Abstract
Betydelige framskritt er gjort i å bestemme mekanismen av mitokondrie RNA redigering i trypanosomer. På samme måte har betydelige fremskritt blitt gjort for å identifisere komponentene i editosome kompleks som katalyserer RNA-redigering. Men det er fortsatt ikke klart hvordan disse proteinene fungerer sammen. Kjemiske forbindelser oppnådd fra en high-throughput-skjermen mot editosome kan blokkere eller påvirke en eller flere av trinnene i redigerings syklus. Derfor vil identifisering av nye kjemiske forbindelser generere verdifulle molekylære prober for dissekere editosome funksjon og montering. I tidligere studier, ble in vitro-redigering assays utføres ved hjelp av radiomerket RNA. Disse analysene er tidkrevende, ineffektiv og uegnet for høy gjennomstrømming formål. Her, en homogen fluorescens-basert "mikse og måle" hammer Ribozyme in vitro reporter analysen for å overvåke RNA redigering, blir presentert. Bare som en konsekvens av RNA-redigering avhammer Ribozyme en fluorescens resonans energioverføring (FRET) oligoribonucleotide underlaget gjennomgår cleavage. Dette i sin tur resulterer i separasjon av fluoroforen fra slukkeren derved å gi et signal. I kontrast, når editosome funksjon inhiberes, fluorescens-signalet vil bli slukket. Dette er en meget følsom og enkel metode som bør være generelt anvendbar for å overvåke in vitro RNA-redigering eller high throughput screening av kjemikalier som kan hemme editosome funksjon.
Introduction
Prosessen med RNA redigering, en post-transcriptional mRNA modifikasjon, ble først oppdaget i trypanosomatids en. Siden da har betydelig arbeid utført i å studere mekanismen bak RNA redigering i Trypanosoma brucei 2,3. I en serie av enzymatiske reaksjoner, den editosome, en kjerne kompleks på omtrent 20 proteiner, skaper modne mitokondrielle mRNA for flere komponenter av energigenerer oksidativ fosforylering system. Rekkefølgen av katalytiske hendelser er endonucleolytic cleavage, uridylate (U) tillegg eller sletting, og ligering, som diktert av guide RNA (gRNAs) 4.
I tillegg til kjerne editosome komplekse proteiner, har en rekke tilbehørs faktorer også blitt identifisert 5-7. Disse proteinene er mest sett gruppert i uavhengige komplekser. Imidlertid er rekkefølgen av protein sammenstillingen i kjernen editosome kompleks og interaksjons mønstre av kjernen kompleks med tilbehøretkomplekser er ennå ikke bestemt. Targeting RNA redigeringsprosessen i trypanosomatids kan gi kjemiske dissectors som hjelpemiddel i å studere montering og funksjon av editosome kompleks. Videre har funksjonelle studier på flere editosome proteiner vist essentiality tvers av ulike livsstadier, indikerer deres potensial som stoffet mål 8-12. Derfor kan de funnet hemmere av editosome også fungere som blyforbindelser mot trypanosomatids. Dette er riktig, da legemidler for tiden tilgjengelig mot sykdommer forårsaket av trypanosomatid er giftige, ineffektiv og kostbar 13,14.
En effektiv og praktisk in vitro-analysen er nødvendig å undersøke den kjemiske universet for spesifikke hemmere som blokkerer RNA redigering. Tre analyser har blitt utviklet og brukt til å overvåke editosome aktiviteter: (a) hel runde in vitro RNA-redigering assay 15, (b) pre-spaltet in vitro RNA-redigering assay 16,17, etnd (c) hammer Ribozyme (HHR)-baserte analysen 18. De første to tester er avhengige direkte visualisering av de redigerte produkt (ATPase 6 mRNA) ved hjelp av radioaktivitet. Den HHR-baserte analysen benytter en modifisert versjon av ATPase 6 mRNA som er modellert til å oppføre seg som et ribozym ved redigering. Den funksjonelle ribozym deretter spesifikt spalter en radiomerket RNA-substrat, som fungerer som en reporter. Nylig Moshiri et al. Utviklet en 'blande og måle' HHR basert in vitro reporter assay for å overvåke RNA-redigering, hvor den radioaktivt merkede RNA-substratet er blitt erstattet med et fluorescens-resonans energioverføring (FRET) substrat 19.. De viktigste fordelene med denne analysen er: (a) det er en hurtig og enkel blanding og måle type assay, som produksjon av aktivt ribozym og substrat spaltning inntreffer samtidig i det samme rør i lavt volum (dvs. 20 ul), (b ) den unngår anvendelse av radioaktivt merket materiale, (c) sensitivitet som er enfforded av fluorescens instrumentering i et mikro-titer plateformat, og (d) et høyt signal-til-støy-forhold. Ved hjelp av denne analysen, ble effekten av kjente RNA redigering ligase hemmere mot renset editosome bekreftet 19. Dette forsøk bekreftet at analysen for rask identifisering av RNA-redigering inhibitorer, først og fremst mot hele editosomes fra T. brucei.
Figur 1 viser et detaljert trinn-for-trinn skjematisk av fluorescens-basert in vitro RNA-redigering assay. Denne protokollen kan brukes enten til å overvåke RNA redigering in vitro eller lett tilpasses for screening sammensatte biblioteker av ulike skalaer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen nedenfor beskriver fremgangsmåten for å utføre fluorescens-baserte RNA-redigering assay. Analysen kan utføres i en enkelt PCR-rør, 96-brønn, eller 384-brønners plater, avhengig av omfanget av forsøket. Deretter fluorescens-signal kan avleses på et egnet sanntid PCR-deteksjonssystem. Analysen her er beskrevet i sammenheng med 384-brønns plater.
En. Culturing T. brucei Cells
- Forbered et vekstmedium for T. brucei procyclic skjema celler. For 1 L av medium:
- Løs opp 25,4 g SDM-79 pulver i 800 ml miliQ vann.
- Tilsett 2 g NaHCO3, og pH-verdien til 7,3 med 10 M NaOH.
- Legg nanopure vann til et sluttvolum på 900 ml, filtersteriliser.
- Legg Fetal Bovine Serum (FBS), penicillin-streptomycin-løsning og hemin (2,5 mg / ml) til sluttkonsentrasjoner på 10% (v / v), 100 U / ml og 7,5 mg / L hhv.
- Grow 300 ml T. <em> brucei 1.7A villtype (procyclic form) celler ved 28 ° C, risting ved 70 rpm i en tetthet på 1,5 x 10 7 celler / ml. MERK: Dette skal produsere 3 ml aktiv editosome med ~ 0,5 mg av total protein, tilstrekkelig for 600 redigerings reaksjoner.
- Høst celler ved sentrifugering ved 6000 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Vask pelleten med 50 ml kjølt PBSG buffer (10 mM Na HPO 2 4, 10 mM NaH 2 PO 4, 145 mM NaCl og 6 mM glukose), og spinne ned cellene på nytt ved sentrifugering ved 10,000 xg i 10 min ved 4 ° C.
2. Isolering av Crude Mitokondrier
MERK: Alle trinn skal utføres på is eller ved 4 ° C for å bevare editosome aktivitet.
- Resuspender cellene høstet i 30 ml DTE buffer (1 mM Tris-HCl pH 8,0 og 1 mM EDTA). Bruk en 40 ml steril Douce-homogenisator (pre-kjølt) til cellemembranen ved å stryke opp og ned minst 10 ganger på is. Tilsett umiddelbart 4.3 ml av 60% sukrose (vekt / volum, dvs. 1,75 M) til homogenatet til en sluttkonsentrasjon på 0,25 M. Sentrifuger ved 15800 x g i 10 min ved 4 ° C, til fortrinnsvis å få ned mitokondrier.
- Resuspender pellet i 4,6 mitokondrie ml av STM-buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM sukrose og 2 mM MgCl2). Til 13,8 mL av 0,1 M CaCl 2 og 4 pl RNase-fri DNase I til endelige konsentrasjoner på 0,3 mM, og 9 U / ml, respektivt. Inkuber blandingen i 1 time på is.
- Til 4,6 ml STE-buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM sukrose og 2 mM EDTA) for å inaktivere DNase I. Sentrifuger ved 15800 x g i 10 min ved 4 ° C.
- Resuspender pelleten i 400 pl av lyseringsbuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 10 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1 ug / ml pepstatin, 1 mM DTT, og 1x komplett EDTA-fri protease inhibitor) og overføring til en mikro-sentrifugerør.
- Tilsett 10% Triton X-100 til en sluttkonsentrasjon på 1% and inkuber lysatet i 15 min ved 4 ° C på et rør rotator.
- Fjern det mitokondrielle lysat ved sentrifugering to ganger ved 17 000 xg i 15 min ved 4 ° C; beholde ryddet supernatanten hver gang.
Tre. Editosome Rensing
- Hell 10 ml 10% -30% (v / v) glycerol lineær gradient (tabell 1) i et ultrasentrifugerør hjelp 2x HHE gradient-buffer (40 mM HEPES pH 7,9, 20 mM Mg (OAc) 2, 100 mM KCl, og 2 mM EDTA) og en gradient maker ved å følge bruksanvisningen.
- Fjern forsiktig 500 ul oppløsning fra toppen av den glycerol-gradient og forsiktig laste 500 pl av den klart mitochondrial lysat. Sentrifugering ved 178.000 xg i 6 timer ved 4 ° C ved bruk av en ultrasentrifuge.
- Samle 500 ul fraksjoner i rekkefølge fra toppen til bunnen av gradienten ved 4 ° C. Deretter knipse fryse fraksjonene med flytende nitrogen og oppbevar ved -80 ° C før bruk.
- Anneal de respektive DNA-templat inneholdende sekvensen komplementær til T7 promoter-sekvens (tabell 2) med en T7-promoter-oligonukleotid (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') i en 1:1 molart forhold ved oppvarming ved 90 ° C i 3 min og avkjøling ved romtemperatur i minst 10 min.
- Transkribere RNA ved hjelp av en in vitro transkripsjon kit ved å følge bruksanvisningen.
- Stopp transkripsjonsreaksjon ved å tilsette like stort volum av 7 M urea fargestoff (7 M urinstoff, 0,05% xylen Cynol, og 0,05% bromfenol blå). Løpe på et filter sterilisert 9% denaturerende polyakrylamid gel (9% akrylamid, 7 M urea, 1 x TBE).
- Bruk ultrafiolett (UV) skygging med en kortbølget UV-lampe for å finne og avgiftsdirektoratet respektive RNA. Plasser excised gel stykket i et mikro-sentrifugerør og tilsett 400 ul av gel elueringsbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 mM NaOAc, 1 mM EDTA og 0,25% SDS). Eluer over natten ved RT på en tube rotator.
- Precipitate den eluerte RNA ved å tilsette 1 ml av kald 100% etanol og inkubering av begge ved -80 ° C i 30 min og -20 ° C over natten.
- Sentrifuger ved 16000 x g i 30 min ved 4 ° C for å pelletere ned RNA.
- Vask pelleten med 1 ml 75% etanol. Sentrifuger ved 16.000 xg i 20 min ved 4 ° C.
- Resuspender RNA pelleten hensiktsmessig i RNase fritt vann for å oppnå de ønskede konsentrasjoner, som vist i tabell 2.
5. Fluoresens-RNA Redigerer analysen
- For en enkelt reaksjon, sammen 1 pmol (1 mL) av preA6Rbz og 2,5 pmol (1 mL) av gA6Rbz (1:2.5 molart forhold) i et mikro-sentrifugerør, inkuberes ved 70 ° C i 3 minutter, og la det stå ved RT i i minst 10 min.
- I mellomtiden tilberede et konsentrat-blanding ved hjelp av Tabell 3, uten at preA6Rbz og gA6Rbz, for redigering av reaksjonen inneholdende 1 x HHE buffer (25 mM HEPES pH 7,9, 10 mM Mg (OAc) 2, 50 mM KCl og 10 mM EDTA), 1 mMATP, 5 mM CaCl 2, 16 ng / mL av Torula gjær-RNA, 0,1% Triton X-100, og det rensede editosome.
- Legg glødet preA6Rbz og gA6Rbz å fullføre master mix.
- Tilsett 18 pl av en konsentrat-blanding (tabell 3) i brønner inneholdende enten 2 pl av RNase-fritt vann (brønner med ingen forbindelser) eller 2 ul av 200 uM kjemiske forbindelser og omfatter kontrollprøver i platen i henhold til figur 5.
- Tett plate med en plate forsegler og spinne platen ned, for å fjerne eventuelle luftbobler. Inkuber ved 28 ° C i 4 timer.
- Legg 25 pmol (2 mL) av gA6Rbz konkurrent til hver brønn. Plasser en frisk sealer, spinne platen ned og plassere den på en real-time PCR maskin. Programmere følgende eksperiment:
Trinn 1: 85 ° C i 5 min; Trinn 2: 24 ° C i 10 min; Trinn 3: Stopp. - Tilsett 15 pmol (1 mL) av FRET substrat til hver brønn i et sluttvolum på 23 pl. Tett plate med en frisk sealer.Raskt spinne platen og legg den tilbake på real-time PCR maskin.
- Programmere et nytt eksperiment med følgende trinn:
Trinn 1: 37 ° C i 1 min; Trinn 2: Les; Trinn 3: Gå til trinn 1, 40 ganger; Trinn 4: Stopp. - Oppsett platen ved å velge alle de brønner som krever lesing og velge FAM filter. Input volum som 23 mL og starte kjøringen.
- Beregn skråningen av verdiene oppnådd fra hver brønn / prøve for å oppnå et kinetisk måling ved å plotte bakkene på et søylediagram for analyse. MERK: En kinetisk lese forbedrer signal-til-støy-forholdet mellom prøve og bakgrunn; som bakgrunn prøven ville ha en skråning nær null. Et sluttpunkt lesing har høyere bakgrunnsstøy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere de nødvendige trinn som kreves for å sette opp en større skjerm, Figurene 2-5 er representative kontroll-forsøk i forbindelse med kvaliteten av analysen. Dette er helt nødvendige kontrolleksperimenter for en konsistent analyse over flere dager med screening eller for sammenligning av forskjellige skjermer.
Vurdere fluorescens Signal-til-støy-forhold
For å sikre stabilitet og kvalitet av fluorescein-merkede oligoribonucleotide substrat i en storskala-oppsett, ble Z'-faktor, definert som forskjellen mellom det assay bakgrunnen og den maksimale signal beregnes ved hjelp av den aktive ribozym molekyl (A6Rbz). . Assays med Z'-faktor> 0,5 betraktes som akseptabel for high-throughput-skjermen Figur 2 viser representative data ved hjelp av FRET substrat som er merket med 5 'fluorescein (FAM; emitter) og 3' N, N '-tetramethylrhodamine (TAMRA; drikk) (A6Rbz_F / T). Dette substrat ga en Z'-faktor på 0,64 når det beregnes ved hjelp av 72 replikater i nærvær og fravær av A6Rbz.
I dette assay ved å bruke et alternativt substrat Iowa sort mørk quencher (A6Rbz_F/Ib) kan gi et bedre signal-til-støy-forhold i forhold til TAMRA. Dette er fordi Iowa svart, i motsetning TAMRA, avgir absorbert energi som varme og ikke lys. Den Z'-faktor erholdt ved hjelp av FAM / Iowa Sort (F / Ib)-merket substrat var 0,68. Forbedringen i Z'-faktor for F / Ib-merket substrat løpet TAMRA-merket substrat er på grunn av sin relativt lavere bakgrunn. Disse representative resultater viser at begge substrater er levedyktige alternativer til bruk i en high-throughput-skjermen.
Bestemme redigerings Aktiviteter glyserol Gradient Brøker
Å bestemme og velge de mest aktive editosome fraksjoner for eksperimenter, glyserol gradient-fraksjonene ble testet for in vitro redigering ved hjelp av fluorescens-basert assay (trinn V). Disse dataene viser (figur 3) Fraksjonene 7-12 som de mest aktive fraksjoner (≥ 50% redigering aktivitet, med den mest aktive fraksjonen som 100%). Disse fraksjonene kan kombineres når mer editosome er nødvendig.
Beregning av Z'-faktor når de Editosome Fraksjoner ble Kombinert
For å bestemme effekten av combinig den editosome fraksjon ble Z'-faktorverdi på 0,6 beregnet når de mest aktive fraksjoner (F8 F9 + + F10) ble anvendt som kilde for editosome. For å beregne Z'-faktor 72 replikater ble undersøkt i nærvær og fravær av editosome (figur 4). F / Ib substrat ble anvendt i dette eksperimentet. Disse dataene viser at basert på Z'-faktoren, ved å kombinere de glyserol gradient fraksjoner har minimal effekt på kvaliteten av analysen.
ass = "jove_content"> Representant Kontroll Eksperimenter for analysen
Representative data som sammenligner forskjellige kontrollprøver ble anvendt for å analysere variablene i analysen. Som vist i figur 5, må reaksjonene som mangler eventuelle RNA-redigering av komponentene (reaksjoner 1-4) ikke spalter substratet. Spalting av substratet målt ved fluorescens og relative redigering aktivitet er kun observert i nærvær av alle komponenter av redigerings reaksjoner i fravær av en inhibitor (reaksjon 5) eller i nærvær av alle redigerings komponenter og en inaktiv forbindelse (Reaksjons 6). I motsetning til dette kan en hemmende forbindelse blokkere RNA-redigering og blir brukt som en positiv kontroll (reaksjon 7). Her ble Mordant svart (MrB), og C53-forbindelser som brukes som positive og negative kontroller, respektivt.
ghres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Hammer Ribozyme-basert in vitro RNA redigering analysen. A) Step-by-step skjematisk fremstilling av fluorescens-basert in vitro redigering analysen: (a) Hybridisering av den pre-redigert hammer Ribozyme (pre-redigert A6Rbz) med sin guide RNA (gA6Rbz). (B) Anerkjennelse og samhandling av RNA duplex av renset editosome kompleks. (C) sletting RNA redigering katalysert av editosome. (D) dissosiasjon av det redigerte A6Rbz fra editosome og gA6Rbz ved oppvarming ved 85 ° C og tilsetning av førings RNA konkurrent (gA6Rbz_comp). (E) Hybridisering av FRET substrat med den aktive A6 hammer ribozym (aktiv A6Rbz). (F) Påvisning av FAM signaler følgende spalting av FRET underlaget ved den aktive Ribozyme. B) Den pre-redigert hammer Ribozyme (pre-redigert A6Rbz) er vist i forbindelse med gA6Rbz som angir sletting av tre Oss (tohodet Arrow) fra redigeringsside (ES). Som et resultat av RNA-redigering i nærvær av funksjonelle editosome den inaktive ribozym er redigert til den aktive formen (redigert A6Rbz) som nå kan spalte FRET substrat (spaltningssete indikert med en pil). Den konservert 5'-Cuga-3 'av det redigerte A6Rbz i den katalytiske kjerne avgjørende for Ribozyme aktivitet (redigert stedet) er uthevet (Dette tallet har blitt forandret fra Moshiri 19). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Signal-til-støy-forhold sammenligning mellom FRET underlag skjuler annerledes quenchers. Ribozyme (A6Rbz) aktivitet ved hjelp av FAM / TAMRA (F / T) og FAM / Iowa Svart FQ (F / Ib) underlag. Y-aksen represents fluorescens vilkårlig enhet (FAU) per minutt.
Fig. 3. RNA-redigering aktiviteten av utvalgte fraksjoner oppnådd fra glycerol-gradient sentrifugering av mitokondriell lysat. Fraksjon nr. 9 (F9) har den høyeste aktivitet. Y-aksen representerer relativ redigering aktivitet i prosent, vurderer F9 som 100%.
Figur 4 Z'-faktor beregning ved hjelp av de mest aktive fraksjoner (F8 + F9 + F10) som editosome kilde.. Experimental variasjon ble innhentet fra 72 replikater av hver type reaksjon. Z'-faktoren ble beregnet til 0,6. Y-aksen representerer relative redigering aktivitet.
Figur 5. Representative eksperimenter for fluorescens-baserte RNA-redigering assay. Reaksjonene ble utført i et sluttvolum på 20 ul per brønn, og CFX384 TouchTM real-time PCR deteksjonssystem ble brukt for måling av fluorescens-signalet. Grafen viser forskjellige kontroller i tillegg til en fullstendig redigering reaksjon som inneholder alle komponentene for analysen (nr. 5). Fluorescens ble målt i nærvær av FRET substrat alene (nr. 1) for å vurdere integriteten av substratet. Prøve nr. 2 ble utført i fravær av den editosome å overvåke enhver ribozym-aktivitet forut for redigering. For å vurdere virkningen av denaturert editosome på substratet, ble fluorescensen målt i nærvær av editosome og FRET substrat bare (nr. 3). For å teste guiden styrt redigering spesifisitet, en sample i fravær av gA6Rbz ble anvendt (nr. 4). En ikke-inhibitorisk (C53, 6), og en inhibitorisk forbindelse (MrB, nr. 7) ble anvendt for å teste effekten på redigerings assay. Mens RNA redigering hemmes betydelig av MrB, har C53 ubetydelig effekt. De feilfelt tilsvarer en eksperimentell variasjon (standardavvik) mellom 10 replikater. Y-aksen representerer relativ redigering aktivitet i prosent, vurderer fullstendig reaksjon (# 5) som 100%.
| 10% | 30% | |
| 2x HHE gradient buffer | 5 ml | 5 ml |
| Glyserol | 1 ml | 3 ml |
| DEPC H 2 O | 4 ml | 2 ml |
| 1 M DTT | 10 ul | 10 ul |
Tabell 1. 10% og 30% Glyserol Solution (10ml hver).
| Pre-redigert A6 Ribozyme (preA6Rbz) | |
| preA6Rbz DNA mal | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCA TCAAAAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTT CC CCCTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| preA6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUUUUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGA UCAAAUGU-3 ' |
| RNA lager kons. | 1 mikrometer |
| Guide A6 Ribozyme (gA6Rbz) | |
| gA6RBz DNA mal | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATAATTATCATATCACTGT CAAGGGAAAGTTGTGAGGGTGATGAGTCCGTGTATATCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz RNA | 5'-GGGAUAUACACGGACUCAUCACCCUCACAACUU UCCCUUGACAGUGAUAUGAUAAUUAUUUUUUUUUUUUUUUUU-3 ' |
| RNA lager kons. | 2,5 mikrometer |
| Guide A6 Ribozyme Konkurrent (gA6RBz_comp) | |
| gA6Rbz_comp DNA mal | 5'-GGATATACACGGACTCATCACCCTCACAACTTTC CCTTGACAGTGATATGATAATTATTTTTTTTTTTTTTTTT CCCTAT AGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz_comp RNA | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAUAAUUAUCAUAUCACUG UCAAGGGAAGUUGUGAGGGUGAUGAGUCCGUGUAUAUCC-3 ' |
| RNA lager kons. | 12,5 mikrometer |
| Aktiv A6 Ribozyme (A6RBz) | |
| A6Rbz DNA mal | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCAT CAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTTCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| A6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGAUCA AAUGU-3 ' |
| RNA lager kons. | 1 mikrometer |
| FRET substrat | |
| TAMRA drikk | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-TAMRA-3 '(Eurogentec) |
| Iowa Svart drikk | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-Iowa Black-3 '(IDT) |
| RNA lager kons. | 15 mikrometer (for begge) |
Tabell 2. DNA Maler og RNA underlag.
| Sammensetning | Redigerer reaksjon (mL) |
| 10x HHE | 1,5 |
| 0,1 M CaCl 2 | 1 |
| 100 mM ATP | 0,2 |
| 10% Tritonx-100 | 0,2 |
| 500 ng / mL Torula Gjær RNA | 1 |
| Editosome | 5 |
| RNase fri H 2 O | 7.1 |
| 1 mikrometer preA6Rbz | 1 |
| 2,5 mikrometer gA6Rbz | 1 |
| Total | 18 |
Tabell 3. Reaction Sammensetning og Master Mix.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En roman high-throughput screening metode for å identifisere hemmere mot RNA redigering kompleks av trypanosomer ble presentert, og gir et nytt verktøy for medisiner for å motvirke sykdommer forårsaket av trypanosomatids. FRET-baserte Ribozyme analysen har vært mye brukt til ulike formål 20-22; Imidlertid, har vi benyttet kapasiteten FRET-assay basert ribozym for in vitro-overvåkning av RNA-redigering aktivitet 19. Denne assay kan potensielt være tilpasset andre typer RNA-redigering i eukaryoter, for eksempel nukleotid-substitusjon redigering av nucleus-kodede RNA fra pattedyr 23.
Det nye ved denne analysen er ikke i å etablere FRET-baserte assays ribozym per se, men i å utvikle en fremgangsmåte som inkorporerer denne teknikken i et RNA-redigering assay som er mottagelig for high-throughput screening av kjemikaliene mot editosome. Den Ribozyme analysen baserte metoden har flere fordeler i forhold til andre skjermer og assays for tiden anvendes for dette formål. Nærmere bestemt, har teknikken en følsom og reproduserbar "mix-og-måle" assay avhengig av et fluorescerende substrat i motsetning til en radiomerket en, for derved å gjøre det skikket for high-throughput screening 19.. Sanntidsovervåkning av et fluorescens-signal etter tilsetning av substrat i stedet for et enkelt ende-punkt-signal gjør det mulig å mer nøyaktig bestemme IC 50 verdier av prøvede forbindelser 19. Videre tillater det testing av de hemmende effekter av forbindelser på hel-editosome kompleks i motsetning til individuelle rekombinante proteiner. Gitt den dynamiske natur interaksjoner innen proteinkomplekser, kan det bli foreslått at denne metoden tillater identifisering av inhibitorer mot editosome proteiner i en mer biologisk representativt stilling 24. I tillegg, rettet mot hele editosome komplekset gir en mulighet til å potensielt arrestere utviklingen av RNA redigeringved forskjellige transiente trinn som ikke tidligere har blitt identifisert. Dermed vil teknikken tillater få et bedre perspektiv om interaksjoner og aktiviteter som er avgjørende for prosessen med RNA redigering. Denne tilnærmingen har vist seg å være vellykket i det siste eksemplifisert ved belysning av prokaryote ribosom kompleks montering og funksjon utnytte antibiotika, for eksempel viomycin og erytromycin, fungerer som hemmere av komplekset 24,25.
For å sikre en vellykket gjennomføring av fremgangsmåten, kan visse justeringer i protokoller være nødvendig. Først, er valget av den riktige glycerol gradient mitochondrial fraksjon ekstrakt avgjørende. Her fraksjonene 7 til 11, svarende til ~ 20S-regionen av gradienten, viste den høyeste redigering aktivitet, med fraksjon 9 oppviser maksimal aktivitet. Selv om denne fraksjon ble valgt for alle testene er presentert, er det viktig å teste alle fraksjoner på forhånd for å vurdere i hvilken FRADette skjer de redigering aktivitetstoppene. For det andre, for å validere valget fraksjon, er det avgjørende å utføre innledende tester for å evaluere signal-til-støy-forholdet ved å beregne Z'-faktorverdi. Ved riktig mitokondrie ekstrakt glycerol-gradient fraksjonering er fullført, kan en Z'-verdi på 0,6 oppnås. Deretter er det anbefalt å re-evaluere reaksjonsvolum av mitokondriell ekstrakt nødvendig for å oppnå maksimal redigering aktivitet via titrering 19..
En viktig begrensning av teknikken presentert i denne artikkelen omhandler møysommelig og tidkrevende prosess av mitokondriell ekstrakt glycerol-gradient fraksjonering ved hvilken editosome komplekset renses 19.. Til tross for disse ulempene, er denne teknikken fortrinnsvis foreslått å skaffe råolje editosome fraksjoner gitt sin lave kostnader versus avkastning potensial, og dermed kvalifiserer det for søknad til high-throughput screening. I motsetning til andre metoder som for eksempel TAP-tag purification, som er i stand til å gi mer rensede editosome fraksjoner, er tilrådelig for lav til middels gjennomløps assays slik som i tilfellet av sekundære assays. Dessuten, for å sikre en spesifikk hemmende virkning av forbindelser, er det nødvendig å inkludere kontroller for å teste dem mot aktiviteten av ribozym (A6Rbz) i fravær av den editosome. Det bør bemerkes at tidligere studier har fremhevet at denne metoden kan være ineffektiv ved beregning IC50 verdier for dye-lignende forbindelser på grunn av faren for interferens ved høye sammensatte konsentrasjoner 19.
For ytterligere å øke følsomheten av HTS teknikken presentert, å utvikle en tilsvarende fluorescens-basert assay som omfatter pre-spaltet forhånds redigert ribozym er fordelaktig. Dette ville tillate å omgå det hastighetsbegrensende endonucleolytic spalting trinn katalyseres av endonukleaser i editosome kompleks. En annen fordel med denne modifiserte analysen ville være anvendelse som en sekundær screeningfor å overvåke effekten av inhibitorer som er identifisert gjennom det primære skjermen på ExoUase, TUTase og ligation katalytiske aktiviteter. Den for tiden foreslåtte metoden er begrenset til påvisning av inhibitorer mot sletting type RNA-redigering. Derfor ville en annen vei til å utforske det bli modifikasjon av frem assay for å muliggjøre overvåkning av sammensatte virkninger på innsettings type RNA-redigering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDM-79 Medium | Gibco by Life Technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 | heat inactivation at 55 °C for 1 hr |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2 ml | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1 kg | Life Technologies | AM9902 |
References
- Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
- Hajduk, S., Ochsenreiter, T.
- Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).
- Seiwert, S. D., Stuart, K. RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro. Science. 266, 114-117 (1994).
- Weng, J., et al. Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids. Molecular. 32, 198-209 (2008).
- Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex. RNA. 14, 970-980 (2008).
- Ammerman, M. L., et al. Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1. Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).
- Huang, C. E., O'Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein. Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).
- Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes. Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).
- Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).
- Schnaufer, A., et al. An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Science. 291, 2159-2162 (2001).
- Tarun, S. Z., et al. KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei. RNA. 14, 347-358 (2008).
- Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A.
- Denise, H., Barrett, M. P. Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness. Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).
- Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84, 831-841 (1996).
- Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing. Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).
- Igo, R. P. Jr, et al. Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing. Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).
- Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing. RNA. 8, 548-554 (2002).
- Moshiri, H., Salavati, R. A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens. Nucleic Acids Res. 38, e138 (2010).
- Jenne, A., et al. Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology. Nature. 19, 56-61 (2001).
- Hartig, J. S., et al. Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time. Nature. 20, 717-722 (2002).
- Famulok, M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).
- Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein. Science. 260, 1816-1819 (1993).
- Jurica, M. S. Searching for a wrench to throw into the splicing machine. Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).
- Spahn, C., Prescott, C. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus. Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).
