Abstract
Muller-celler er de viktigste gliaceller i netthinnen. Deres slutt føtter danner grensene for netthinnen på det ytre og indre begrensende membraner (ILM), og i forbindelse med astrocytter pericytes og endotelceller de etablere blod-retinal barriere (BRB). BRB begrenser materialtransport mellom blodet og retina mens ILM fungerer som en basalmembran som definerer histologisk grensen mellom netthinnen og i glasslegemet. Merking Müller cellene er spesielt relevant å studere den fysiske tilstanden til netthinnens barrierer, som disse cellene er en integrert del av BRB og ILM. Både BRB og ILM er ofte endret på netthinnesykdom, og er ansvarlig for sykdomssymptomer.
Det er flere godt etablerte metoder for å studere integriteten til BRB, slik som Evans blue assay eller fluoresceinangiografi. Men disse metodene ikke gir informasjon om omfanget av BRB permeabilitet to større molekyler, i nanometerområdet. Dessuten trenger de ikke gi informasjon om tilstanden i andre retinal barrierer som ILM. Å studere BRB permeabilitet sammen retinal ILM, brukte vi en AAV basert metode som gir informasjon om permeabilitet av BRB til større molekyler mens indikerer tilstanden til ILM og ekstracellulære matrix proteiner i sykdomstilstander. To AAV varianter er nyttige for en slik studie: AAV5 og ShH10. AAV5 har en naturlig tropisme for fotoreseptorer, men det kan ikke komme over til den ytre retina når den administreres inn i glasslegemet når ILM er intakt (dvs. i villtype netthinne). ShH10 har en sterk tropisme mot gliacellene og selektivt vil merke Müller gliaceller i både friske og syke netthinne. ShH10 gir mer effektiv genet levering i netthinne der ILM er kompromittert. Disse viral verktøy kombinert med immunhistokjemi og blod-DNA-analyse belyse på staten netthinnens barrierer i sykdom.
Introduction
Müller-celler er hoved glial komponent av netthinnen. Morfologisk, spenner de retina radialt og deres endfeet, i kontakt med glasslegemet, står ILM og hemmelige delene av den sistnevnte. ILM er en basalmembran bestående av om lag ti forskjellige ekstracellulære matrix proteiner (laminin, agrin, perlecan, nidogen, kollagen og flere heparinsulfat proteoglykaner). Under utvikling, er dens tilstedeværelse uunnværlig for retinal histogenesis, navigering av optiske axoner, og overlevelse av ganglion celler 1-3. Imidlertid er ILM uvesentlig i voksen netthinnen og kan fjernes kirurgisk i visse patologiske tilstander uten å forårsake retinal skade 4. I genterapi, blir denne membranen en fysisk barriere for effektiv transduksjon av netthinnen ved hjelp AAVs etter intravitreal injeksjon 5.
Gjennom omfattende arborization av sine prosesser, Müller celler gi ernæringsmessige og regulatoriske support til både retinal nevroner og vaskulære celler. Muller-celler er også involvert i reguleringen av retinal homeostase, i dannelsen og opprettholdelsen av den BRB 6. Tett veikryss mellom netthinnens kapillære endotelceller, Müller celler, astrocytter og pericytes danne BRB. BRB hindrer visse stoffer kommer inn i retina.In mange sykdommer som diabetisk retinopati, retinalveneokklusjon og luftveissykdommer, hypoksi av netthinnen som forårsaker lekkasje gjennom BRB 7-9. Dette brudd er assosiert med en økning i vaskulær permeabilitet som fører til vasogenic ødem, netthinneavløsning og retinal skade.
Müller cellene er tett forbundet med blodårer og basalmembran, som spiller en viktig rolle i både BRB og ILM integritet. Derfor merking Müller gliaceller er særlig relevant for studiet av den fysiske tilstanden til disse retinal barrierer.
Classically, er BRB permeabiliteten målt ved hjelp av Evans blått-analysen består av systemisk injeksjon av Evans blått farvestoff, som bindes ikke-kovalent til plasma-albumin. Denne analysen måler albumin lekkasje (protein av middels størrelse, ~ 66 kDa) fra blodårene i netthinnen (se Protokoller avsnitt 5) 10. Alternativt kan den vaskulær lekkasje bli visualisert ved fluorescens retinal angiografi bevitner for lekkasje av fluorescein (lite molekyl, ~ 359 Da; se Protocols avsnitt 6) 11. Likevel, begge metodene tillate evaluering av BRB permeabilitet til små molekyler og proteiner, men de gir ikke informasjon om ILM integritet.
Derfor, for å studere BRB permeabilitet, brukte vi en AAV basert metode som gir informasjon om BRB permeabilitet til større molekyler (f.eks, AAV partikler, 25 nm diameter). Faktisk kan vår metode påvise tilstedeværelse av AAV transgenet i blodet, noe som kan tyde på at ~ 25 nm diameter partikler wouldvære i stand til å infiltrere inn i blodet. Denne fremgangsmåten tilveiebringer også informasjon om strukturen av ILM og ekstracellulære matriksproteiner i patologiske tilstander. To AAV varianter er nyttige for en slik studie: AAV5 og ShH10. Subretinally injisert, har AAV5 en naturlig tropisme for fotoreseptorer og retinal pigment epitel 12, men det kan ikke komme over til den ytre netthinnen når det gis i glasslegemet i villtype netthinne med intakt ILM 5,13. ShH10 er en AAV variant som har blitt utviklet spesifikt mot gliaceller enn nerveceller 14,15. ShH10 etiketter selektivt Müller celler hos både friske og syke netthinne med økt effektivitet i netthinne med kompromitterte barrierer 16. Disse viral verktøy kombinert med immuhistochemistry og blod-DNA-analyse gir informasjon om tilstanden i netthinnens barrierer og deres engasjement i sykdom (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr som brukes i denne studien var ivaretatt og behandlet i samsvar med ARVO erklæringen for bruk av dyr i Ophthalmic og Vision Research.
1. Produksjon av rekombinant AAV (rAAV) av Transient Transfeksjon av HEK-293 celler 17,18
MERK: Se McClure C, Jove (2011) 19.
- Rens en stor-skala plasmid preparat (minst 1 mg / ml) av AAV vektor plasmider. Bruke 3 plasmider. AAV plasmid som bærer hjelpe replikering og kapsidbindende gener uten AAV inverterte terminale gjentagelser Itrs, transgenet ekspresjonskassetten AAV som bærer ITR referert til som overførings plasmid, og plasmidet forsyne adenovirus hjelper genene E2, E4, og VA RNA gener omhandlet til som pHELPER.
- Transfektere 293-celler med disse tre plasmider ved bruk av polyetylenimin (eller annen transfeksjon reagens). Over 80% av transfeksjonseffektiviteten er nødvendig for god VIral avkastning.
- Rense rekombinant AAV fra 293 cellelysater på en iodixanol gradient. 15%, 25%, 40% og 60% iodixanol brukes for å oppnå den gradient. Samle 40% iodixanol fraksjon inneholdende AAV partikler, konsentrere fraksjonen etter ultrasentrifugering ved 500.000 x g i 1 time og bufferutveksling mot PBS (fosfatbufret saltvann) med 0,001% Pluronic.
- Å bestemme viral genomisk titer 20, utføre en DNAse ProteinaseK digest fulgt av QPCR. Fremover- og bakover primere forsterke 62 bp regionen ligger i AAV2 ITR. For plasmid-standarden, er proben merket med FAM og har en sort hull quencher (BHQ).
- Utføre qPCR (kvantitativ polymerasekjedereaksjon) i et sluttvolum på 25 pl ved bruk av 340 nM ITR revers primer, 100 nM ITR forover primer, 100 nM AAV2 ITR probe, 0,4 mM dNTP, 2 mM MgCl2, 1 x platina Taq-buffer, 1U platina Taq og 5 pl mal (standard, prøve og ingen mal kontroll).
- Forstandard, bruke plasmidet for transfeksjon i 7 x 10-gangers seriefortynninger (5 ul av hver av 2 x 10 9 2 x 10 3 genom / ml resulterer i en sluttkonsentrasjon fra 10 oktober til 10 april genom / ml).
- Begynner programmet ved en innledende denatureringstrinn ved 95 ° C i 15 minutter etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 1 min og gløding / forlengelse ved 60 ° C i 1 min. Oppbevar ved 4 ° C for en kortsiktig lagring eller ved -20 ° C i lengre lagringsperioder.
2. intravitreal injeksjon av AAV
- Bedøve C57BL6J mus med ketamin (50 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) og verifisere tap av stabiliserings refleks, tilbaketrekning refleks og hale klype svar som indikerer en skikkelig anesthetization. Utvid elever ved hornhinne anvendelse av neosynephrine 5% og mydriaticum 0,5% øyedråper. Bruk dyrlege salve på øynene for å hindre tørrhet mens under narkose.
- Passere en ultrafine 30 G disposable nål gjennom ekvator og ved siden av limbus, i glasslegemekaviteten (se Chiu K, Jove (2007) 21). Injisere en ul stam inneholder 1 til 4 x 10 11 vp av ShH10-GFP eller AAV5-GFP med direkte observasjon av nålen i sentrum av glasslegemekaviteten (figur 1). Bruk ett øye som en kontroll for ILM eksperimenter. Injisere begge øynene for BRB eksperimenter. Påfør en anti-inflammatorisk og antibakteriell aktuell behandling på injisert øyne.
- Utvid elever med neosynephrine og mydriaticum øyedråper for bildebehandling. Utføre fundus undersøkelser med et øye funduskamera å følge GFP (grønt fluorescerende protein) uttrykk en uke, to uker, en måned, og to måneder etter intravitreal injeksjon (figur 1). Ofre mus ved CO 2 innånding 1 til 2 måneder etter injeksjon.
3. Immunhistokjemi
- For retinal frysesnitt (figur 1), dissekere utskrapte øyne å fjerne lENS og hornhinnen, og nedsenking fikse i 4% paraformaldehyde for 1 time.
- Cryoprotect de tidligere faste øyne i 10% sukrose i 1 time ved romtemperatur, 20% sukrose for en annen time ved romtemperatur. Cryoprotect i 30% sukrose-oppløsning, over natten ved 4 ° C. Fryse og legge eyecups i embedding harpiks som Cryo-matrise. Gjør 10 mikrometer frysesnitt og montere på lysbilder spesielt behandlet for frosne vevssnitt og at forbedre vev tilslutning under farging.
- Permeabilize seksjoner med 0,1% Triton X100 i PBS pH 7,4 i 5 min. Vask 2 ganger i PBS og blokken i 1 time ved romtemperatur i PBS med 1% BSA, 0,1% Tween 20.
- For retinal flatmounts (figur 1), fikse utskrapte øyne i 4% paraformaldehyde i 15 minutter for å lette disseksjon.
- I 15-30 min, dissekere øynene for å fjerne hornhinnen og linsen. Separer netthinnen fra retinal pigment epitel (RPE) og sclera ved å kutte rundt ora serrata ogsynsnerven. Fordyp deg i 4% paraformaldehyde i ytterligere 30 min å fikse netthinnen og fluorescerende protein i transduserte netthinnens celler (fiksering må ikke overstige 24 timer). Vask 5 min i steril PBS, pH 7,4.
- Endre PBS til blokkeringsbuffer (PBS med 1% BSA, 2% normalt geiteserum eller esel, 0,5% Triton X-100), og inkubasjon i blokkeringsbuffer i 4 timer enten ved romtemperatur eller 4 ° C over natten.
- Inkuber vev med primære antistoffer i blokkeringsbuffer i 4 timer enten ved romtemperatur eller ved 4 ° C over natten. Vask 3 ganger med PBS.
MERK: De antistoffer som brukes er som følger: anti-laminin (1/1000) merking av ILM, anti-rhodopsin klone 4D2 (1/500) merking stenger, anti-glutaminsyntetase klone GS-6 (1/1500) merking Müller celler , PNA Lektin (1/40) merking kjegler. - Inkuber vev med 1: 500 fortynning av Alexa Fluor konjugerte sekundære antistoffer i blokkeringsbuffer i 1 time (frysesnitt) eller 2 timer (flatmounts) ved værelses tempetemperaturen og beskyttet mot lys. Vask 3 ganger med PBS.
- Gjør lindrende kutt til netthinnen og flatmount den på et glass lysbilde med enten fotoreseptoren eller Gangliecelle (RGC) siden vendt oppover. Legg vandig mountingmedium, gjelder dekkglass og oppbevar ved 4 ° C.
- Utføre konfokalmikroskopi på laser-scanning konfokal mikroskop. Erverve bilder i sekvens, linje for linje, for å redusere eksitasjon og emisjon crosstalk. Definere skritt størrelse i henhold til Nyquist-Shannon sampling teorem. Bruk eksponeringsinnstillinger som minimerer mettede piksler i det endelige bildet. Prosess 12-bits bilder med FIJI, prosjekt Z-seksjoner på et enkelt plan ved hjelp av maksimal intensitet i henhold til Z-prosjektet funksjon og til slutt konvertere til 8-bits RGB fargemodus.
4. PCR analyse av Mouse blodprøver
- Injisere 100 ul stam inneholdende 1 til 4 x 10 11 partikler av en AAV-GFP inn i den penile venen til bedøvede C57BL6J mus (5% isofluranfor induksjon i et tett kammer, og 2,5% isofluran gjennom en nesekonus under operasjon) ved anvendelse av en insulinsprøyte med en ultra-fine 6 mm nål. Dette dyret vil tjene som en positiv kontroll av sirkulerende AAV partikler.
- Eksempel blod fra mus hale før injeksjon og tre timers, 24-timers, 2 dager, og tre dager etter ShH10 intravitreal injeksjon eller etter intrapenile injeksjon (figur 1). 10-20 ul oppsamles i heparin rør. Ofre mus ved CO 2 innånding etter fullføring av prosedyren.
- Utdrag genomisk DNA fra blodprøver med utvinning kit av ditt valg.
- Utføre PCR-amplifikasjon av genomisk DNA. For denne protokollen bruke følgende primer par: GFP, sanse 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 ', antisense 5'-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3'. Den følgende PCR-programmet ble utført: 95 ° C 2 minutter (1 syklus); 95 ° C 45 sek, 55 ° C 1 min, 72 ° C 45 sekunder (30 sykluser); 72 ° C 5 minutter (1 syklus);4 ° C hold.
5. Valgfritt Evans Blå Method
MERK: Kvantifisere vaskulær permeabilitet ved å måle albumin lekkasje fra blodkar i netthinnen ved hjelp av Evans blå metode 10.
- Forbered Evans blå fargestoff ved oppløsning i en normal saltløsning (6 mg / ml), ultralydbehandling i 5 minutter i en ultrasonisk renere, og filtrering gjennom et 5 um-filter.
- Bedøve C57BL6J mus (isofluran innånding, se trinn 4.1), sjekk tap av stabiliserings refleks, tilbaketrekning refleks og hale klype svar som indikerer en skikkelig anesthetization, og injisere Evans blå (45 mg / kg) gjennom penile blodåre (figur 1). Sjekk at poter, snute og ører av mus bli klart blå følgende Evans blå injeksjon, bekrefter opptak og distribusjon av fargestoff.
- Bedøve C57BL6J mus tre timer etter injeksjon av fargestoffet med ketamin (50 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) og kontrollere tap av righting refleks indikerer en skikkelig anesthetization. Eksempel intracardially omtrent 500 ul blod i heparin rør og perfuse mus i 2 min via den venstre ventrikkel med en citratbuffer (0,05 M, pH 3,5, oppløses 7,8 g sitronsyre og 3,8 g natrium-citrat i 1 liter destillert vann) forvarmet til 37 ° C for å hindre vasokonstriksjon. Musene avlives via perfusjon.
- Etter perfusjon, enucleate og nøye dissekere begge øynene under en drifts mikroskop for å samle netthinne (se punkt 3.2). Tørre netthinne i en sentrifugal fordamperen over natten, veier, og ekstrahere Evans blått fargestoff ved inkubering netthinne med 100 pl formamid i 18 timer ved 65 ° C med risting (100 xg). Sentrifuger netthinne prøver i 30K omega filterrør på 20,798.5 xg for 2 timer ved 4 ° C og sentrifuger blodprøver på 20,798.5 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Bruk begge Supernatantene å måle absorbans. Bestem absorbansen til hver prøve ved å trekke fra maksimum absorbans for Evans blue ved 620 nm absorbansen til minimum ved 740 nm. Beregn Evans blue-konsentrasjon i plasma og retina fra en standardkurve av Evans blått i formamid. Uttrykke BRB permeabilitet i mikroliter av Evans blå per gram tørr retina per time (mL plasma / g retinal tørrvekt / time).
6. Valgfritt fluoresceinangiografi
MERK: Lekkasje fra netthinnens blodkar i mus kan visualiseres ved intraperitoneal injeksjon av natrium fluorescein.
- Bedøve C57BL6J mus (isofluran innånding, se trinn 4.1) og strekke elever med øyedråper (neosynephrine og mydriaticum). Bruk dyrlege salve på øynene for å hindre tørrhet mens under narkose.
- Injiser intraperitonealt 0,01-0,02 ml 10% natrium-fluorescein i 0,1 ml sterilt saltvann for fluoresceinangiografi.
- Samle bilder av begge øyne etter injeksjon ved hjelp av et øye funduskamera. Ofre mus ved CO 2 innånding etter promåten.
MERK: 20 sek er nødvendig for de retinalkar å bli synlig på angiografi. Bilder må være fanget mellom 3-10 min maksimum etter fluorescein injeksjon. Lekkasje flekker (hvis det finnes) er observer etter 2,5 min. På senere tidspunkter bildekvaliteten går tapt på grunn av natrium fluorescein spre inn i glasslegemet, og dermed bare bilder kort tid oppnådd etter brukes for analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi forventer økt retinal transduksjon av Muller gliaceller hjelp ShH10 hvis dyremodellen viser perturbasjoner i strukturen av ILM (Figur 2A - B). For eksempel har vi vist at i fravær av Dp71, ShH10 mål spesifikt, men mer effektivt Müller gliaceller etter intravitreal injeksjon, noe som indikerer økt permeabilitet av ILM i denne muselinje sammenlignet med villtype-mus 16 (figur 2C - F).
AAV5 kan også brukes som en indikator for ILM permeabilitet. AAV5, ineffektiv ved intravitreal injeksjon i villtype mus, blir sterkt effektive i genet levering til fotoreseptorene i mus med svekket retinal barrierer som Dp71-null mus 16 eller i andre retinal degeneration 22 (Figur 2G - H). Dette bekrefter ILM uorden og potensielle permeabilitet increas videree i den ekstra-cellulære matrix rundt netthinnens nerveceller.
Vi fant at den BRB nedbryting av Dp71-null-mus forblir selektivt å AAV partikler siden ingen spor av AAV ble funnet i blodprøver av intravitrealt injisert Dp71-null-mus 16 (figur 3).
Fig. 1: Skjematisk fremstilling av den generelle protokoll Etter AAV produksjon, blir partiklene sprøytes inn i glasslegemet og inn i den penile venen til bedøvede voksne mus. Fundus bilder med Micron III kamera er utført for å følge GFP uttrykk. GFP uttrykk mønster analyseres på netthinnens frysesnitt og flatmounted netthinne takket være immunhistokjemi og konfokale bilder. AAV passasje gjennom BRB er vurdert av PCR-analyse av blodprøver fra intravitrealt eller intrapenially injisert mus, jegn For å påvise tilstedeværelsen av GFP-sekvens, indikator for AAV partikler tilstedeværelse i blodet.
Figur 2: ILM permeabilitet til AAV transduksjon Confocal bilder av flatmounted villtype og Dp71-null netthinne merket med en pan-laminin antistoff (A, B). (Skala bar: 50 mikrometer). Fundus bilder som viser GFP uttrykk (C, D). Flatmounted netthinne en måned etter ShH10-GFP intravitreal injeksjon (E, F). Tredimensjonal tilberedning (E *) av området merket med en stjerne i E viser transduserte Müller gliaceller i grønt og astrocytter i rødt (anti-GFAP antistoff). Flatmounted netthinne en måned etter intravitreal injeksjon av AAV5-GFP (G, H) (skala bar: 500 mikrometer). Konfokalt bilde av området er angitt med en stjerne i H viser transduserte fotoreseptorer i grønne og koniske ytre segmenter i rødt (PNA lektin-farging) (H *). Den venstre kolonnen viser resultater fra villtype mus netthinne og den midterste kolonnen viser resultater fra Dp71-null mus netthinne. Skjemaet (I) representerer AAV transduksjon av netthinnen med kompromitterte barrierer som Dp71-null netthinnen, gjennom glasslegemet. Forkortelser: CV, koroidal fartøyer; RPE, retinal pigment epitel; PHR, fotoreseptorcellene (staver og tapper); MGC, Müller gliaceller; HC, horisontale celler; BC, bipolare celler; AC, amacrine celler; M, mikroglia; EC, endotelceller; P, pericytes; GC, ganglion celler; A, astrocytter; ILM, indre begrensende membran; V, glasslegemet; AAV, adenoassosiert virus. (Re-print med tillatelse fra Vacca et al., Glia (2013) 16, # 3483740951391).
tp_upload / 52451 / 52451fig3.jpg "/>
Figur 3: BRB permeabilitet for AAV partikler PCR-amplifisering av GFP transgen ekstrahert fra museblodprøver.. Mus injisert enten intravitrealt (IVT) med ShH10-GFP eller intrapenially (IP) med AAV-GFP på forskjellige tidspunkter etter injeksjon. Kjørefelt 5-18, oddetall for villtype mus og partall for Dp71-null mus; kjørefelt 2, 1 ng av AAV plasmid, PTR-SB-smCBA-hGFP; felt 3, vann; baner 5-6, blod DNA før injeksjon; baner 7-8, tre timer etter IVT; baner 9-10, 24 timer etter IVT; baner 11-12, 24 timer etter IP; baner 13-14, 48 timer etter IVT; baner 15-16, 48 timer etter IP; baner 17-18, 72 timer etter IVT; baner 19-20, 72 timer etter IP. Felt 1 og 4, Invitrogen skala stige (100 bp): 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1500, 2000, 3000 bp. (Re-skrive ut med tillatelse fra Vacca et al., Glia (2013) 16, # 3483740951391).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den BRB regulerer utveksling av molekyler mellom blod og retina. Dens sammenbrudd er assosiert med ulike sykdommer som diabetisk retinopati eller aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). Vi har nylig viste at i en dystrophin knock-out mus, som viser gjennomtrengelig BRB, blir mer ettergivende til genet levering mediert av adenoassosiert virale vektorer (AAV) netthinnen. Imidlertid, til tross BRB permeabilitet AAV partikler injisert Intraokulært forbli begrenset til det okulære rommet i denne modellen. Våre resultater tyder på at genet terapi for sykdommer som viser gjennomtrengelig BRB ikke representerer ytterligere risiko for systemiske bivirkninger. Videre støtter de at andre barrierer som ILM bli kompromittert under retinal sykdom som gir bedre tilgang til viruspartikler. Våre funn fører oss til å tenke at AAV koding reporter gener er et utmerket verktøy for å studere BRB permeabilitet og ILM integritet i dyremodeller av retinal sykdom. SpesiLedes kan det AAV variant ShH10, som spesifikt etiketter Müller gliaceller brukes som et verktøy til å merke retinal gliaceller og rapportere om tilstanden i netthinnen som svar på sykdom. ShH10 vil selektivt merke Müller gliaceller i både friske og syke netthinne. Men både ShH10 og andre AAVs gi mer effektiv genet levering i netthinne med svekket barrierer.
Noen viktige skritt i å bruke de ovennevnte protokoller (1) å utvikle fingerferdighet for å utføre den sikreste intravitreal injeksjon, og (2) ordentlig feste vevet før og etter disseksjon. I å studere retinal barrierer, bør intravitreal injeksjon være godt utført som er - uten å berøre linsen eller netthinnen. Skade linsen eller løsne netthinnen påvirker BRB permeabilitet 23,24. I tillegg linse skade hindrer fundus bildebehandling. Berøring av netthinnen kan sprekke ILM og skade netthinnens struktur. For å unngå å ta på netthinnen, den experiMLegg bør observere spissen på Hamilton-sprøyte i midten av den glasslegemet, i front av netthinnen. Et ikke-toksisk farvestoff kan være inkludert (så som Fenol rød eller fluorescein) i den virale løsning for å hjelpe til med observasjonen av fluidinjeksjon inn i glasslegemet. Skade på retina kan lett observeres under fundus avbildning etter injeksjonen prosedyre. Et annet kritisk punkt er fiksering av vevet etter at tilstrekkelige ekspresjonsnivåer er nådd. Etter enucleation, må øynene øyeblikkelig nedsenket i fiksativ buffer og før vevet permeabilization et andre fiksering er nødvendig for å hindre lekkasje GFP. Det kan være nyttig å slit hornhinnen før dyppe hele øyet i fiksativ - dette vil gi fiksativ en sjanse til å trenge inn i glasslegemet. Dette trinnet kan øke den totale vev stabilitet.
Endelig er det også viktig å injisere nok AAV partikler for å transdusere effektivt retina og å observere GFP expression på øyefundusbilder. Den optimale mengden av AAV partiklene er omtrent 10 10 -10 11 vg pr øye, under 10 10 partikler GFP uttrykk er ikke alltid observert av fundus avbildning.
Denne teknikken vil ikke gi mulighet for å direkte observere ILM eller vaskulaturen under BRB. Men det gir en måte å undersøke retinal barrierer og deres modifikasjon i sykdomstilstander, på en måte som tidligere ikke var mulig å bruke Evans blå analysen og fluoresceinangiografi. Ved hjelp AAVs med spesifikke retinal transduksjon egenskaper, er det mulig å få bedre innsikt i tilstanden av netthinnen med hensyn til gliacellene, deres ekstracellulære matrise og ILM. Etter å mestre denne teknikken, kan man teste effekten av terapeutiske strategier og deres innflytelse på BRB og retinal permeabilitet og gå mot en bedre forståelse av sykdomsutvikling og mulighet til å gjenopprette normale forhold etter behandling ina musemodell for netthinnesykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0.5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight - 8.5 cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| curved Vanna scissor | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
