Abstract
Müller клетки являются основными глиальные клетки сетчатки. Их конечные ноги образуют границы сетчатки на наружной и внутренней мембран, ограничивающих (ILM), так и в сочетании с астроцитов, перицитов и эндотелиальных клеток, они устанавливают крови сетчатки барьер (BRB). BRB ограничивает перемещение материала между кровоток и сетчатке, а ILM выступает в качестве базальной мембраны, которая определяет гистологически границу между сетчаткой и полость стекловидного тела. Маркировка Мюллера клетки особенно актуальным изучение физического состояния сетчатки барьеров, так как эти клетки являются неотъемлемой частью BRB и ILM. Оба белорусских рублей и ILM часто изменяется в болезни сетчатки и отвечают за симптомов заболевания.
Есть несколько хорошо зарекомендовавших себя методов исследования целостности BRB, такие как Эванс голубой анализа или флуоресцентной ангиографии. Однако эти методы не дают информации о степени BRB проницаемости тО более крупных молекул, в нанометровом диапазоне. Кроме того, они не предоставляют информацию о состоянии других сетчатки барьерами, такими как ILM. Для изучения Brb проницаемость наряду сетчатки ILM, мы использовали метод, основанный AAV, который предоставляет информацию о проницаемости BRB к более крупных молекул, указывая при этом на состояние ILM и белков внеклеточного матрикса в болезненных состояний. Два варианта AAV полезны для такого исследования: AAV5 и ShH10. AAV5 имеет естественную тропизм к фоторецепторов, но он не может донести до внешней сетчатки при введении в стекловидное тело, когда ILM нетронутыми (т.е. в сетчатке дикого типа). ShH10 имеет сильную тропизм к глиальных клеток и выборочно пометить Клетки Мюллера как у здоровых и больных сетчатки. ShH10 обеспечивает более эффективную доставку генов в сетчатке, где ILM находится под угрозой. Эти вирусные инструменты в сочетании с иммуногистохимии и крови Анализ ДНК пролить свет на состояние сетчатки барьеров в болезни.
Introduction
Müller клетки являются основным компонентом глиальных сетчатки. Морфологически они охватывают сетчатки радиально и их endfeet, в контакте с стекловидное тело, сталкиваются с ILM и секретные компоненты последнего. ILM является базальная мембрана состоит из около десяти различных белков внеклеточного матрикса (ламинином, агрин, перлекан, нидоген, коллагеновых и несколько гепарин сульфат протеогликаны). Во время разработки, ее присутствие является необходимым условием для сетчатки гистогенеза, навигации оптических аксонов, и выживание клеток ганглиев 1-3. Тем не менее, ILM необязательно во взрослой сетчатке и может быть удалена хирургическим путем в некоторых патологий, не вызывая повреждения сетчатки 4. В генной терапии, эта мембрана становится физический барьер для эффективного трансдукции сетчатки с использованием AAVs путем инъекции в стекловидное тело 5.
Через обширный разветвление процессов их, Мюллер клетки обеспечивают питательную и нормативно-SuppoРТ оба нейроны сетчатки и сосудистой клетки. Мюллер клетки также участвуют в регуляции сетчатки гомеостаза, в формировании и поддержании BRB 6. Плотные соединения между сетчатки эндотелиальных клеток капилляров, Мюллер клетки, астроциты и перициты образуют BRB. BRB предотвращает некоторые вещества из ввода retina.In многих заболеваний, таких как диабетическая ретинопатия, окклюзии вены сетчатки и респираторных заболеваний, гипоксия сетчатки вызывает утечки через BRB 7-9. Этот разрыв связан с увеличением проницаемости сосудов, ведущих к вазогенного отека, отслойки сетчатки и повреждения сетчатки.
Мюллер клетки тесно ассоциированы с кровеносными сосудами и базальной мембраны, играет важную роль как в BRB и ILM целостности. Следовательно, называя Мюллера глиальные клетки, в частности, отношение к изучению физического состояния этих сетчатки барьеров.
Классическийсоюзник, BRB проницаемость измеряется с помощью Evans Blue анализа, состоящий из системной инъекции синего красителя Эванса, который связывается нековалентно альбумина плазмы. Этот анализ измеряет утечку альбумина (белка промежуточного размера, ~ 66 кДа) из кровеносных сосудов в сетчатке (см Протоколы раздел 5) 10. Кроме того, сосудистой утечки могут быть визуализированы с помощью флуоресцентной сетчатки ангиографии, подтверждающего наличие утечек флуоресцеина (малой молекулы, ~ 359 Да, см Протоколы раздел 6) 11. Тем не менее, оба метода позволяют оценить BRB проницаемости для малых молекул и белков, но они не дают информации о целостности ILM.
Таким образом, для изучения Brb проницаемость, мы использовали метод, основанный AAV, который дает информацию о BRB проницаемости для больших молекул (например, частиц AAV, диаметр 25 нм). Частицы Действительно, наш метод может обнаружить присутствие AAV трансгена в крови, которые бы предположить, что ~ 25 нм в диаметре быбыть в состоянии проникнуть в кровь. Этот метод также дает информацию о структуре ILM и белков внеклеточного матрикса при патологических состояниях. Два варианта AAV полезны для такого исследования: AAV5 и ShH10. Subretinally инъекций, AAV5 имеет естественную тропизм к фоторецепторов и пигментного эпителия сетчатки 12, но он не может донести до внешней сетчатки при введении в стекловидное тело в сетчатке дикого типа с неповрежденной ILM 5,13. ShH10 является AAV вариант, который был разработан специально для целевой глиальные клетки более нейронов 14,15. ShH10 выборочно этикетки Мюллер клеток в здоровых и больных сетчатки с повышением эффективности сетчатки с ослабленной барьеров 16. Эти вирусные инструменты в сочетании с immuhistochemistry и анализа крови ДНК предоставить информацию о состоянии сетчатки барьеров и их участия в болезни (рис 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные, используемые в данном исследовании, уход и обрабатывается в соответствии с Заявлением ARVO для использования животных в офтальмологических и Vision Research.
1. Получение рекомбинантного AAV (Раав) по временной трансфекции из клеток НЕК-293 17,18
ПРИМЕЧАНИЕ: См МакКлюр C, Юпитер (2011) 19.
- Очищают масштабную подготовку плазмиды (по крайней мере 1 мг / мл) из AAV вектор плазмид. Используйте 3 плазмид. AAV хелпер плазмидой, несущей гены репликации и капсида без AAV перевернутой концевые повторы РМЭ, кассету экспрессии трансгена, несущий AAV ITR называют передаточной плазмиды, и плазмиды подачи аденовируса вспомогательные гены E2, E4, и гены VA РНК, упомянутых как pHELPER.
- Трансфекции клеток 293 с этими 3 плазмид с использованием полиэтиленимина (или другого реагента для трансфекции). Выше 80% эффективности трансфекции необходимо для хорошего VIRAL урожайности.
- Очищают рекомбинантного AAV от 293 клеточных лизатов на Иодиксанол градиента. 15%, 25%, 40% и 60% иодиксанол используется для получения градиента. Сбор 40% иодиксанола фракции, содержащей частицы AAV, концентрируют фракцию после центрифугирования при 500000 х г в течение 1 ч и замены буфера против PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) с 0,001% Pluronic.
- Для определения вирусной геномной титр 20, выполнить ДНКазы ProteinaseK дайджест затем QPCR. Передний и обратный праймеры амплификации область 62 б.п., расположенный в AAV2 ИТР. Для стандарта плазмиды, зонд метили FAM и имеет черную дыру гаситель (BHQ).
- Провести КПЦР (количественный полимеразная цепная реакция) в конечном объеме 25 мкл с использованием 340 нМ обратного праймера, ITR 100 нм вперед ITR праймера, 100 нм AAV2 ITR зонд, 0,4 мМ дНТФ, 2 мМ MgCl2, 1 платина Taq буфера, 1U платины Taq и 5 шаблон мкл (стандарт, образец без контроля шаблон).
- Длястандарт, с помощью плазмиды для трансфекции в 7 х 10-кратных серийных разведений (5 мкл каждого из 2 · 10 9 до 2 · 10 3 геномов / мл в результате чего в конечной концентрации от 10 до 10 10 4 геномов / мл).
- Начало программы в начальной стадии денатурации при 95 ° С в течение 15 мин с последующими 40 циклами денатурации при 95 ° С в течение 1 мин и отжига / продления при 60 ° С в течение 1 мин. Хранить при 4 ° С для кратковременного хранения или при -20 ° С в течение длительных периодов хранения.
2. инъекция AAV
- Обезболить мышей C57BL6J кетамином (50 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) и проверить потерю рефлекса, реакцию снятия рефлекс и хвост пинч, указывающее надлежащую обезболивания. Разбавить учеников роговицы применения neosynephrine 5% и mydriaticum 0,5% глазные капли. Используйте ветеринар мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
- Передайте ультрадисперсных 30 г disposabле иглы через экватор, а рядом с лимба, в полость стекловидного тела (см Чиу K, ей-богу (2007) 21). Подайте 1 мкл семенного материала, содержащего от 1 до 4 х 10 11 вице-президент компании ShH10-GFP или AAV5-GFP под непосредственным наблюдением иглы в центре полость стекловидного тела (рис 1). Используйте один глаз в качестве контроля для ILM экспериментов. Подайте на оба глаза для BRB экспериментов. Применить противовоспалительное и антибактериальное местное лечение на вводимых в глаза.
- Разбавить учеников с neosynephrine и mydriaticum глазные капли для визуализации. Выполните глазного дна экзамены с глазного дна камеры, чтобы следить GFP (зеленый флуоресцентный белок) выражение 1 неделю, 2 недели, 1 месяц, и через 2 месяца после инъекции в стекловидное тело (рис 1). Жертвоприношение мышей СО 2 ингаляции 1 до 2 месяцев после инъекции.
3. Иммуногистохимия
- Для сетчатки криосрезов (рис 1), анализировать энуклеированные глаза, чтобы удалить лЭНС и роговицы, и погружение исправление в 4% параформальдегид в течение 1 часа.
- Cryoprotect ранее фиксированные глаза в 10% сахарозы в течение 1 ч при комнатной температуре, 20% сахарозы в течение еще часа при комнатной температуре. Cryoprotect в 30% растворе сахарозы, в течение ночи при 4 ° С. Замораживание и вставлять наглазники во внедрении смолы, такие как Cryo-матрицы. Сделайте 10 мкм криосрезы и смонтировать на слайдах специально обработанных для замороженных срезов и улучшают ткани соблюдение во время окрашивания.
- Проницаемыми секции с 0,1% Triton X100 в PBS, рН 7,4 в течение 5 мин. Промыть 2x в PBS и блок в течение 1 ч при комнатной температуре в PBS с 1% BSA, 0,1% Твин-20.
- Для сетчатки flatmounts (рис 1), исправить энуклеированные глаза в 4% параформальдегида в течение 15 минут, чтобы облегчить рассечение.
- В 15-30 мин, вскрыть глаза, чтобы удалить роговицы и хрусталика. Отделите сетчатку от пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) и склеры за счет сокращения вокруг Зубчатый край иЗрительный нерв. Погружают в 4% параформальдегид в течение еще 30 мин, чтобы закрепить сетчатку и флуоресцентный белок в трансдуцированных клеток сетчатки (крепление не должна превышать 24 ч). Промыть 5 мин в стерильной PBS, рН 7,4.
- Изменение PBS в блокирующем буфере (PBS с 1% BSA, 2% нормальной козьей или осла сыворотки, 0,5% Тритон Х-100), и инкубируют в блокирующем буфере в течение либо 4 ч при комнатной температуре или температуре 4 ° С в течение ночи.
- Инкубируйте ткани с первичными антителами в блокирующем буфере в течение либо 4 ч при комнатной температуре или при 4 ° С в течение ночи. Промыть 3 раза ЗФР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти антитела используются следующим образом: анти-ламинин (1/1000) маркировки ILM, анти-родопсина клон 4D2 (1/500) маркировки стержней, анти-глутаминсинтетазы клон GS-6 (1/1500) маркировки Müller клетки , PNA Lectin (1/40) маркировки конусы. - Инкубируйте ткани с 1: 500 разбавлении Alexa Fluor сопряженных вторичными антителами в блокирующем буфере в течение 1 часа (криосрезах) или 2 часов (flatmounts) при комнатной Tempeратура и защищенном от света месте. Промыть 3 раза ЗФР.
- Сделайте разгрузочный сокращений сетчатки и flatmount это на предметное стекло либо с фоторецепторов или сетчатки ганглиозных клеток (РГК) стороной вверх. Добавить водного mountingmedium, применять покровное и хранят при 4 ° С.
- Выполните конфокальной микроскопии на лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Получение изображений последовательно, строка за строкой, чтобы уменьшить возбуждение и перекрестных помех излучения. Определить размер шага в соответствии с теоремой Найквиста-Шеннона. Используйте настройки экспозиции, которые минимизируют пересыщенных пикселей в финальных изображений. Процесс 12-битные изображения с Фиджи, Проект Z-секции на одной плоскости с использованием максимальной интенсивности в соответствии с функцией Z-проекта и, наконец, преобразовать в 8-битном RGB цветной режим.
4. ПЦР анализ для мыши проб крови
- Вводите 100 мкл семенного материала, содержащего от 1 до 4 х 10 11 частиц в AAV-GFP в половом члене вены под наркозом C57BL6J мышей (5% изофлюранадля индукции в тесном камерой и 2,5% изофлюрана через носовой обтекатель во время операции), используя инсулиновый шприц с ультратонкой 6 мм иглы. Это животное будет служить в качестве положительного контроля циркулирующих частиц AAV.
- Образец крови от хвоста мыши перед инъекцией и 3 часа, 24 ч, 2 дней, и через 3 дня после ShH10 инъекции в стекловидное тело или после intrapenile инъекции (Рисунок 1). Около 10-20 мкл собирают в пробирки с гепарином. Жертвоприношение мышей CO 2 ингаляции после завершения процедуры.
- Извлечение геномной ДНК из образцов крови с помощью экстракции комплект по вашему выбору.
- Выполнение ПЦР-амплификации геномной ДНК. Для этого протокола с помощью следующей пары праймеров: GFP, ощутить 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 ', 5'-антисмыслового CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3'. В следующей программе ПЦР проводили: 95 ° С 2 мин (1 цикл); 95 ° С 45 сек, 55 ° С 1 мин, 72 ° С 45 сек (30 циклов); 72 ° C 5 мин (1 цикл);4 ° C держать.
5. Дополнительно Evans Blue Метод
ПРИМЕЧАНИЕ: Количественная проницаемость сосудов путем измерения утечки альбумина из кровеносных сосудов в сетчатке с помощью синей метод Эванса 10.
- Подготовка Эванс синий краситель путем растворения в физиологическом растворе (6 мг / мл), ультразвуком в течение 5 мин в ультразвуковом очистителе, и фильтрации через фильтр 5 мкм.
- Обезболить мышей C57BL6J (ИФ ингаляции, см шаг 4,1), проверьте потерю рефлекса, вывод рефлекс и реакцию хвост щепотку, указывающий правильное обезболивания, и ввести Evans Blue (45 мг / кг) через полового члена вены (рис 1). Убедитесь, что лапы, морда, и уши мышей становиться понятно синий следующее Evans Blue инъекции, подтверждающие поглощение и распределение красителя.
- Обезболить мышам C57BL6J 3 ч после инъекции красителя с кетамином (50 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) и проверить потерю rightinг рефлекс указывает на правильное обезболивания. Пример внутрисердечно около 500 мкл крови в пробирки с гепарином и заливать мышей в течение 2 мин с помощью левого желудочка с цитратным буфером (0,05 М, рН 3,5; растворения 7,8 г лимонной кислоты и 3,8 г цитрата натрия в 1 л дистиллированной воды) предварительно нагревают до 37 ° С, чтобы предотвратить сужение кровеносных сосудов. Мышей умерщвляли через перфузии.
- После перфузии, выяснять и тщательно анализировать оба глаза под операционным микроскопом, чтобы собрать сетчатки (см раздел 3.2). Сухие сетчатки в центробежном испарителе в течение ночи, вес, и извлечь синий краситель Эванса путем инкубации сетчатки 100 мкл формамида в течение 18 часов при 65 ° C при встряхивании (100 XG). Центрифуга образцов сетчатки 30K омега труб фильтра на 20,798.5 мкг в течение 2 ч при 4 ° С и образцы центрифуги крови в 20,798.5 мкг в течение 15 мин при 4 ° С.
- Используйте оба супернатантами для измерения оптической плотности. Определить оптическую плотность каждого образца путем вычитания максимального поглощения FOR Эванс синий при 620 нм в минимумом поглощения 740 нм. Рассчитать Evans Blue концентрацию в плазме и сетчатки от стандартной кривой голубого Эванс в формамиде. Экспресс BRB проницаемость мкл голубого Эванс на грамм сухого сетчатки в час (мкл плазмы / г сухого веса сетчатки / ч).
6. Необязательно флуоресцентной ангиографии
Примечание: Утечка из кровеносных сосудов сетчатки у мышей могут быть визуализированы с помощью внутрибрюшинной инъекции флуоресцеина натрия.
- Обезболить мышей C57BL6J (ИФ ингаляции, см шаг 4,1) и расширяются зрачки с глазные капли (neosynephrine и mydriaticum). Используйте ветеринар мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
- Вводят внутрибрюшинно 0,01-0,02 мл 10% флуоресцеина натрия в 0,1 мл стерильного физиологического раствора для флуоресцентной ангиографии.
- Собирать изображения обоих глаз после инъекции с помощью глазного дна камеры. Жертвоприношение мышей СО 2 ингаляции после пропроцедуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: 20 сек необходимы для сосудов сетчатки, чтобы стать видимым на ангиографии. Картинки должны быть захвачены между 3-10 мин Максимальное после флуоресцеина инъекции. Пятна утечки (если имеется) наблюдаются через 2,5 мин. На более поздних временных точках теряется качество изображения из-за флуоресцеина натрия диффундировать в стекловидное тело, таким образом, только изображений, вскоре после того, как полученные используются для анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы приведет к росту сетчатки трансдукцию Мюллера глиальных клеток с использованием ShH10 если модель животного показывает возмущения в структуре ILM (фиг.2А - B). Например, мы показали, что в отсутствие Dp71, цели ShH10 специально, но более эффективно Мюллер глиальных клеток по инъекции в стекловидное тело, что свидетельствует о повышении проницаемости ILM в этом мыши линии по сравнению с мышами дикого типа 16 (рис 2С - F).
AAV5 также может быть использован в качестве индикатора ILM проницаемости. AAV5, неэффективным путем инъекции в стекловидное тело у мышей дикого типа, становится сильно эффективны в доставке генов в фоторецепторов у мышей с ослабленной сетчатки барьеров, таких как Dp71-нулевых мышей 16 или в других сетчатки дегенерации 22 (фиг 2G - H). Это еще раз подтверждает ILM дезорганизацию и потенциальных увели проницаемостие в внеклеточного матрикса, окружающего нейронов сетчатки.
Мы обнаружили, что BRB разбивка Dp71-нулевых мышей остается селективный по отношению к AAV частиц, так как никаких следов AAV не были обнаружены в пробах крови в стекловидное тело вводят Dp71-нулевых мышей 16 (рисунок 3).
Рисунок 1:. Схематическое представление общей методике После производства AAV, частицы вводят в стекловидное тело или в вену пениса анестезированных взрослых мышей. Глазного дна изображений с Micron III камеры выполнены, чтобы следить за выражение GFP. Паттерн экспрессии GFP анализируют на сетчатке криосрезов и flatmounted сетчатки благодаря иммуногистохимии и конфокальной изображений. AAV проход через BRB оценивается путем анализа ПЦР на образцах крови, поступающих из стекловидное тело или intrapenially вводили мышам, яп для того, чтобы обнаружить присутствие последовательности GFP, индикатор AAV частиц присутствие в кровоток.
Рисунок 2: ILM проницаемость для AAV трансдукции Конфокальные изображения flatmounted дикого типа и Dp71-нулевых сетчатки, помеченный пан-ламининовым антитела (A, B). (Масштаб бар: 50 мкм). Глазного дна изображения, показывающие GFP выражение (C, D). Flatmounted сетчатки через один месяц после ShH10-GFP инъекции в стекловидное тело (E, F). Трехмерное восстановление (Е *) зону, обозначенную звездочкой в E показа трансдуцировали Мюллера глиальных клеток в зеленый и астроциты в красном (анти-GFAP антител). Flatmounted сетчатки через один месяц после инъекции в AAV5-GFP (G, H) (масштаб бар: 500 мкм). Конфокальной образ зону, обозначенную звездочкой в H, показывая трансдуцированные фоторецепторы в зеленых и конических наружных сегментов в красном (окрашивание лектина PNA) (H *). Левая колонка показывает результаты сетчатки мыши дикого типа и средний столбец показывает результаты Dp71-нулевых сетчатки мыши. Схема (I) представляет AAV трансдукции сетчатки с ослабленной барьеров, как Dp71-нуль сетчатки, через стекловидного тела. Сокращения: резюме, сосудистой оболочки сосудов; НПП, пигментный эпителий сетчатки; ФР, клетки фоторецепторов (палочки и колбочки); MGC, Müller глиальные клетки; HC, горизонтальные клетки; До н.э., биполярные клетки; AC, амакринные клетки; М, микроглии; EC, эндотелиальные клетки; P, перициты; GC, ганглиозные клетки; Астроциты; ILM, Внутренняя пограничная мембрана; V, стекловидное; AAV, вирус аденоассоциированный. (Повторная печать с разрешением от Вакка и др., Глии (2013) 16, # 3483740951391).
tp_upload / 52451 / 52451fig3.jpg "/>
Рисунок 3: BRB проницаемость для AAV частиц ПЦР-амплификация GFP трансгена, извлеченной из образцов крови мыши.. Мышей либо инъецируют в стекловидное тело (IVT) с ShH10-GFP или intrapenially (IP) с AAV-GFP в различные моменты времени после инъекции. Lane 5-18, нечетные номера для мышей дикого типа и четных чисел для Dp71-нулевых мышей; дорожка 2, 1 нг AAV плазмиды, PTR-SB-smCBA-hGFP; дорожка 3, вода; Дорожки 5-6, ДНК крови перед инъекцией; полосы 7-8, 3 ч после IVT; полосы 9-10, 24 ч после IVT; полосы 11-12, 24 часа в сутки после IP; полосы 13-14, 48 ч после IVT; полосы 15-16, 48 ч после IP; полосы 17-18, 72 ч после IVT; Дорожки 19-20, 72 ч после IP. Полосы 1 и 4, Invitrogen шкале лестницы (100 п.н.): 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1500, 2000, 3000 п.о.. (Re-печати с разрешения Вакка и др., Глии (2013) 16, # 3483740951391).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BRB регулирует обмен молекулами между кровью и сетчаткой. Его пробой, связанный с различными заболеваниями, такими как диабетическая ретинопатия или возрастной макулярной дегенерации (ВМД). Мы недавно показали, что в дистрофина нокаут-мыши, который отображает проницаемой BRB, сетчатка становится более снисходительными к доставке гена, опосредованного аденосателлитные вирусных векторов (AAV). Тем не менее, несмотря на BRB частиц проницаемость AAV впрыском внутриглазным оставаться ограничивается глазного отделения в этой модели. Наши результаты показывают, что генная терапия для болезней, которые отображают проницаемой BRB не представляет дополнительные риски системных побочных эффектов. Кроме того, они подтверждают тот факт, что другие барьеры, такие как ILM будет скомпрометирован в течение заболевания сетчатки, позволяющей улучшить доступ к вирусных частиц. Наши данные позволяют нам думать, что гены, кодирующие AAV репортер отличным инструментом для изучения Brb проницаемость и целостность ILM на животных моделях болезни сетчатки. Particuбенно, AAV вариант ShH10, которые специфически этикетки Müller глии может быть использован в качестве инструмента для разметки сетчатки глии и отчет о состоянии сетчатки в ответ на болезни. ShH10 будет выборочно пометить Клетки Мюллера как у здоровых и больных сетчатки. Тем не менее, как ShH10 и другие AAVs обеспечит более эффективную доставку генов в сетчатке с нарушенной барьеров.
Некоторые важные шаги в применении вышеописанные протоколы (1) разработка ловкости рук, чтобы выполнить безопасный инъекции в стекловидное тело, и (2) надлежащим фиксации ткани до и после вскрытия. При изучении сетчатки барьеры, инъекция должна быть хорошо выполнен, что это - не касаясь объектив или сетчатки. Повреждение объектив или отсоединения сетчатки влияет на проницаемость 23,24 Brb. Кроме того повреждение объектива препятствует изображений глазного дна. Прикосновение к сетчатку может привести к разрыву ILM и повредить структуры сетчатки. Чтобы избежать прикосновения сетчатку, ExperiМентер следует соблюдать кончик шприца Гамильтона в середине полость стекловидного тела, в передней части сетчатки. Нетоксичный краситель может быть включен (такие как фенол красный или флуоресцеина) в вирусном растворе, чтобы помочь в наблюдении за инъекции жидкости в стекловидное тело. Повреждение сетчатки могут быть легко наблюдать во время съемки глазного дна в соответствии с процедурой инъекции. Еще одним важным шагом является фиксация ткани после достаточные уровни экспрессии были достигнуты. После энуклеации глаза необходимо немедленно погружали в буфер и фиксирующего до тканей проницаемости второго крепление необходимо для того, чтобы предотвратить утечку GFP. Это может быть полезно для разрезания роговицы перед погружением весь глаз в фиксатора - это даст Fixative шанс проникать в стекловидное тело. Этот шаг может увеличить общую стабильность ткани.
Наконец, важно также, чтобы придать достаточное количество частиц AAV для трансдукции эффективно сетчатки и наблюдать GFP напрбандажа на глазного дна изображений. Оптимальное количество AAV частиц составляет около 10 10 -10 11 В. каждого глаза, ниже 10 10 частиц выражение GFP не всегда наблюдаемых изображений глазного дна.
Эта техника не даст возможность непосредственно наблюдать за ILM или сосудистую по дну BRB. Однако он предоставляет возможность для изучения сетчатки барьеров и их модификации в болезненных состояний, в пути, который был ранее невозможна без использования Evans Blue анализа и флуоресцентной ангиографии. Использование AAVs с определенными свойствами сетчатки трансдукции, можно получить лучшее понимание состояния сетчатки по отношению к глиальных клеток, их внеклеточного матрикса и ILM. После освоения этой техники, можно проверить эффективность терапевтических стратегий и их влияние на BRB и сетчатки проницаемость и перейти к более глубокому пониманию прогрессирования заболевания и возможность восстановить нормальные условия после лечения яна мышиную модель болезни сетчатки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0.5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight - 8.5 cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| curved Vanna scissor | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
