 2 ml |
| DTT 1 M | 10 ul | 10 ul |
Tabela 1. 10% e 30% de glicerol Solution (10 ml cada).
| Pré-editado A6 Ribozyme (preA6Rbz) | |
| molde de ADN preA6Rbz | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCA TCAAAAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTT CCCTATAGTGAGTCGTATTA CC -3 ' |
| preA6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUUUUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGA UCAAAUGU-3 ' |
| RNA estoque conc. | 1 uM |
| Guia A6 Ribozyme (gA6Rbz) | |
| molde de ADN gA6RBz | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATAATTATCATATCACTGT CAAGGGAAAGTTGTGAGGGTGATGAGTCCGTGTATATCC CTATAGTGAGTCGTATTA CC -3 ' |
| gA6Rbz RNA | 5'-GGGAUAUACACGGACUCAUCACCCUCACAACUU UCCCUUGACAGUGAUAUGAUAAUUAUUUUUUUUUUUUUUUUU-3 ' |
| RNA estoque conc. | 2,5 fiM |
| Guia A6 Ribozyme Concorrente (gA6RBz_comp) | |
| molde de ADN gA6Rbz_comp | 5'-GGATATACACGGACTCATCACCCTCACAACTTTC CCTTGACAGTGATATGATAATTATTTTTTTTTTTTTTTTT CCCTAT AGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz_comp RNA | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAUAAUUAUCAUAUCACUG UCAAGGGAAGUUGUGAGGGUGAUGAGUCCGUGUAUAUCC-3 ' |
| RNA estoque conc. | 12,5 mM |
| Atividade A6 Ribozyme (A6RBz) | |
| A6Rbz DNA molde | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCAT CAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTTCC CTATAGTGAGTCGTATTA CC -3 ' |
| A6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGAUCA AAUGU-3 ' |
| RNA estoque conc. | 1 uM |
| FRET substrato | |
| TAMRA supressor | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-TAMRA-3 '(Eurogentec) |
| Iowa Preto supressor | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-Iowa Black-3 '(IDT) |
| RNA estoque conc. | 15 uM (para ambos) |
Tabela 2. Moldes de ADN e ARN de substratos.
| Composição | Edição reação (mL) |
| 10x HHE | 1.5 |
| 0,1 M de CaCl2 | 1 |
| ATP 100 mM | 0,2 |
| 10% Triton X-100 | 0,2 |
| 500 ng / mL de ARN de levedura Torula | 1 |
| Editosome | 5 |
| RNase livre H 2 O | 7.1 |
| 1 uM preA6Rbz | 1 |
| 2,5 uM gA6Rbz | 1 |
| Total | 18 |
Composição Tabela 3. Reacção e Master Mix.
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Discussion
Um método de triagem romance de alto rendimento para identificar inibidores contra o complexo RNA edição de Tripanossomas foi apresentado, fornecendo uma nova ferramenta para a descoberta de medicamentos para combater as doenças causadas por tripanosomatídeos. Ensaio ribozyme baseado trastes tem sido amplamente utilizado para diferentes fins 20-22; no entanto, nós utilizamos a capacidade de ensaio ribozyme baseado em FRET para o monitoramento in vitro de edição de RNA atividade 19. Este ensaio poderia ser adaptado a outros tipos de edição de ARN em eucariotas, tais como a edição de substituição de nucleótidos de ARN codificados-núcleo de mamíferos 23.
A novidade deste ensaio não é no estabelecimento de ensaios de ribozimas baseadas em FRET, por si só, mas no desenvolvimento de um método que incorpora esta técnica num ensaio de edição de ARN que é passível de rastreio de alto rendimento de produtos químicos contra editosome. O método baseado na análise de ribozima tem várias vantagens sobre outros ecrãs e traseiroays actualmente utilizadas para este fim. Especificamente, a técnica proporciona um ensaio sensível e reprodutível "mix-and-medida" depender de um substrato fluorescente em oposição a um radiomarcado, tornando-o adequado para rastreio de alto rendimento 19. A monitorização em tempo real de um sinal de fluorescência após a adição do substrato, em vez de um simples sinal de ponto final torna possível determinar com mais precisão os valores de IC50 dos compostos ensaiados 19. Além disso, permite o teste dos efeitos inibitórios dos compostos sobre o complexo inteiro-editosome em oposição às proteínas recombinantes individuais. Dada a natureza dinâmica das interações dentro de complexos de proteína, pode-se sugerir que este método permite a identificação de inibidores contra editosome proteínas em um representante mais biologicamente criação 24. Além disso, tendo como alvo o complexo inteiro-editosome fornece uma oportunidade para potencialmente parar a progressão da edição de ARNem vários passos transitórios que não foram previamente identificadas. Assim, a técnica vai permitir ganhar uma perspectiva melhor quanto às interações e atividades que são cruciais para o processo de edição de RNA. Esta abordagem tem sido encontrado para ser bem sucedido no passado, tal como exemplificado pela elucidação de montagem complexo ribossoma procariótico e função utilizando antibióticos, tais como eritromicina e viomicina, actuando como inibidores do complexo 24,25.
Para garantir a conclusão bem sucedida do método, determinados ajustes nos protocolos podem ser necessários. Em primeiro lugar, a seleção do gradiente de glicerol fração própria extrato mitocondrial é crucial. Aqui, frações 7 a 11, o que corresponde à região ~ 20S do gradiente, apresentou a maior atividade edição, com fração de 9 exibindo atividade máxima. Apesar de esta fracção foi seleccionada para todos os testes apresentados, é essencial para testar todas as fracções de antemão, de modo a avaliar em que fracção os picos de atividade edição. Em segundo lugar, para validar a selecção fracção, que é crítico para efectuar testes preliminares para avaliar a relação de sinal-para-ruído através do cálculo do valor Z'-fator. Se adequado mitocondrial extracto glicerol gradiente fraccionamento foi completada, um valor-Z'de 0,6 pode ser conseguida. A seguir, recomenda-se a re-avaliar o volume de reacção de extracto mitocondrial necessário para alcançar a actividade máxima de edição através de titulação de 19.
Uma importante limitação da técnica apresentada neste artigo refere-se ao processo trabalhoso e demorado de mitocondrial fracionamento gradiente extrato glicerol pelo qual o complexo editosome é purificado 19. Apesar dessas desvantagens, essa técnica é preferencialmente sugerido para obter fracções editosome bruto dado o seu baixo custo versus potencial de rendimento, qualificando-a, assim, para a aplicação de high-throughput screening. Em contraste, outros métodos, tais como TAP-tag purification, que são capazes de dar fracções editosome mais purificadas, são aconselháveis para baixo para os ensaios de rendimento médio, como no caso de ensaios secundários. Além disso, a fim de assegurar um efeito inibidor específico de compostos, é necessário incluir controlos para testá-las contra a actividade de ribozima (A6Rbz) na ausência do editosome. Deve notar-se que os estudos anteriores tenham realçado que este método pode ser ineficaz no cálculo dos valores de IC50 para os compostos de corantes semelhante, devido à possível interferência com concentrações elevadas de compostos 19.
Para aumentar ainda mais a sensibilidade da técnica HTS apresentado, o desenvolvimento de um ensaio baseado em fluorescência semelhante envolvendo a pré-clivada ribozima pré-editado é benéfico. Isto iria permitir que contornando o passo de clivagem limitante da velocidade endonucleolítica catalisada por endonucleases do complexo editosome. Outra vantagem deste ensaio modificado seria o aplicativo como uma ferramenta de triagem secundáriapara monitorizar o efeito dos inibidores identificados através do rastreio primário na ExoUase, TUTase actividades catalíticas e de ligação. O ensaio actualmente proposto é limitado à detecção de inibidores contra o tipo de supressão de RNA edição. Portanto, uma outra via para explorar seria a modificação do ensaio apresentado, para permitir a monitorização dos efeitos de compostos sobre o tipo de inserção de edição de ARN.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDM-79 Medium | Gibco by Life Technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 | heat inactivation at 55 °C for 1 hr |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2 ml | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1 kg | Life Technologies | AM9902 |
References
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