Abstract
Des progrès substantiels ont été accomplis dans la détermination du mécanisme de l'édition de l'ARN mitochondrial chez les trypanosomes. De même, des progrès considérables ont été réalisés dans l'identification des composants du complexe de éditosome qui catalysent édition de l'ARN. Cependant, il n'est pas encore clair comment ces protéines fonctionnent ensemble. Les composés chimiques obtenus à partir d'un écran à haut débit contre la éditosome peuvent bloquer ou affecter une ou plusieurs étapes du cycle d'édition. Par conséquent, l'identification de nouveaux composés chimiques va générer des sondes moléculaires utiles pour disséquer la fonction de éditosome et l'assemblage. Dans des études antérieures, des essais in vitro de modification ont été réalisées en utilisant l'ARN radiomarqué. Ces tests prennent du temps, inefficace et inadapté à des fins à haut débit. Ici, une base de fluorescence homogène "mélanger et mesurer" marteau ribozyme test in vitro de reporter à surveiller édition de l'ARN, est présenté. Qu'à la suite de l'édition d'ARN d'le ribozyme en tête de marteau d'un substrat de oligoribonucléotide transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET) subit un clivage. Ceci à son tour conduit à la séparation du fluorophore de l'agent d'extinction en produisant ainsi un signal. En revanche, lorsque la fonction de éditosome est inhibé, le signal de fluorescence est éteinte. Il s'agit d'un test très sensible et simple qui devrait être généralement applicables à surveiller dans l'édition de l'ARN in vitro ou criblage à haut débit de produits chimiques qui peuvent inhiber la fonction de éditosome.
Introduction
Le processus d'édition de l'ARN, une modification de l'ARNm post-transcriptionnelle, a été découvert en trypanosomatidés 1. Depuis lors, d'importants travaux ont été réalisés en étudier le mécanisme derrière édition de l'ARN chez T. brucei 2,3. Dans une série de réactions enzymatiques, la éditosome, un complexe de base de l'ordre de 20 protéines, crée des ARNm matures mitochondriales pour plusieurs composants du système de la phosphorylation oxydative de la production d'énergie. L'ordre des événements est catalytiques clivage endonucléolytique, uridylate (U) ajout ni suppression, et la ligature, comme dicté par ARN guides (ARNg) 4.
En plus des protéines essentielles éditosome complexes, un certain nombre de facteurs accessoires ont également été identifiés 5-7. Ces protéines sont observés essentiellement regroupés dans les complexes indépendants. Cependant, l'ordre d'assemblage des protéines dans le complexe de éditosome de base et les modèles d'interaction du complexe de base de l'accessoirecomplexes sont encore à déterminer. Cibler le processus d'édition de l'ARN dans trypanosomatidés peut fournir aux ciseaux chimiques que l'aide à l'étude de l'assemblage et de la fonction du complexe éditosome. En outre, des études fonctionnelles sur plusieurs protéines éditosome ont montré essentialité dans les différents stades de la vie, en indiquant leur potentiel en tant que médicament cible 8-12. Par conséquent, les inhibiteurs de la éditosome trouvés peuvent également agir en tant que composés de plomb contre trypanosomatidés. C'est rapide, comme les médicaments actuellement disponibles contre les maladies causées par trypanosomatide sont toxiques, inefficace et coûteux 13,14.
Un essai in vitro efficace et pratique est nécessaire d'explorer l'univers chimique d'inhibiteurs spécifiques qui bloquent édition de l'ARN. Trois tests ont été mis au point et utilisé pour surveiller éditosome activités: (a) tour complet test in vitro de l'édition de l'ARN 15, (b) pré-coupés test in vitro de l'édition de l'ARN 16,17, une (c) ribozyme en tête de marteau (RHS) à base de dosage 18. Les deux premiers essais reposent sur la visualisation directe du produit modifié (ATPase six ARNm) avec l'aide de la radioactivité. L'analyse basée sur la HHR utilise une version modifiée de l'ATPase 6 ARNm qui est modélisée à se comporter comme un ribozyme à l'édition. Le ribozyme fonctionnelle clive ensuite spécifiquement un substrat d'ARN radiomarqué, servant en tant que journaliste. Récemment, Moshiri et al. Développé un "mélange et mesure" HHR-fondé en essai rapporteur in vitro pour surveiller édition de l'ARN, où le substrat de l'ARN radiomarqué est remplacé par un transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) du substrat 19. Les principaux avantages de ce dosage sont les suivants: (a) il s'agit d'un mélange rapide et commode et le type de dosage de mesure, comme la production de ribozyme actif et clivage du substrat se produisent simultanément dans le même tube à faible volume (20 ul), (b ) elle permet d'éviter l'utilisation de matières radiomarquées, (c) la sensibilité qui est unfforded par fluorescence instrumentation dans un format de plaque de micro-titrage, et (d) un signal de niveau haut par rapport au bruit. En utilisant ce dosage, l'effet des inhibiteurs connus de l'ARN ligase de montage de contre éditosome purifié a été confirmée 19. Cette expérience a validé le test pour l'identification rapide des inhibiteurs de l'édition de l'ARN, principalement contre editosomes entiers de T. brucei.
La figure 1 est un schéma détaillé étape par étape de l'essai in vitro de l'édition de l'ARN à base de fluorescence. Ce protocole peut être utilisé soit pour la surveillance de l'édition de l'ARN in vitro ou facilement être adapté pour le criblage de banques de composés de diverses échelles.
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Protocol
Le protocole ci-dessous décrit la procédure pour effectuer l'ARN essai de montage à base de fluorescence. Le dosage peut être effectué dans un seul tube de PCR, 96 puits ou 384 puits en fonction de la portée de l'expérience. Ensuite, le signal de fluorescence peut être lu sur un système de détection de PCR en temps réel approprié. Le dosage est décrit ici dans le contexte de plaques à 384 puits.
1. T. La culture Les cellules brucei
- Préparer un milieu de croissance de T. brucei procyclique forment des cellules. Pour 1 litre de milieu:
- Dissoudre SDM-79 poudre de 25,4 g dans l'eau de 800 ml.
- Ajouter 2 g de NaHCO 3 et pH à 7,3 avec du NaOH 10.
- Ajouter de l'eau nanopure jusqu'à un volume final de 900 ml, stériliser par filtration.
- Ajouter de sérum bovin fœtal (FBS), de la pénicilline-streptomycine et de la solution d'hémine (2,5 mg / ml) à des concentrations finales de 10% (v / v), 100 U / ml et 7,5 mg / L respectivement.
- Cultivez 300 ml de T. <em> brucei 1.7A type sauvage (de forme procyclique) cellules à 28 ° C, en agitant à 70 tours par minute à une densité de 1,5 x 10 7 cellules / ml. NOTE: Ceci devrait produire 3 ml de éditosome actif avec ~ 0,5 mg de protéine totale, suffisante pour 600 réactions de modification.
- Récolter les cellules par centrifugation à 6000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Laver le culot avec 50 ml de tampon de PBSG refroidi (10 mM de Na 2 HPO 4, 10 mM de NaH 2 PO 4, NaCl 145 mM et glucose 6), et centrifuger les cellules à nouveau par centrifugation à 10 000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
2. Isolement des mitochondries brut
NOTE: Toutes les étapes doivent être effectuées sur la glace ou à 4 ° C pour préserver éditosome activité.
- Remettre en suspension les cellules récoltées dans 30 ml de tampon DTE (1 mM Tris-HCl pH 8,0 et 1 mM EDTA). Utilisez un 40 ml stérile homogénéisateur Dounce (pré-réfrigérées) pour perturber la membrane cellulaire en caressant de haut en bas au moins 10 fois sur la glace. Immédiatement ajouter 4,3 ml de saccharose à 60% (poids / volume, c'est à dire 1,75 M) à l'homogénat à une concentration finale de 0,25 M. Centrifuger à 15 800 g pendant 10 min à 4 ° C, de préférence vers le bas pour amener les mitochondries.
- Reprendre le culot mitochondrial dans 4,6 ml de tampon STM (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM de saccharose et 2 mM de MgCl2). Ajouter 13,8 ul de 0,1 M de CaCl2 et 4 ul de DNase sans RNase I à des concentrations finales de 0,3 mM et de 9 U / ml, respectivement. Faire incuber le mélange pendant 1 heure sur de la glace.
- Ajouter 4,6 ml de tampon STE (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM de saccharose et de l'EDTA 2 mM) pour inactiver la DNase I. Centrifuger à 15 800 g pendant 10 min à 4 ° C.
- Remettre en suspension le culot dans 400 pl de tampon de lyse (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 10 mM MgCl 2, 100 mM de KCl, 1 ug / ml de pepstatine, 1 mM de DTT, et l'inhibiteur de protéase de 1x complet sans EDTA) et le transfert à un tube de centrifugeuse.
- Ajouter 10% de Triton X-100 à une concentration finale de 1% parnd incuber le lysat pendant 15 minutes à 4 ° C sur un agitateur de tubes.
- Désactivez le lysat mitochondrial par centrifugation à deux reprises à 17 000 g pendant 15 min à 4 ° C; en conservant le surnageant clarifié chaque fois.
3. Éditosome Purification
- Verser 10 ml de 10% -30% (v / v) gradient linéaire de glycérol (tableau 1) dans un tube d'ultracentrifugation en utilisant un tampon à gradient 2x HHE (40 mM HEPES pH 7,9, mM de Mg 20 (OAc) 2, 100 mM de KCl, et 2 mM EDTA) et une machine à gradient en suivant le manuel d'instruction.
- Retirez délicatement 500 pi de solution à partir du haut de la pente de glycérol et charger doucement 500 pi du lysat mitochondrial dégagé. Spin à 178 000 g pendant 6 heures à 4 ° C en utilisant une ultracentrifugation.
- Collecter des fractions de 500 ul de manière séquentielle à partir du haut vers le bas de la pente à 4 ° C. Puis enclenchez geler les fractions en utilisant de l'azote liquide et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
- Recuire la matrice d'ADN respective contenant une séquence complémentaire de T7 séquence promotrice (tableau 2) avec un oligonucléotide promoteur T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') dans un rapport molaire de 1:1 par chauffage à 90 ° C pendant 3 min et le refroidissement à la température ambiante pendant au moins 10 min.
- Transcrire l'ARN en utilisant un kit de transcription in vitro en suivant le manuel d'instruction.
- Arrêter la réaction de transcription en ajoutant un volume égal d'urée 7 M colorant (7 M d'urée, 0,05% Xylène Cynol, et 0,05% de bleu de bromophénol). Fonctionner sur un filtre stérilisé à 9% gel de polyacrylamide dénaturant (9% d'acrylamide, urée 7 M, TBE 1x).
- Utilisez l'observation ultraviolet (UV) avec une lampe UV à ondes courtes pour localiser et accise ARN respectif. Placer le morceau de gel excisée dans un tube de centrifugeuse et ajouter 400 ul de tampon d'élution de gel (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM de NaOAc, EDTA 1 mM et SDS 0,25%). Éluer nuit à température ambiante sur un agitateur de tube.
- Precipitate élue l'ARN en ajoutant 1 ml d'éthanol à 100% froid et incubation soit à -80 ° C pendant 30 min ou à -20 ° C pendant une nuit.
- Centrifuger à 16 000 g pendant 30 min à 4 ° C, pour former un culot vers le bas de l'ARN.
- Laver le culot avec 1 ml d'éthanol à 75%. Centrifuger à 16 000 g pendant 20 min à 4 ° C.
- Remettre en suspension le culot d'ARN de manière appropriée dans l'eau exempte de RNase pour atteindre les concentrations désirées, comme indiqué dans le tableau 2.
5. Base de fluorescence test ARN édition
- Pour une seule réaction, combiner 1 pmol (1 pi) de preA6Rbz et 2,5 pmol (1 pi) de gA6Rbz (rapport molaire 1:2,5) dans un tube de centrifugeuse, incuber à 70 º C pendant 3 minutes et laisser reposer à température ambiante pendant au moins de 10 min.
- Pendant ce temps préparer un mélange maître en utilisant le tableau 3, sans le preA6Rbz et gA6Rbz, pour la réaction de l'édition contenant un tampon 1x HHE (25 mM HEPES pH 7,9 mM Mg 10 (OAc) 2, KCl 50 mM et 10 mM d'EDTA), 1 mMATP, 5 mM de CaCl2, 16 ng / ul d'ARN de levure Torula, 0,1% de Triton X-100, et le éditosome purifiée.
- Ajouter recuit preA6Rbz et gA6Rbz pour compléter le mélange maître.
- Distribuer 18 ul de la solution mère (Tableau 3) dans les puits contenant soit 2 ul d'eau exempte de RNase (puits sans composés) ou 2 pi de 200 composés uM chimiques et comprennent des échantillons de contrôle de la plaque selon la Figure 5.
- Sceller la plaque avec un scellant pour plaques et tourner la plaque vers le bas, pour éliminer les bulles d'air. Incuber à 28 ° C pendant 4 heures.
- Ajouter 25 pmol (2 pi) de gA6Rbz concurrent à chaque puits. Placez un nouveau scellant, tourner la plaque et placez-le sur une machine de PCR en temps réel. Programmer l'expérience suivante:
Etape 1: 85 ° C pendant 5 min; Etape 2: 24 ° C pendant 10 min; Étape 3: Arrêtez. - Ajouter 15 pmol (1 pi) de substrat FRET à chaque puits pour un volume final de 23 ul. Sceller la plaque avec un nouveau scellant.Tourner rapidement la plaque et le replacer sur la machine PCR en temps réel.
- Programmer une nouvelle expérience avec les étapes suivantes:
Etape 1: 37 ° C pendant 1 min; Étape 2: Lire; Étape 3: Passez à l'étape 1, 40 fois; Étape 4: Stop. - Configuration de la plaque en sélectionnant tous les puits qui nécessitent la lecture et de choisir le filtre de FAM. Le volume d'entrée que 23 pi et commencer la course.
- Calculer la pente des valeurs obtenues à partir de chaque / puits d'échantillon pour obtenir une mesure cinétique en traçant des pistes sur un graphique à barres pour l'analyse. REMARQUE: La lecture cinétique améliore le rapport signal-sur-bruit entre l'échantillon et l'arrière-plan; que l'échantillon de fond aurait une pente proche de zéro. Un point de lecture de fin a plus de bruit de fond.
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Representative Results
Pour démontrer les étapes nécessaires pour la mise en place d'un écran de grande envergure, les figures 2-5 sont des expériences de contrôle représentatifs liés à la qualité de l'analyse. Ce sont des expériences de contrôle essentielles pour une analyse cohérente sur plusieurs jours de dépistage ou de comparaison des différents écrans.
Évaluer le ratio fluorescence signal-bruit
Pour assurer la stabilité et la qualité du substrat oligoribonucléotide marqué à la fluorescéine dans une installation à grande échelle, Z'-facteur, définie comme la différence entre l'arrière-plan de test et le signal maximum a été calculé en utilisant la molécule de ribozyme actif (A6Rbz). . Des essais avec Z 'facteur> 0,5 sont considérées comme acceptables pour l'écran à haut débit figure 2 montre des données représentatives à l'aide du substrat FRET marqué avec 5' de fluorescéine (FAM; émetteur) et 3 'N, N'-tetramethylrhodamine (TAMRA; extincteur) (A6Rbz_F / T). Ce substrat a produit un Z'-facteur de 0,64 lorsqu'elle est calculée en utilisant 72 répétitions en présence et en absence de A6Rbz.
Dans cet essai un autre substrat en utilisant Iowa Noir extincteur sombre (A6Rbz_F/Ib) peut donner un meilleur rapport signal sur bruit par rapport à TAMRA. C'est parce que l'Iowa noir, contrairement TAMRA, émet l'énergie absorbée sous forme de chaleur et pas de lumière. Le Z 'facteur obtenu en utilisant la FAM / Iowa noir (F / Ib) marqué substrat était de 0,68. L'amélioration de la Z'-facteur pour le substrat F / Ib-étiqueté TAMRA-dessus substrat marqué est en raison de son fond relativement plus faible. Ces résultats représentatifs montrent que les deux substrats sont des options viables pour une utilisation dans un écran à haut débit.
Déterminer les activités d'édition de glycérol Gradient fractions
Pour déterminer et sélectionner les fractions de éditosome plus actifs pour des expériences, la glycérofractions l gradient ont été testés pour l'édition in vitro en utilisant le test basé sur la fluorescence (étape V). Ces données montrent (Figure 3) les fractions 7 à 12 sous forme de fractions les plus actives (≥ 50% de l'activité d'édition; avec la fraction la plus active à 100%). Ces fractions peuvent être combinés lorsque plus éditosome est nécessaire.
Calcul du facteur Z 'lorsque les fractions ont été combinées éditosome
Pour déterminer l'effet de combinig la fraction éditosome, la valeur Z 'facteur de 0,6 a été calculée lorsque les fractions les plus actives (F8 + F9 + F10) ont été utilisés comme source de éditosome. Pour calculer le facteur Z'-72 réplicats ont été testés en présence et en absence de la éditosome (Figure 4). Le substrat F / Ib a été utilisé dans cette expérience. Ces données montrent que sur la base du facteur Z ', combiner les fractions de gradient de glycerol ont un effet minimal sur la qualité du dosage.
ass = "jove_content"> Expérience de contrôle représentant pour la Assay
Comparant les données représentatives de différents échantillons de contrôle ont été utilisés pour analyser les variables du dosage. Comme le montre la Figure 5, les composants manquants réactions d'édition de l'ARN (réactions 1-4) ne clivent pas le substrat. Le clivage du substrat, telle que mesurée par l'activité d'édition de fluorescence et relative n'est observée en présence de tous les composants de la réaction de modification en l'absence d'un inhibiteur (réaction 5) ou en présence de tous les composants de montage et un composé inactif (réaction 6). En revanche, un composé inhibiteur peut bloquer l'édition de l'ARN, et est utilisé comme contrôle positif (réaction 7). Ici, le noir Mordant (MrB) et les composés C53 ont été utilisés comme contrôles positifs et négatifs, respectivement.
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Figure 1. Hammerhead test in vitro de l'édition de l'ARN sur la base ribozyme. A) Représentation schématique étape-par-étape de l'essai in vitro d'édition basée sur la fluorescence: (a) l'hybridation du ribozyme en tête de marteau pré-montage (A6Rbz avant modification) avec son ARN guide (gA6Rbz). (B) la reconnaissance et l'interaction du duplex d'ARN par le complexe éditosome purifiée. (C) Suppression édition de l'ARN catalysée par la éditosome. (D) la dissociation de la A6Rbz édité à partir de la éditosome gA6Rbz et en chauffant à 85 ° C et addition de guidage ARN concurrent (gA6Rbz_comp). (E) l'hybridation du substrat de FRET avec le ribozyme en tête de marteau A6 active (A6Rbz actif). (F) de détection de signaux de FAM suivants clivage du substrat FRET par le ribozyme actif. B) Le ribozyme en tête de marteau pré-montage (pré-montage A6Rbz) est indiqué en association avec gA6Rbz qui spécifie la suppression de trois nous (arro à deux têtesw) à partir du site d'édition (ES). À la suite de l'édition d'ARN en présence d'éditosome fonctionnelle le ribozyme est édité inactive en sa forme active (A6Rbz modifié) qui peut maintenant cliver le substrat FRET (de site de coupure indiqué par une flèche). La conservé 5'-CUGA-3 'de la A6Rbz édité dans le noyau catalytique essentiel pour l'activité de ribozyme (site édité) est en surbrillance (Ce chiffre a été modifié depuis Moshiri 19). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Signal-bruit comparaison de rapport entre FRET hébergeant extincteurs différente. Ribozyme (A6Rbz) activité en utilisant FAM / TAMRA (F / T) et FAM / Iowa Noir FQ (F / Ib) substrats. Le represe axe des ynts fluorescence unité arbitraire (FAU) par minute.
Figure 3. Activité d'édition de l'ARN de sélectionner des fractions obtenues à partir de gradient de glycerol centrifugation du lysat mitochondrial. Fraction # 9 (F9) a la plus forte activité. L'axe des ordonnées représente l'activité d'édition relative en pourcentage, étant donné que 100% F9.
Figure 4. Calcul de Z'-facteur en utilisant les fractions les plus actives (F8 + F9 + F10) en tant que source de éditosome. Variation expérimentale a été obtenu à partir de 72 répétitions de chaque type de réaction. Z 'facteur a été calculé comme 0,6. L'axe des ordonnées représente l'activité relative de l'édition.
Figure 5. D'expérience représentative pour le dosage de l'ARN en fonction de la modification de fluorescence. Réactions ont été réalisées dans un volume final de 20 ul par puits et CFX384 TouchTM en temps réel le système de détection de PCR a été utilisée pour mesurer le signal de fluorescence. Le graphique présente les différentes commandes en outre à une réaction de montage complète qui contient tous les composants pour le test (N ° 5). La fluorescence a été mesurée en présence du substrat FRET seul (n ° 1) pour évaluer l'intégrité du substrat. Echantillon n ° 2 a été réalisée en l'absence de la éditosome à surveiller toute activité du ribozyme avant la modification. Pour évaluer l'effet de éditosome dénaturé sur le substrat, la fluorescence a été mesurée en présence du substrat et éditosome FRET seul (n ° 3). Pour tester l'édition spécificité de guidage dirigée, une sample en l'absence de gA6Rbz a été utilisé (n ° 4). Un non-inhibiteur (C53, n ° 6) et un composé inhibiteur (MrB, n ° 7) ont été utilisés pour tester l'effet sur le dosage de l'édition. Lors de l'édition de l'ARN est inhibée de manière significative par MrB, C53 a un effet négligeable. Les barres d'erreur correspondent à une variation expérimentale (écart-type) de 10 répétitions. L'axe des ordonnées représente l'activité d'édition relative en pourcentage, en considérant la réaction complète (# 5) 100%.
| 10% | 30% | |
| Tampon de gradient 2x HHE | 5 ml | 5 ml |
| Glycérol | 1 ml | 3 ml |
| DEPC H 2 O | 4 ml | 2 ml |
| 1 M DTT | 10 pl | 10 pl |
Tableau 1. 10% et 30% de glycérol Solution (10ml chacun).
| Pré-édité A6 Ribozyme (preA6Rbz) | |
| preA6Rbz ADN matrice | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCA TCAAAAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTT CC CCCTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| preA6Rbz ARN | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUUUUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGA UCAAAUGU-3 ' |
| ARN actions conc. | 1 uM |
| Guide A6 Ribozyme (gA6Rbz) | |
| gA6RBz ADN matrice | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATAATTATCATATCACTGT CAAGGGAAAGTTGTGAGGGTGATGAGTCCGTGTATATCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz ARN | 5'-GGGAUAUACACGGACUCAUCACCCUCACAACUU UCCCUUGACAGUGAUAUGAUAAUUAUUUUUUUUUUUUUUUUU-3 ' |
| ARN actions conc. | 2,5 uM |
| Guide A6 Ribozyme concurrent (gA6RBz_comp) | |
| gA6Rbz_comp ADN matrice | 5'-GGATATACACGGACTCATCACCCTCACAACTTTC CCTTGACAGTGATATGATAATTATTTTTTTTTTTTTTTTT CCCTAT AGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz_comp ARN | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAUAAUUAUCAUAUCACUG UCAAGGGAAGUUGUGAGGGUGAUGAGUCCGUGUAUAUCC-3 ' |
| ARN actions conc. | 12,5 uM |
| Actif A6 Ribozyme (A6RBz) | |
| A6Rbz matrice d'ADN | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCAT CAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTTCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| A6Rbz ARN | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGAUCA AAUGU-3 ' |
| ARN actions conc. | 1 uM |
| FRET substrat | |
| TAMRA extincteur | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-TAMRA-3 '(Eurogentec) |
| Extincteur Iowa Noir | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-Iowa Black-3 '(IDT) |
| ARN actions conc. | 15 pm (pour les deux) |
Tableau 2. Modèles ADN et de l'ARN substrats.
| Composition | réaction de montage (pl) |
| 10x HHE | 1.5 |
| 0,1 M CaCl 2 | 1 |
| 100 mM d'ATP | 0,2 |
| 10% de Triton X-100 | 0,2 |
| 500 ng / ul ARN de levure Torula | 1 |
| Éditosome | 5 |
| RNase H 2 O | 7.1 |
| 1 uM preA6Rbz | 1 |
| 2,5 uM gA6Rbz | 1 |
| Total | 18 |
Tableau 3. Réaction Composition et Master Mix.
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Discussion
Une méthode de criblage à haut débit roman pour identifier des inhibiteurs contre le complexe d'édition de l'ARN de trypanosomes a été présenté, en fournissant un nouvel outil pour la découverte de médicaments pour lutter contre les maladies causées par trypanosomatidés. Dosage de ribozyme à base de FRET a été largement utilisé à des fins différentes de 20 à 22; Cependant, nous avons utilisé le test de capacité de ribozyme à base de FRET pour la surveillance in vitro de l'activité d'édition de l'ARN 19. Ce test pourrait être adaptée à d'autres types d'édition de l'ARN chez les eucaryotes, telles que l'édition de substitution nucléotidique d'ARN codée par noyau de 23 mammifères.
La nouveauté de ce test n'est pas mise en place des essais de ribozyme à base de FRET en soi, mais, dans l'élaboration d'un procédé qui incorpore cette technique dans un dosage d'édition de l'ARN qui se prête à la sélection à haut débit de substances chimiques contre éditosome. La méthode de dosage fondée-ribozyme a plusieurs avantages sur d'autres écrans et assays actuellement utilisés à cette fin. Plus précisément, la technique offre un essai sensible et reproductible "mix-and-mesure" en s'appuyant sur un substrat fluorescent par opposition à une une radiomarquée, ce qui rend impropre à criblage à haut débit 19. Surveillance en temps réel d'un signal de fluorescence après l'addition du substrat à la place d'un signal de point final simple permet de déterminer avec plus de précision les valeurs de CI50 des composés testés 19. En outre, il permet de vérifier les effets inhibiteurs des composés sur le complexe entier éditosome par opposition à des protéines recombinantes individuelles. Compte tenu de la nature dynamique des interactions au sein de complexes protéiques, on peut supposer que cette méthode permet l'identification d'inhibiteurs contre éditosome protéines dans une représentant plus biologiquement réglage 24. En outre, en ciblant le complexe entier éditosome fournit une occasion d'arrêter éventuellement la progression de l'édition de l'ARNà diverses étapes transitoires qui n'ont pas été préalablement identifiés. Ainsi, la technique permettra acquérir une meilleure perspective que les interactions et les activités qui sont cruciales pour le processus d'édition de l'ARN. Cette approche a été jugée réussie dans le passé comme en témoigne l'élucidation des procaryotes assemblage et la fonction en utilisant des antibiotiques, comme l'érythromycine et viomycine complexe ribosome, agissant comme inhibiteurs du complexe 24,25.
Pour assurer le succès de la méthode, certains ajustements dans les protocoles peuvent être nécessaires. Tout d'abord, la sélection de la fraction appropriée d'extrait mitochondrial en gradient de glycérol est cruciale. Ici, les fractions 7 à 11, correspondant à la région ~ 20S de la pente, a montré l'activité la plus élevée de montage, avec 9 fraction présentant une activité maximale. Bien que cette fraction a été choisie pour tous les essais présentés, il est essentiel de tester toutes les fractions à l'avance afin de déterminer dans laquelle fraction des pics d'activité d'édition. Deuxièmement, pour valider la sélection de la fraction, il est essentiel d'effectuer des essais préliminaires pour évaluer le rapport signal sur bruit en calculant la valeur Z'-facteur. Si approprié mitochondrial gradient fractionnement d'extrait de glycerol a été achevée, un Z'-valeur de 0,6 peut être atteint. Ensuite, il est recommandé de réévaluer le volume de réaction de l'extrait mitochondrial nécessaire pour obtenir une activité maximale de montage 19 par l'intermédiaire d'un titrage.
Une limitation importante de la technique présentée dans cet article porte sur le processus laborieux et fastidieux de fractionnement mitochondriale de gradient extrait de glycérol par lequel le complexe de éditosome est purifié 19. Malgré ces inconvénients, cette technique est préférentiellement suggéré pour obtenir des fractions de éditosome brut compte tenu de son faible coût par rapport à un potentiel de rendement, ce qui remplira les conditions d'application criblage à haut débit. En revanche, d'autres méthodes telles que TAP-tag purification, qui sont capables de donner des fractions de éditosome plus purifiées, sont recommandées pour de faibles dosages à débit moyen par exemple dans le cas des dosages secondaires. En outre, afin de garantir un effet inhibiteur spécifique de composés, il est nécessaire d'inclure des contrôles pour les tester contre l'activité de ribozyme (A6Rbz) en l'absence de la éditosome. Il convient de noter que les études antérieures ont mis en évidence que cette méthode peut être inefficace à calculer les valeurs IC50 pour les composés de colorants comme raison de l'interférence possible à des concentrations élevées de composés 19.
Pour augmenter encore la sensibilité de la technique HTS présenté, le développement d'un dosage basé sur la fluorescence similaire impliquant pré-clivé ribozyme pré-montage est bénéfique. Cela permettrait de contourner l'étape de clivage endonucléolytique limitant la vitesse catalysée par les endonucléases dans le complexe de éditosome. Un autre avantage de ce test modifié serait l'application comme un outil de dépistage secondairepour contrôler l'effet des inhibiteurs identifiés à travers l'écran principal sur ExoUase, TUTase et ligature des activités catalytiques. Le test proposé est actuellement limitée à la détection d'inhibiteurs contre le type d'édition de l'ARN de suppression. Par conséquent, une autre piste à explorer serait la modification de l'essai présenté pour permettre le suivi des effets de composés sur le type d'insertion de l'édition de l'ARN.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDM-79 Medium | Gibco by Life Technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 | heat inactivation at 55 °C for 1 hr |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2 ml | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1 kg | Life Technologies | AM9902 |
References
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