Abstract
Les cellules de Müller sont les principales cellules gliales de la rétine. Leurs pieds d'extrémité forment les limites de la rétine au niveau des membranes externe et interne (ILM) de limitation, et en liaison avec les astrocytes, des pericytes et des cellules endothéliales qu'ils établissent la barrière hémato-rétinienne (BRB). BRB limite transport de matière entre dans la circulation sanguine et la rétine tandis que le MFI agit comme une membrane de sous-sol qui définit histologiquement la frontière entre la rétine et la cavité vitréenne. Étiquetage cellules de Müller est particulièrement pertinent pour étudier l'état physique des barrières de la rétine, car ces cellules sont une partie intégrante de la BRB et ILM. Les deux BRB et ILM sont fréquemment modifiées dans les maladies de la rétine et sont responsables de symptômes de la maladie.
Il existe plusieurs méthodes bien établies pour étudier l'intégrité de la BRB, tels que le test bleu Evans ou angiographie à la fluorescéine. Cependant, ces méthodes ne fournissent pas d'informations sur l'ampleur de la perméabilité BRB to molécules plus grandes, dans la fourchette de nanomètre. En outre, ils ne fournissent pas d'informations sur l'état d'autres obstacles de la rétine comme l'ILM. Pour étudier BRB perméabilité aux côtés de la rétine ILM, nous avons utilisé une méthode basée AAV qui fournit des informations sur la perméabilité de la BRB à des molécules plus grandes tout en indiquant l'état des ILM et de matrice extracellulaire de protéines dans les états pathologiques. Deux variantes de l'AAV sont utiles pour cette étude: AAV5 et ShH10. AAV5 a un tropisme naturel pour photorécepteurs mais il ne peut pas obtenir à travers la rétine externe lorsqu'il est administré dans le corps vitré lorsque l'ILM est intacte (c. dans les rétines de type sauvage). ShH10 a un fort tropisme envers les cellules gliales et étiqueter sélectivement les cellules gliales Müller dans les deux rétines sains et malades. ShH10 fournit la livraison de gènes plus efficace dans les rétines où ILM est compromise. Ces outils viraux couplés par immunohistochimie et le sang-analyse de l'ADN éclairent sur l'état des barrières de la rétine dans la maladie.
Introduction
Les cellules de Müller sont le principal composant des cellules gliales de la rétine. Morphologiquement, ils se étendent radialement à la rétine et leur endfeet, en contact avec le corps vitré, et font face à la MLI secrètes composants de ce dernier. Le MFI est une membrane de sous-sol composée d'une dizaine de différentes protéines de la matrice extracellulaire (laminine, l'agrine, le perlecan, nidogène, le collagène et les protéoglycanes de sulfate plusieurs héparine). Au cours du développement, sa présence est indispensable pour histogénèse rétinienne, la navigation des axones optiques, et la survie des cellules ganglionnaires de 1-3. Cependant, ILM est inessentiel dans la rétine adulte et peut être enlevée chirurgicalement dans certaines pathologies sans causer de dommages à la rétine 4. Dans la thérapie génique, cette membrane est une barrière physique pour la transduction efficace de la rétine en utilisant AAV 5 par injection intravitréenne.
Grâce à l'arborisation étendue de leurs processus, les cellules de Müller fournissent suppo nutritionnel et réglementairert à la fois les neurones rétiniens et les cellules vasculaires. Les cellules de Müller sont également impliqués dans la régulation de l'homéostasie de la rétine, dans la formation et le maintien de la BRB 6. Jonctions serrées entre les cellules endothéliales des capillaires rétiniens, Müller cellules, les astrocytes et les péricytes forment la BRB. BRB empêche certaines substances de pénétrer dans les nombreuses maladies retina.In comme la rétinopathie diabétique, l'occlusion veineuse rétinienne et les maladies respiratoires, l'hypoxie de la rétine provoque une fuite à travers la BRB 7-9. Cette rupture est associée à une augmentation de la perméabilité vasculaire conduisant à l'oedème vasogénique, décollement de la rétine et des dommages de la rétine.
Les cellules de Müller sont étroitement associés avec les vaisseaux sanguins et la membrane basale, jouant un rôle important à la fois l'intégrité BRB et ILM. Par conséquent, l'étiquetage des cellules gliales Müller est particulièrement pertinent pour l'étude de l'état physique de ces obstacles rétiniennes.
Classiqueallié, BRB perméabilité est mesurée en utilisant le test bleu Evans consistant en l'injection systémique de colorant bleu Evans, qui se lie de façon non covalente à l'albumine plasmatique. Ce test mesure la fuite d'albumine (protéine de taille moyenne, ~ 66 kDa) des vaisseaux sanguins dans la rétine (voir Protocoles Section 5) 10. Alternativement, la fuite vasculaire peut être visualisé par angiographie rétinienne fluorescence attestant de fuite de la fluorescéine (petite molécule, ~ 359 Da, voir Protocoles Section 6) 11. Néanmoins, les deux méthodes permettent d'évaluer la perméabilité BRB à de petites molécules et des protéines, mais ils ne fournissent pas d'informations sur l'intégrité de ILM.
Par conséquent, pour étudier la perméabilité BRB, nous avons utilisé une méthode basée AAV qui donne des informations sur la perméabilité BRB à des molécules plus grandes (par exemple, les particules AAV, diamètre de 25 nm). En effet, notre méthode peut détecter la présence de l'AAV transgène dans le sang, ce qui suggère que les particules ~ 25 nm de diamètre feriezêtre capable de se infiltrer dans la circulation sanguine. Cette méthode fournit également des informations sur la structure du GIP et des protéines de la matrice extracellulaire dans des conditions pathologiques. Deux variantes de l'AAV sont utiles pour cette étude: AAV5 et ShH10. Sous-rétinienne injecté, AAV5 a un tropisme naturel pour les photorécepteurs et épithélium pigmentaire de la rétine 12, mais il ne peut pas obtenir à travers la rétine externe lorsqu'il est administré dans le corps vitré dans les rétines de type sauvage avec ILM intacte 5,13. ShH10 est une variante de l'AAV qui a été conçu pour cibler spécifiquement les cellules gliales plus de neurones 14,15. ShH10 étiquettes sélectivement les cellules de Müller dans les deux rétines sains et malades avec une efficacité accrue dans les rétines avec des barrières compromis 16. Ces outils viraux couplés avec immuhistochemistry et l'analyse de sang-ADN fournissent des informations sur l'état des barrières de la rétine et leur implication dans la maladie (Figure 1).
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Protocol
Tous les animaux utilisés dans cette étude ont été pris en charge et traités conformément à la déclaration ARVO pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research.
1. Production d'AAV recombinant (rAAV) par transfection transitoire de cellules HEK-293 17,18
NOTE: Voir McClure C, JoVE (2011) 19.
- Purifier une préparation de plasmide à grande échelle (au moins 1 mg / ml) des plasmides de vecteurs d'AAV. Utilisez trois plasmides. Le plasmide AAV helper portant les gènes de réplication et de capside sans terminale inversée d'AAV répète RTI, la cassette d'expression du transgène portant l'AAV ITR appelé le plasmide de transfert, et le plasmide fournissant les gènes d'adénovirus helper E2, E4, et les gènes des ARN VA visés comme pHELPER.
- Transfecter des cellules 293 avec ces trois plasmides en utilisant de la polyéthylèneimine (ou un autre réactif de transfection). Au-dessus de 80% de l'efficacité de transfection est nécessaire pour une bonne virendements RAL.
- Purifier AAV recombinant de 293 lysats cellulaires sur un gradient de iodixanol. 15%, 25%, 40%, 60% et l'iodixanol est utilisée pour obtenir le gradient. Recueillir la fraction de l'iodixanol 40% contenant des particules d'AAV, on concentre la fraction après ultracentrifugation à 500000 g pendant 1 h et l'échange contre du tampon PBS (solution saline tamponnée au phosphate) avec 0,001% de Pluronic.
- Pour déterminer le titre génomique viral 20, effectuer une digestion ProteinaseK DNAse suivie par qPCR. Les amorces avant et arrière amplifient la région de 62 pb situé dans le AAV2 ITR. Pour la norme de plasmide, la sonde est marquée avec FAM et a un trou noir extincteur (BHQ).
- Effectuer qPCR (réaction en chaîne de la polymérase quantitative) dans un volume final de 25 ul en utilisant 340 nM inverser ITR amorce, 100 nM ITR l'amorce, 100 nM sonde AAV2 ITR, mM dNTP 0,4, 2 mM de MgCl2, 1x Platinum Taq Buffer, 1U Platinum Taq et 5 modèle de pi (standard, l'échantillon et aucun contrôle de modèle).
- Pourla norme, utiliser le plasmide pour la transfection dans 7 x 10 dilutions en série (5 pi chacun de 2 x 10 9 à 2 x 10 3 génomes / ml, aboutissent à une concentration finale de 10 oct-10 avril génomes / ml).
- Commencer le programme d'une étape de dénaturation initiale à 95 ° C pendant 15 min suivi par 40 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 1 min et d'hybridation / élongation à 60 ° C pendant 1 min. Conserver à 4 ° C pour un stockage à court terme ou à -20 ° C pendant longues périodes de stockage.
2. Injection intravitréenne de l'AAV
- Anesthésier les souris C57BL6J avec de la kétamine (50 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) et vérifier la perte du réflexe de redressement, la réponse de retrait réflexe et pincement de la queue indique une anesthésie appropriée. Dilater élèves par application à la cornée de néosynéphrine 5% et 0,5% Mydriaticum collyre. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Passer un G disposab ultrafine 30aiguille à travers le l'équateur et à côté du limbe, dans la cavité vitréenne (voir Chiu K, JoVE (2007) 21). Injecter 1 ul mère contenant 1 à 4 x 10 11 vp de ShH10-GFP ou AAV5-GFP avec l'observation directe de l'aiguille dans le centre de la cavité vitréenne (Figure 1). Utilisez un œil comme un contrôle pour des expériences d'ILM. Injecter deux yeux pour des expériences BRB. Appliquer un traitement topique anti-inflammatoire et antibactérien sur les yeux injectés.
- Dilater élèves néosynéphrine et Mydriaticum collyre pour l'imagerie. Effectuer des examens du fond d'œil d'une caméra de fond d'œil à suivre GFP (Green Fluorescent Protein) expression 1 semaine, 2 semaines, 1 mois et 2 mois après l'injection intravitréenne (Figure 1). Sacrifiez souris par inhalation de CO 2 1 à 2 mois après l'injection.
3. immunohistochimie
- Pour cryosections rétiniennes (figure 1), disséquer yeux énucléés pour enlever lens et de la cornée, et l'immersion correctif dans 4% de paraformaldehyde pendant 1 heure.
- Cryoprotect les yeux préalablement fixés dans 10% de saccharose pendant 1 heure à température ambiante, 20% de saccharose pour une autre heure à la température ambiante. Cryoprotect dans une solution de saccharose à 30%, pendant une nuit à 4 ° C. Geler et œilletons intégrer dans l'intégration résine telle que Cryo-matrice. Faire 10 um cryosections et monter sur des lames spécialement traités pour les sections de tissus congelés et améliorer l'adhérence des tissus pendant la coloration.
- Perméabiliser sections avec 0,1% de Triton X100 dans du PBS pH 7,4 pendant 5 min. Lavage dans PBS 2x bloc et pendant 1 heure à température ambiante dans du PBS avec 1% de BSA, 0,1% de Tween 20.
- Pour flatmounts rétiniennes (figure 1), fixer les yeux énucléés dans 4% de paraformaldehyde pendant 15 min pour faciliter la dissection.
- Dans 15 à 30 min, disséquer les yeux pour enlever la cornée et le cristallin. Séparer la rétine de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et la sclérotique en coupant autour de l'ora serrata etle nerf optique. Plongez dans l'univers du paraformaldéhyde 4% pendant 30 min à fixer la rétine et la protéine fluorescente dans les cellules rétiniennes transduites (fixation ne doit pas dépasser 24 heures). Laver 5 min dans du PBS stérile, pH 7,4.
- Changer le PBS à un tampon de blocage (PBS avec 1% de BSA, 2% de sérum de chèvre normal ou d'âne, 0,5% de Triton X-100), et incuber dans du tampon de blocage pour soit 4 heures à la température ambiante ou à 4 ° C pendant une nuit.
- Incuber les tissus avec des anticorps primaires dans du tampon de blocage pour soit 4 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C. Laver 3x avec PBS.
NOTE: Les anticorps utilisés sont les suivants: anti-laminine (1/1000) marquer l'ILM, clone anti-rhodopsine 4D2 (1/500) tiges d'étiquetage, anti-glutamine synthétase clone GS-6 (1/1500) étiquetage cellules de Müller PNA, lectine (1/40) cônes d'étiquetage. - Incuber tissus avec dilution 1: 500 d'anticorps secondaires conjugués fluor alexa au tampon de blocage pendant 1 heure (cryosections) ou 2 h (flatmounts) à la salle Temperature et protégé de la lumière. Laver 3x avec PBS.
- Faire des coupes à soulager la rétine et il flatmount sur une lame de verre avec soit le photorécepteur ou une cellule ganglionnaire de la rétine (RGC) côté tourné vers le haut. Ajouter mountingmedium aqueuse, appliquer lamelle et conserver à 4 ° C.
- Effectuer la microscopie confocale à balayage laser sur microscope confocal. Acquérir les images séquentiellement, ligne par ligne, de réduire excitation et d'émission diaphonie. Définir taille de pas en fonction de la théorème d'échantillonnage de Nyquist-Shannon. Utiliser les paramètres d'exposition qui minimisent pixels sursaturées dans les images finales. Processus images 12 bits avec les Fidji, projet Z-sections sur un seul plan utilisant l'intensité maximale en vertu de la fonction Z-projet et enfin convertir en mode couleur 8 bits RVB.
Analyse PCR 4. des échantillons de sang de souris
- Injecter 100 ul mère contenant 1-4 x 10 11 particules d'un AAV-GFP dans la veine du pénis de souris C57BL6J anesthésiés (5% d'isofluranepour l'induction dans une chambre close et 2,5% d'isoflurane à travers un cône de nez au cours de la chirurgie) en utilisant une seringue d'insuline avec un ultra-fine aiguille 6 mm. Cet animal servira de contrôle positif de faire circuler des particules d'AAV.
- Échantillon de sang de la queue de la souris avant l'injection et 3 h, 24 h, deux jours, trois jours et après ShH10 injection intravitréenne ou après l'injection intrapénienne (Figure 1). Environ 10-20 ul est recueilli dans des tubes d'héparine. Sacrifiez souris par inhalation de CO 2 après l'achèvement de la procédure.
- Extraire l'ADN génomique à partir d'échantillons sanguins en utilisant le kit d'extraction de votre choix.
- Effectuer amplification par PCR de l'ADN génomique. Pour ce protocole utiliser la paire d'amorces suivante: GFP, le sens 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 ', 5'-antisens CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3'. Le programme de PCR suivant a été réalisé: 95 ° C 2 min (1 cycle); 95 ° C 45 sec, 55 ° C 1 min, 72 ° C 45 sec (30 cycles); 72 ° C 5 min (1 cycle);4 ° C attente.
5. Facultatif Evans Méthode Bleu
REMARQUE: quantifier la perméabilité vasculaire en mesurant la fuite d'albumine à partir de vaisseaux sanguins dans la rétine en utilisant la méthode au bleu Evans 10.
- Préparation de colorant bleu d'Evans par dissolution dans une solution saline normale (6 mg / ml), traitement aux ultrasons pendant 5 min dans un bain à ultrasons, et filtration à travers un filtre de 5 um.
- Anesthésier souris C57BL6J (isoflurane inhalation, voir l'étape 4.1), vérifiez la perte du réflexe de redressement, le réflexe de retrait et la réponse queue de pincement indiquant une anesthésie appropriée, et injecter bleu Evans (45 mg / kg) dans la veine du pénis (figure 1). Vérifiez que les pattes, le museau et les oreilles de souris deviennent clairement bleu suivant Evans injection bleu, confirmant l'absorption et la distribution du colorant.
- Anesthésier les souris C57BL6J 3 h après l'injection du colorant avec de la kétamine (50 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) et vérifier la perte de righting reflex indiquant une anesthésie appropriée. Exemple intracardiaque environ 500 pi de sang dans des tubes d'héparine et perfuser des souris pendant 2 min via le ventricule gauche avec un tampon citrate (0,05 M, pH 3,5; dissoudre 7,8 g d'acide citrique et 3,8 g de citrate de sodium dans 1 L d'eau distillée) préchauffée à 37 ° C pour éviter la vasoconstriction. Les souris sont sacrifiées par la perfusion.
- Après perfusion, énucléer et soigneusement disséquer les deux yeux sous un microscope opératoire pour recueillir les rétines (voir section 3.2). Rétines sec dans un évaporateur centrifuge nuit, pèsent, et d'extraire le colorant bleu Evans en incubant rétines avec 100 pi de formamide pendant 18 heures à 65 ° C avec agitation (100 xg). Échantillons Centrifugeuse de la rétine à 30K tubes filtrants oméga à 20,798.5 xg pendant 2 h à 4 ° C et des échantillons de sang de centrifugeuse à 20,798.5 g pendant 15 min à 4 ° C.
- Utilisez les deux surnageants pour mesurer l'absorbance. Déterminer l'absorbance de chaque échantillon en soustrayant le maximum d'absorbance for Evans bleu à 620 nm au minimum d'absorbance à 740 nm. Calculer Evans concentration de bleu dans le plasma et de la rétine à partir d'une courbe standard de bleu Evans dans le formamide. Exprimez BRB perméabilité dans microlitre de bleu Evans par gramme de la rétine sèche par heure (ul plasma / g de poids sec de la rétine / h).
6. Facultatif angiographie à la fluorescéine
REMARQUE: Les fuites de vaisseaux sanguins rétiniens chez les souris peut être visualisée par injection intraperitoneale de fluorescéine de sodium.
- Anesthésier souris C57BL6J (isoflurane inhalation, voir l'étape 4.1) et dilater les élèves avec des gouttes oculaires (néosynéphrine et Mydriaticum). Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Injecter par voie intraperitoneale de 0,01 à 0,02 ml de fluorescéine de sodium à 10% dans 0,1 ml de solution saline stérile pour angiographie à la fluorescéine.
- Recueillir des images des deux yeux après l'injection à l'aide d'une caméra de fond d'œil. Sacrifiez souris par inhalation de CO 2 après la proprocédure.
NOTE: 20 sec sont nécessaires pour les vaisseaux rétiniens deviennent visibles à l'angiographie. Images doivent être capturé entre 3-10 min après injection de fluorescéine maximale. Les points de fuite (le cas échéant) sont observables après 2,5 min. Aux points de temps plus tard, la qualité d'image est perdue en raison de la fluorescéine de sodium diffusant dans les images donc que peu vitreux, obtenus après sont utilisés pour l'analyse.
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Representative Results
Nous nous attendons augmenté transduction rétinienne des cellules gliales Müller utilisant ShH10 si le modèle animal montre des perturbations dans la structure de l'ILM (Figure 2A - B). Par exemple, nous avons montré qu'en l'absence de Dp71, cibles ShH10 spécifiquement mais plus efficacement les cellules gliales Müller par injection intravitréenne, indiquant augmentation de la perméabilité de l'ILM dans cette lignée de souris par rapport à souris de type sauvage 16 (figure 2C - F).
AAV5 peut également être utilisé comme un indicateur de la perméabilité ILM. AAV5, inefficaces par injection intravitréenne chez les souris de type sauvage, devient fortement efficace dans la livraison de gènes photorécepteurs à la souris avec les obstacles de la rétine compromis tels que les souris Dp71 nul 16 ou dans d'autres dégénérescences rétiniennes 22 (Figure 2G - H). Cela confirme encore la désorganisation de ILM et increas de perméabilité potentielse dans la matrice extra-cellulaire entourant les neurones rétiniens.
Nous avons constaté que, la répartition BRB de souris Dp71 nul reste sélective à des particules d'AAV car aucune trace de l'AAV ont été trouvées dans des échantillons de sang de injecté par voie intravitréenne Dp71 nulle souris 16 (Figure 3).
Figure 1:. Représentation schématique du protocole général Après la production d'AAV, les particules sont injectées dans le corps vitré ou dans la veine du pénis de souris adultes anesthésiés. images du fond d'œil avec un appareil photo Micron III sont effectuées pour suivre l'expression de la GFP. Le profil d'expression de GFP est analysé sur cryosections rétiniennes et flatmounted rétines grâce à immunohistochimie et images confocales. Le passage de l'AAV par la BRB est évaluée par une analyse PCR sur des échantillons de sang provenant de souris injectées par voie intravitréenne ou intrapenially, in afin de détecter la présence de la séquence de GFP, indicateur de la présence des particules d'AAV dans la circulation sanguine.
Figure 2: ILM perméabilité à l'AAV transduction images confocale de type sauvage et flatmounted rétines Dp71 nuls marqué avec un anticorps pan-laminine (A, B). (Barre d'échelle: 50 um). des images du fond d'œil montrant l'expression de la GFP (C, D). Rétines Flatmounted un mois après ShH10-GFP injection intravitréenne (E, F). Trois reconstitution dimensions (E *) de la zone indiquée par un astérisque dans E démontrant transduction Müller cellules gliales en vert et en rouge les astrocytes (anticorps anti-GFAP). Rétines Flatmounted un mois après l'injection intravitréenne de AAV5-GFP (G, H) (barre d'échelle: 500 um). Image confocale de la zone indiquée par un astérisque dans H montrant photorécepteurs transduites dans des segments extérieurs verts et des cônes en rouge (PNA lectine coloration) (H *). La colonne de gauche montre les résultats de la rétine de souris de type sauvage et de la colonne du milieu montre les résultats de la rétine de souris Dp71 nulles. Le schéma (I) représente AAV transduction de la rétine avec des barrières compromis que rétine Dp71-nulle, à travers le corps vitré. Abréviations: CV, vaisseaux choroïdiens; RPE, l'épithélium pigmentaire rétinien; Pce, cellules photoréceptrices (bâtonnets et cônes); Cellules gliales MGC, Müller; HC, cellules horizontales; BC, cellules bipolaires; AC, les cellules amacrines; M, la microglie; CE, les cellules endothéliales; P, péricytes; GC, les cellules ganglionnaires; A, astrocytes; ILM, la membrane limitante interne; V, vitreux; AAV, le virus adéno-associé. (Re-print avec la permission de Vacca et al., Glia (2013) 16, # 3483740951391).
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Figure 3: BRB perméabilité de particules de AAV amplification par PCR du transgène GFP extrait d'échantillons de sang de souris.. Les souris injectées par voie intravitréenne navigateur (IVT) avec ShH10-GFP ou intrapenially (IP) avec l'AAV-GFP à différents moments après l'injection. Lane 5-18, nombres impairs pour les souris de type sauvage et même des numéros pour les souris Dp71 nulles; piste 2, 1 ng du plasmide AAV, PTR-SB-smCBA-hGFP; piste 3, l'eau; voies 5-6, l'ADN de sang avant l'injection; voies 7-8, 3 heures après l'IVT; voies 9-10, 24 h post-IVT; voies 11 à 12, 24 h post-IP; voies 13 à 14, 48 h post-IVT; voies 15 à 16, 48 h post-IP; voies 17 à 18, 72 h post-IVT; couloirs 19-20, 72 h post-IP. Les pistes 1 et 4, Invitrogen échelle de l'échelle (100 pb): 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1500, 2000, 3000 pb. (Re-imprimer avec la permission de Vacca et al., Glia (2013) 16, # 3483740951391).
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Discussion
La BRB règle l'échange de molécules entre le sang et la rétine. Sa ventilation est associée à diverses maladies telles que la rétinopathie diabétique ou la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA). Nous avons récemment montré que, dans une souris de la dystrophine knock-out, qui affiche perméable BRB, la rétine devient plus permissive à la livraison de gènes médié par des vecteurs viraux adéno-associés (AAV). Cependant, malgré la perméabilité BRB particules d'AAV injectée par voie intraoculaire rester confiné dans le compartiment oculaire dans ce modèle. Nos résultats indiquent que la thérapie génique pour les maladies qui affichent BRB perméable ne représente pas de risques supplémentaires d'effets secondaires systémiques. En outre, ils soutiennent le fait que d'autres obstacles tels que l'ILM être compromise cours de la maladie de la rétine permettant un meilleur accès à des particules virales. Nos résultats nous conduisent à penser que les gènes codant pour AAV Reporter est un excellent outil pour étudier BRB perméabilité et l'intégrité des ILM dans des modèles animaux de la maladie de la rétine. Particument, la variante de AAV ShH10, qui marque spécifiquement les cellules gliales Müller peut être utilisé comme un outil pour marquer les cellules gliales de la rétine et de faire rapport sur l'état de la rétine en réponse à la maladie. ShH10 sera étiqueter sélectivement les cellules gliales Müller dans les deux rétines sains et malades. Toutefois, les deux ShH10 et d'autres AAV fourniront la livraison de gènes plus efficace dans les rétines avec des barrières compromis.
Certaines étapes critiques dans l'application des protocoles décrits ci-dessus sont (1) développent la dextérité manuelle pour effectuer l'injection intravitréenne la plus sûre, et (2) bien fixer le tissu avant et après dissection. En étudiant les barrières de la rétine, l'injection intravitréenne doit être bien exécuté ce est - sans toucher l'objectif ou la rétine. Endommager l'objectif ou le détachement de la rétine influence la perméabilité 23,24 BRB. En outre dommages de lentille empêche imagerie du fond d'œil. Toucher la rétine peut se rompre l'ILM et endommager la structure de la rétine. Pour éviter de toucher la rétine, l 'expériencementer doit observer la pointe de la seringue de Hamilton au milieu de la cavité vitréenne, en avant de la rétine. Un colorant non toxique peut être inclus (tels que la fluorescéine ou le rouge de phénol) dans la solution viral pour faciliter l'observation de l'injection de fluide dans le corps vitré. Les dommages à la rétine peut être facilement observée pendant l'imagerie du fond d'oeil en suivant la procédure d'injection. Une autre étape critique est la fixation du tissu après des niveaux d'expression suffisants soient atteints. Après l'énucléation, les yeux doivent être immédiatement immergés dans un tampon fixateur et avant perméabilisation de tissu une seconde fixation est nécessaire pour éviter les fuites de la GFP. Il peut être utile de se trancher la cornée avant d'immerger l'œil entier dans le fixateur - ceci donnera une chance de pénétrer dans le corps vitré le fixateur. Cette étape peut augmenter la stabilité globale du tissu.
Enfin, il est également important d'injecter suffisamment de particules d'AAV pour transduire efficacement la rétine et d'observer GFP expression sur les images de fond d'œil. La quantité optimale de particules AAV est d'environ 10 10 -10 11 vg par oeil, ci-dessous 10 10 particules de l'expression de la GFP est pas toujours observé par imagerie de fond d'oeil.
Cette technique ne donnera pas la possibilité d'observer directement l'ILM ou le système vasculaire sous la BRB. Toutefois, il fournit un moyen d'examiner les obstacles de la rétine et leur modification dans les états pathologiques, d'une manière qui ne était pas possible en utilisant le test bleu Evans et angiographie à la fluorescéine. Utilisation AAV avec des propriétés spécifiques de transduction de la rétine, il est possible d'obtenir un meilleur aperçu de l'état de la rétine à l'égard des cellules gliales, leur matrice extracellulaire et ILM. Après avoir maîtrisé cette technique, on peut tester l'efficacité des stratégies thérapeutiques et leur influence sur BRB et la perméabilité de la rétine et aller vers une meilleure compréhension de la progression de la maladie et la possibilité de rétablir des conditions normales après le traitement imodèle de souris na de maladie de la rétine.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0.5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight - 8.5 cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| curved Vanna scissor | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
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