Abstract
انخفاض تدفق دم الحبل الشوكي (SCBF) (أي نقص التروية) يلعب دورا رئيسيا في إصابات الحبل الشوكي (النخاع الشوكي) الفيزيولوجيا المرضية وفقا لذلك هو هدف هام للعلاجات اعصاب. على الرغم من أن العديد من التقنيات تم وصفها لتقييم SCBF، لديهم كل قيود كبيرة. للتغلب على هذه الأخيرة، نقترح الاستفادة من الوقت الحقيقي التصوير النقيض المحسن الموجات فوق الصوتية (سي إي يو). نحن هنا وصف تطبيق هذه التقنية في نموذج كدمة الفئران اصابات النخاع الشوكي. يتم زرع قسطرة الوريد أول لحقن متكررة من وكيل النقيض من ذلك، محلول كلوريد الصوديوم من سادس فلوريد الكبريت microbubbles مغلفة. ثم استقرت في العمود الفقري مع العرف 3D الإطار ويتعرض العمود الفقري الجافية الحبل الأم من قبل الثقب في ThIX-ThXII. ثم يتم وضع مسبار الموجات فوق الصوتية في الجانب الخلفي من الأم الجافية (المغلفة مع هلام الموجات فوق الصوتية). لتقييم SCBF خط الأساس، والحقن في الوريد واحد (400 ميكرولتر) من كونترايتم تطبيق عامل الواحد لتسجيل مرور من خلال الأوعية الدموية الدقيقة الحبل الشوكي سليمة. ويستخدم الجهاز الوزن الإفلات في وقت لاحق لتوليد نموذج كدمة التجريبية استنساخه من اصابات النخاع الشوكي. وكيل النقيض إعادة حقن 15 دقيقة بعد اصابة لتقييم التغيرات في الوظائف-SCI SCBF. CEU يسمح في الوقت الحقيقي وداخل الجسم الحي تقييم التغيرات SCBF التالية اصابات النخاع الشوكي. في الحيوان لم يصب، وأظهر التصوير بالموجات فوق الصوتية تدفق الدم متفاوتة على طول الحبل الشوكي سليمة. وعلاوة على ذلك، لمدة 15 دقيقة بعد اصابات النخاع الشوكي، كان هناك نقص التروية حاسما على مستوى مركز الزلزال في حين SCBF ظلت محفوظة في أكثر المناطق النائية سليمة. في المناطق المتاخمة للمركز (سواء منقاري والذيلية)، تم تخفيض SCBF بشكل كبير. هذا يتوافق مع سبق وصفها "منطقة شبه الظل الدماغية". هذه الأداة هي ذات الأهمية الرئيسية لتقييم آثار العلاجات التي تهدف إلى الحد من نقص التروية وما ينجم عنها من نخر الأنسجة لاحق لاصابات النخاع الشوكي.
Introduction
إصابة الحبل الشوكي الصدمة (SCI) هو شرط مدمرة مما أدى إلى انخفاض كبير في السيارات، والحسية وظائف مستقلة. حتى الآن، وقد أثبت العلاج لا كفاءته في المرضى. لهذا السبب، من المهم للتعرف على تقنيات جديدة من شأنها تحسين تقييم العلاجات المحتملة ويمكن أن يزيد من توضيح الاصابة pathiophysiology 1.
وينقسم إلى قسمين SCI مراحل متتابعة، ويشار إلى الإصابات الأولية باعتبارها والثانوية. الإصابة الأولية يناظر إهانة الميكانيكية الأولية. في حين أن الجماعات الإصابات الثانوية سلسلة من الأحداث البيولوجية المختلفة (مثل التهاب، الاكسدة ونقص الأكسجين) التي ستؤدي إلى زيادة التوسع التدريجي من الآفة الأولية، تلف الأنسجة العصبية، وبالتالي العجز 2،3.
في المرحلة الحادة من اصابات النخاع الشوكي، وتهدف علاجات اعصاب في الحد من أمراض الإصابة الثانوية والمعدات اولد وفقا لتحسين النتائج العصبية. من بين العديد من الأحداث الإصابات الثانوية، نقص تروية يلعب دورا حاسما 4،5. على مستوى مركز الزلزال SCI، وmicrovessels متني أضرار تعوق تدفق دم الحبل الشوكي الفعال (SCBF). وعلاوة على ذلك، تم أيضا تخفيض SCBF بشكل كبير في المنطقة المحيطة بؤرة الإصابة، وهي منطقة معروفة على وجه التحديد باعتبارها "منطقة شبه الظل الدماغية". إذا SCBF لا يمكن استعادتها بسرعة في هذه المناطق، ويمكن أن يؤدي إلى نقص تروية نخر متني التكميلي وتلف الأنسجة مزيد العصبي. حتى أدنى حفظ الأنسجة يمكن أن يكون لها آثار كبيرة من وظيفة، فإنه من مصلحة كبرى لتطوير العقاقير والعلاجات التي يمكن أن تقلل من نقص التروية بعد اصابات النخاع الشوكي. لتسليط الضوء على هذه الظاهرة، وقد أظهرت الأعمال السابقة أن الحفاظ على 10٪ فقط من myelinated محاور عصبية كان كافيا للسماح المشي في القطط بعد SCI 6.
على الرغم من أن العديد من التقنيات تم وصفها لتقييم SCBF، لذ جميعا قيود كبيرة. على سبيل المثال، استخدام المجهرية المشعة 7،8 و C14-iodopyrine تصوير الإشعاع الذاتي 9 يتطلب التضحية بالحيوانات اللاحقة، ولا يمكن أن تتكرر في وقت لاحق نقاط الوقت. تقنية إزالة الهيدروجين 10 تعتمد على إدخال أقطاب كهربائية داخل النخاع، وهو ما يمكن أن يؤدي إلى تلف الحبل الشوكي. بينما التصوير دوبلر الليزر، photoplethysmography 14،15 وداخل الجسم الحي المجهر الضوئي 16 ديهم عمق / منطقة محدودة جدا من قياس 11-13.
فريقنا وقد أظهرت سابقا على النقيض من ذلك تعزيز الموجات فوق الصوتية (سي إي يو) التصوير يمكن استخدامها لتقييم الوقت الحقيقي، وداخل الجسم الحي التغييرات SCBF في لحمة الفئران الحبل الشوكي 17. من المهم أن نلاحظ أن تقنية مماثلة تم تطبيقها من قبل هوانغ آخرون في نموذج الخنازير من SCI 18. CEU ينطبق على وضع معين من التصوير بالموجات فوق الصوتية والذي يسمح للربط الرمادي ايم الصرفيالأعمار (التي حصل عليها التقليدي B-اسطة) مع التوزيع المكاني للتدفق الدم 19. التصوير SCBF النوعي والكمي يعتمد على حقن داخل الأوعية الدموية وكلاء صدى التباين. ويتكون عامل تباين تصل من microbubbles سادس فلوريد الكبريت (يعني قطرها حوالي 2.5 ميكرون و 90٪ التي يبلغ قطرها أقل من 6 ميكرون) استقرت الفوسفاتية. وmicrobubbles تعكس شعاع الموجات فوق الصوتية المنبعثة من التحقيق مما يعزز echogenicity الدم والتباين المتزايد للأنسجة وفقا لتدفق الدم لديهم. ولذلك فمن الممكن لتقييم تدفق الدم في منطقة معينة من الفائدة وفقا لشدة الإشارة المنعكسة. وmicrobubbles هي أيضا آمنة وأن تم تطبيقها سريريا في البشر. تم مسح سادس فلوريد الكبريت بسرعة (يعني محطة نصف العمر هو 12 دقيقة) ويتم استرداد أكثر من 80٪ من سادس فلوريد الكبريت تدار في هواء الزفير في غضون 2 دقيقة بعد الحقن. يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة لاستخدام CEU ايمالشيخوخة لتقييم التغيرات SCBF في الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على الطرق الموضحة في هذه المخطوطة من قبل لجنة أخلاقيات علم الأحياء في كلية Lariboisière الطب، باريس، فرنسا (CEEALV / 2011-08-01).
1. أداة إعداد
- تحضير وتنظيف الأدوات التالية لإدخال القسطرة: ملقط الصغرى، مقص الصغرى، المشبك الأوعية الدموية الدقيقة، مقص كبير، موضوع الجراحية (أسود مضفر الحرير 4-0) والقسطرة 14 G. يعالج بالهيبارين القسطرة مع الحل الهيبارين (5000 U / مل).
- تحضير وتنظيف الأدوات التالية لالثقب: مقص كبير، مشرط، وقطع العظام. أداء الثقب مع قطع العظام حسب الطلب تهدف للحد من مخاطر الإضرار الحبل الشوكي خلال الثقب (الشكل 1).
- انشاء و3D الإطار يستخدم لتحديد المواقع والاستقرار للحيوان. هو مبني على إطار حسب الطلب مع عناصر المثبتة الخارجية هوفمان 3 بالتعاون مع ملقط، حركتيوقد منحني ساعة وذلك لتناسب العمود الفقري القطني من الحيوان.
- تحضير الجهاز الوزن الإفلات (المسبار) تستخدم لالنخاع الشوكي إصابة النشاط الحيوي.
ملاحظة: تم تصميم الجهاز الانحشار حسب الطلب مع برنامج 3D وطبع في 3D. - بدوره على جهاز الموجات فوق الصوتية.
- إعداد العدة لإعادة تشكيل وكيل التباين.
ملاحظة: وتشمل هذه المجموعة 1 قارورة تحتوي على 25 ملغ من مسحوق lyophilised، مملوءة مسبقا 1 حقنة تحتوي على 5 مل كلوريد الصوديوم واحد ونظام نقل مصغرة ارتفاع (الشكل 2). وفيما يلي تفصيل الخطوات لإعادة تشكيل عامل تباين فيما يلي (المادة 5).
2. قسطرة الوريد الوداجي (الشكل 3)
- تخدير الحيوان مع 4٪ الأيزوفلورين. وضع الحيوان في موقف ضعيف. تأكيد التخدير المناسبة من خلال ضمان أن الحيوان لا يستجيب عندما يتم مقروص الكفوف مع ملقط. تطبيق مرهم التعليم والتدريب المهني في العيون لمنع جفاف بينما اوندالتخدير إيه.
- حلق الرقبة وتنظيف البشرة. إجراء شق في خط الوسط من الرقبة. سحب العضلات sternocleidomastoidian من أجل العثور على الوريد الوداجي الداخلي. تشديد رباط في الجزء منقاري من الوريد.
- تطبيق المشبك الاوعية الدموية الدقيقة في الوريد، 1 سم تحت ربطة. تمرير موضوع آخر حول الوريد، أقل بقليل من المشبك مع عقدة على استعداد ليكون تشديد عندما يتم تحرير المشبك.
- فتح جدار الوريد (فصد) بين الشبك وربطة منقاري. إدخال 14 G قسطرة في تجويف الوريد ودفعها نحو القلب.
- عندما يتعلق الأمر ضد المشبك، والإفراج عن الأخير، ودفع القسطرة أبعد من ذلك. تأمين القسطرة في الوريد، من خلال تشديد بحزم عقدة على المنوال مع القسطرة داخل.
- تقييم المباح من القسطرة عن طريق سحب كمية صغيرة من الدم الوريدي في القسطرة، وبعد ذلك ثم شطف مع المياه المالحة heparinized. هذا يمنع انسداد جatheter عن تجلط الدم المحتملة.
- توصيل أنابيب مرنة لالقسطرة لمزيد من حقن عامل تباين (microbubbles). ابقائه مغلقا (مختومة) لتصبح جاهزة للاستخدام.
3. الوصول إلى العمود الفقري، استئصال الصفيحه والجرذ تحديد المواقع (في 3D الإطار)
- وضع الحيوان في وضع أفقي عرضة شقة. حلاقة وتنظيف الظهر (المنطقة الصدرية) من الحيوان.
- تحديد الضلع الأخير (الثالث عشر في الفئران) عن طريق الجس (الشكل 4). هذا يسمح احد لتقدير موقع الفقرات الصدرية الثالث عشر (ThXIII).
- جعل شق الجلد 4 سم على خط الوسط، تركزت على ThXIII. فتح شق الجلد وكذلك الجراب الأساسي. مراقبة صفاق من عضلات الظهر وكذلك نصائح للعمليات العمود الفقري العمود الفقري.
- حصر دقيق لعملية العمود الفقري من ThXIII والتلمس الأضلاع الثالث عشر.
ملاحظة: يتم توصيل الضلع الثالث عشر لThXIII وبالتالي تمثل وسيلة سهلة لالمحلىمعلما التشريحية الشركة المصرية للاتصالات لتحديد ThXIII. هذه الخطوة تمكن توطين ThXII إلى ThIX العملية الشائكة وكذلك L1 و L2 (الأول والفقرات القطنية الثانية). - قطع صفاق العضلات وفصل العضلات على جانبي لفضح عمليات الشائكة، وlaminas ومفاصل من ThIX لL2. فضح النواحي الجانبية لL1 و L2 من قبل فصل العضلات من العمليات العرضية.
- ربط الأسنان القاطعة الحيوان على 3D الإطار لتأمين موقف (الشكل 5). المشبك L1 و L2 فقرات مع ملقط تعديلها. قم بتوصيل ملقط المعدلة إلى 3D الإطار من أجل تحقيق الاستقرار الحيوان.
- برفق caudally ملقط عقد العمود الفقري القطني من أجل تشديد العمود الفقري كله ورفع الصدر من على مقاعد البدلاء.
ملاحظة: مع ترتيب صفها الحيوان يجب أن تكون قادرة على التنفس. وعلاوة على ذلك، على الرغم من الحركات التنفسية من القفص الصدري، والعمود الفقري والنخاع الشوكيوينبغي أيضا أن يظل الحبل متحرك. - إزالة العمليات التي الشائكة من ThIX إلى ThXII. إدراج بلطف شفرة أدنى من قطع العظام تحت الصفيحة تبقى من ThXII ثم قم بإغلاق قطع العظام من أجل خفض الصفيحة (الشكل 6).
- تكرار نفس مناورة للالصفيحة اليمنى وتباعا إزالة القوس الخلفي. كرر الخطوات السابقة لThXI فقرات لThIX من أجل تحقيق الثقب أربعة مستويات. إزالة كل مفاصل لكل فقرة.
ملاحظة: في جميع أنحاء الداخلي، وتنظيف حقل من المنطوق من نزيف المحلي. لذلك، استخدم قطعة قطن والري بمحلول ملحي فاتر. يحدث الارقاء منهجي في غضون دقائق.
4. CEU التحقيق لتحديد المواقع
- تغطية جافية مع هلام الموجات فوق الصوتية. وهذا يسمح نقل الفعال للموجات فوق الصوتية بين التحقيق والحبل الشوكي (الشكل 7).
- استقرار الطرافة مسبار الموجات فوق الصوتيةالمشبك هكتار التي يمكن توصيلها لاحقا إلى 3D الإطار بواسطة ذراع صوتها. وضع مسبار يدويا. تأكد من أن يتم توجيه التحقيق إلى الحصول على شريحة السهمي طولية مائلة. في الموضع الصحيح، والحبل الشوكي هو الأفقي بدقة على الصورة والقناة المركزية للحبل الشوكي مرئيا على طول الجزء الكامل من الحبل الشوكي.
وينبغي أن يسترشد تحديد المواقع عن طريق الوقت الحقيقي صورة B-وضع المعروضة على الشاشة لجهاز الموجات فوق الصوتية: ملاحظة. ينبغي مواءمة المسافة البؤرية للمسبار الموجات فوق الصوتية مع القناة المركزية للحبل الشوكي. في هذا الوقت، والجانب الخلفي من الحبل الشوكي يمكن الوصول إليها والتي سوف تسمح في نهاية المطاف لتحديد المواقع من المسبار. - عندما الأمثل، وقفل ذراع صوتها لتحقيق الاستقرار في الموقف.
5. إعداد وكيل التباين - Microbubble إعادة إعماره
- باستخدام محتويات مجموعة إعادة التجارية وربط قضيب المكبس بواسطة الربط من القصباتhtly إلى حقنة (عقارب الساعة). فتح نفطة نظام نقل وإزالة الغطاء حقنة طرف. فتح غطاء نظام نقل وتوصيل حقنة لنظام نقل (ربط بإحكام).
- إزالة القرص واقية من القارورة. حرك القنينة في الأكمام شفافة لل
- نظام نقل واضغط بشدة لقفل القارورة في مكان.
- إفراغ محتويات حقنة في قارورة بالضغط على قضيب المكبس. هزة بقوة لمدة 20 ثانية لخلط جميع محتويات القارورة للحصول على السائل متجانس أبيض حليبي.
- عكس النظام وسحب بعناية عامل تباين في حقنة. فك حقنة من نظام النقل. بعد إعادة (وفقا لتوجيهات)، 1 مل من التشتت الناتج يحتوي على 8 ميكرولتر سادس فلوريد الكبريت في microbubbles. رسم تعليق microbubbles إلى حقنة 100 مل. إدراج الحقنة 100 مل في مضخة كهربائية. إغلاق الغطاء.
- بدء التحريض المستمر للإعادةmicrobubbles المنشأة. الحصول على التحريض المستمر من قبل بطء دوران الحقنة، الذي يحافظ على تعليق microbubble. توصيل مضخة لقسطرة الوريد من خلال أنابيب مرنة. تعيين جهاز الموجات فوق الصوتية إلى "وضع متناسق".
ملاحظة: يتطابق الأخيرة إلى وضع فيها microbubbles يمكن الكشف على وجه التحديد وتصور. هذا واسطة لديه مؤشر الميكانيكية المنخفض، الذي لا يدمر microbubbles بدلا من B-الوضع. - تطهير القسطرة عن طريق غرس جرعة الأولى (400 ميكرولتر) من وكيل التباين. خلال هذا التسريب الأول، تأكد من أن microbubbles لا تظهر على الشاشة الموجات فوق الصوتية. هذا يؤكد أن الدائرة الكاملة (من الحقنة إلى مجرى الدم في الفئران) سليمة ومفتوحة.
- تعيين جهاز الموجات فوق الصوتية إلى "B-وضع" تصور لحمة الحبل الشوكي وتدمير عدد قليل من microbubbles المتبقية في مجرى الدم. وتيرة عالية من "B-الوضع" ترانالطاقة العالية SMITS إلى microbubbles، والتي تمكنهم من الانهيار.
- السماح للحيوان يكمن يزال ما يقرب من 30 دقيقة. هذه الفترة يسمح للاستقرار المعلمات الديناميكية الدموية.
6. تقييم SCBF في الحبل الشوكي سليمة
- تعيين جهاز الموجات فوق الصوتية إلى "وضع متناسق". تبدأ في وقت واحد (1) ضخ عامل تباين (400 ميكرولتر) و (2) الكرونومتر.
ملاحظة: خلال التسريب، يجب تركيز microbubbles في مجرى الدم زيادة، مما يمكن تخيل النقيض من الحبل الشوكي (الشكل 8). منذ يتم تدمير microbubbles بسرعة، وتركيز الدم من microbubbles يبدأ التناقص بمجرد الانتهاء من الحقن التي تولد انخفاض تدريجي في التصور النقيض من الحبل الشوكي. - بعد 1 دقيقة، حدد (اضغط) على زر "كليب مخزن" على جهاز الموجات فوق الصوتية. وسيمكن هذا واحد لإنقاذ 1 دقيقة من صفصيل عبد الواحد بيانات الموجات فوق الصوتية والفيديو والتصوير تسجيل (التي تم عرضها سابقا على الشاشة الموجات فوق الصوتية).
- تعيين جهاز الموجات فوق الصوتية إلى "B-الوضع". هذا سيقضي على microbubbles المتبقية.
7. التجريبية SCI
- باستخدام micromanipulator متصلة 3D الإطار، وضع الجهاز الوزن الإفلات الانحشار بحيث غيض من المسبار يأتي في اتصال مع الأم الجافية (على خط الوسط الحبل الشوكي)، عند تقاطع بين THX وThXI (الشكل 9) .
ملاحظة: هذا المستوى يجب أن تتوافق مع منتصف هذا الجزء من الحبل الشوكي لوحظ مع جهاز الموجات فوق الصوتية. مهاجم وجسم المسبار عدد 8 ملم في القطر. غيض من المسبار، الذي سيولد من الاصابة، هو 3 مم في القطر. - وضع المهاجم الجهاز الانحشار في موقف 10 سم ارتفاع. حمل SCI التجريبية عن طريق الإفراج عن المهاجم الجهاز الانحشار. يقع المهاجم والنشرات عشرالبريد المسبار، مما أدى إلى إصابة الحبل الشوكي. والانحشار العرف يسلم انخفضت ما يعادل تأثير على 10 غرام من الوزن من على ارتفاع 10 سم.
8. تقييم SCBF 5 دقائق بعد SCI
- كرر الخطوات الموضحة في قسم 6 (تقييم SCBF). لن تكون قادرة على تمرير من خلال الأوعية الدموية الدقيقة التالفة وبؤرة إصابة ستبقى الظلام (الشكل 10) وmicrobubbles.
9. التضحيات الحيوانية
- الموت ببطء الحيوان مع حقنة قاتلة داخل الصفاق من بنتوباربيتال (100 ملغ).
10. الكمي لSCBF بواسطة تحليل غير متصل
- بدء تشغيل فائقة توسيع البرمجيات المستخدمة لتقدير (على جهاز الموجات فوق الصوتية). حدد "ملف" ثم حدد البيانات الخام التي تم حفظها سابقا وفتح الملفات المرتبطة بها. تفعيل "واسطة الكمي" عن طريق الضغط على (اختيار) زر "تشي Q". سيليط "مجموعة ROI" (زر) واختيار الشكل الدائري.
- حدد "رسم ROI" (زر) ورسم سبع مناطق دائرية المجاورة ذات الاهتمام (ROI) على الحبل الشوكي (الشكل 11). فتح القائمة "تركيب" واختيار وظيفة "قيمة المنحنى". مراقبة البرامج التي تظهر منحنيات عدة، كل المقابلة للتغيرات التركيز microbubbles داخل ROI.
ملاحظة: كل منحنى لديه "نضح-deperfusion" لمحة. المرحلة الأولى من منحنى مسطح ويتوافق مع فترة ما قبل وصول microbubbles. في المرحلة الثانية، وتركيز microbubbles يزيد بسرعة نتيجة التسريب. في المرحلة الثالثة، التي تبدأ عند التسريب هو الكامل، وتركيز microbubbles يتناقص تدريجيا لأنها disintegratse في مجرى الدم. - وضع أول خط عمودي في بداية المرحلة الثانية من جايرفى وحدد "SET". هذا بإعلام البرنامج من أين نبدأ التحليل.
- ضع خط عمودي الثاني في نهاية التسجيل، ومرة أخرى حدد "SET". هذا بإعلام البرنامج حيث لوقف التحليل.
- نظرة على القائمة "السيرة الذاتية" وسجل "AUC" القيمة، والتي تتطابق مع "المنطقة تحت المنحنى" تحليلها. هذه القيمة تتناسب مع SCBF داخل ROI المقابلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مع بروتوكول المذكورة أعلاه، فمن الممكن لتعيين SCBF على طول الحبل الشوكي الجزء سهمي الطولي.
في الحبل الشوكي سليمة، يبدو أن هناك مخالفات SCBF داخل لحمة (الشكل 12). ويمكن تفسير ذلك من خلال توزيع متغير الشرايين-radiculo النخاعية (RMA) من حيوان واحد إلى آخر. RMA يشير إلى قطعي الشرايين التي تصل إلى الشريان الفقري الأمامي (ASA)، وبالتالي توفير إمدادات الدم في لحمة الحبل الشوكي. في المقابل، فإن الشرايين الجذرية تتوافق مع قطعي الشرايين، والتي لا تصل إلى ASA وبالتالي لا توفر الشوكي إمدادات دم الحبل السري. لذلك، في قطاعات الحبل الشوكي حيث anastomoses الجيش الملكي المغربي مع ASA، هناك المزيد من تدفق الدم (كما هو موضح في نتائجنا).
بعد اصابات النخاع الشوكي، ويظهر في الوقت الحقيقي التصوير CEU نقص في الدورة الدموية في بؤرة الإصابة. تظل بؤرة الظلام (لم النقيض إشارة الوكيل)،حيث لا يوجد تدفق الدم نشطة. ويظهر تحليل أكثر تفصيلا من تدفق الدم باستخدام عدة رويس ثلاثة أقاليم فريدة من تدفق الدم. أولا، على مستوى مركز الزلزال، تدفق الدم هو أدنى مع انخفاض متوسط حوالي -90٪. ثانيا، في الأراضي المجاورة لمركز الزلزال (سواء منقاري والذيلية)، وأيضا انخفض بشكل ملحوظ SCBF (تتراوح ما بين -50٪ إلى -80٪). ثالثا، في المناطق النائية المقابلة لأنسجة سليمة، هو الحفاظ SCBF. يتوافق المنطقة الثانية إلى "منطقة شبه الظل الدماغية"، التي ينبغي أن تكون هدفا للعلاجات اعصاب المحتملة. أن تكون قادرة على تصور بسهولة وتحديد SCBF يتغير بعد إصابة الحبل الشوكي مفيد لتقييم كفاءة العلاجات التي تهدف إلى الحد من نقص تروية الأنسجة، وبالتالي تبرز أهمية هذه التقنية (الشكل 13).
الشكل 2. تمثيل تخطيطي لعدة لإعادة microbubbles وVueject ° مضخة تستخدم لmicrobubbles الحقن في الوريد. يسمح نظام نقل لإيصال microbubbles والمالحة بين القارورة والمحقنة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الوداجي القسطرة. القسطرة هي التي ستدرج لاحقا في الوريد الوداجي، ثم دفعت في اتجاه القلب، وربط في نهاية المطاف مع عقدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. طريقة لتحديد الصحيح من المستويات الفقري. في الفئران، ويرد الضلع الأخير للفقرة الثالث عشر. هذا الأخير يمكن متلمس من خلال الجلد كمعلم للفقرة الصدرية الماضية، والثالث عشر. يتم فصل العضلات على جانبي العمليات الشائكة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الصفحة = "دائما"> 
الرقم 5. تحقيق الاستقرار للحيوان في 3D الإطار. (1) يتم التوصيل الأسنان القاطعة على الإطار في حين فرضت على فقرات القطنية الأولى والثانية (L1 و L2) مع ملقط حسب الطلب. (2) وشددت العمود الفقري القطني قليلا التي تستقر الحيوان ويرفع الصدر من على مقاعد البدلاء، مما يسمح الاقتراحات الجهاز التنفسي الحرة دون حركات العمود الفقري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. التفاصيل الفنية من الثقب. أولا، يتم تمرير شفرة رقيقة من قطع العظام حسب الطلب تحت الصفيحة دون الإضرار الحبل الشوكي. ثم يتم إغلاق القاطع العظام، والتي جUTS ويزيل جزء من الصفيحة. ويتكرر هذا الإجراء على كلا الجانبين ومن ThXII إلى TxIX من أجل تحقيق الثقب أربعة مستويات. أخيرا، هي أيضا إزالة مفاصل. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. تحديد المواقع للمسبار الموجات فوق الصوتية وجهاز الانحشار. وهذا التحقيق هو مواز إلى الحبل الشوكي ومنحرف قليلا (20-30 درجة)، بحيث يمكن وضعها في الوزن انخفاض المسبار على الجانب الخلفي من الجافية. يجب أن يكون الحبل الشوكي وضوحا مع الحاضر القناة المركزية في جميع أنحاء الجزء الأوسط على التصوير بالموجات فوق الصوتية "B-الوضع". اضغط هنا لعرضنسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 8. على النقيض من التصوير من الحبل الشوكي سليمة. وتشير الأرقام المتعاقبة في وضع التباين (الصور الملونة البرتقالية) كيف عامل تباين (microbubbles) يظهر تدريجيا بعد التسريب، وبالتالي تعزيز النقيض من الحبل الشوكي. البلعة ضخ تستمر حوالي 10 ثانية وسجلت البيانات المقابل لمدة 1 دقيقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تظهر الآفة مفرط الصدى الرقم 9. تغييرات في B-وضع التالية تجريبي اصابات النخاع الشوكي. داخل لحمة، والمقابلة لمتني ح الأولية emorrhage بعد اصابات النخاع الشوكي. الأنسجة (H & E تلطيخ): النتائج نزيف من اضطراب الصدمة هائلة من الأوعية الدموية الصغيرة مما يؤدي إلى تسرب الدم في لحمة (مقياس الأصفر بار = 2000 ميكرون). يظهر الجهاز الانحشار على اليمين. تم الافراج عن مهاجم من ارتفاع 10 سم ويصطدم مع المسبار الذي يولد في وقت لاحق إصابة الحبل الشوكي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 10. التصوير التباين 15 دقيقة بعد اصابات النخاع الشوكي. مشابهة للشكل 8، وmicrobubbles مرئية لأنها تمر من خلال الأوعية الدموية الدقيقة الحبل الشوكي. في بؤرة (النجمة)، وعرقلة تدفق الدم عن طريق تعطيل الاوعية الدموية الدقيقة.10large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
مع فائق توسيع البرامج، يتم رسمها الرقم 11. بروتوكول لSCBF الكمي. سبع مناطق دائرية والمتاخمة للاهتمام (ROI) على الصورة الحبل الشوكي الطولية. يتم وضع ROI الأول على مركز الاصابة. في كل ROI، البرنامج بإنشاء منحنى نضح-deperfusion ويحسب المنطقة تحت هذا المنحنى. هذه القيمة يرتبط مع تدفق الدم في هذا المجال. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 12. التجانس من تدفق الدم على طولالحبل الشوكي. تعرض هذه الرسوم البيانية عدم تجانس تدفق دم الحبل الشوكي وكذلك التباين بين الحيوانات. وهذا يمكن أن يفسر إلى حد كبير من قبل تشريح الأوعية الدموية في الحبل الشوكي. ولكن نظرا لعدم تجانس وتشريح الأوعية الدموية متغير، لا بد من استخدام قياسات تدفق الدم (من كل ROI) قبل الاصابة قاعدة أساسية. يتم التعبير عن القياسات التي تم إجراؤها على النقاط الزمنية التالية (بعد-SCI) كما تغير النسب المئوية من خط الأساس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 13. التغيرات في العمود الفقري تدفق دم الحبل السري (SCBF) الناجمة عن اصابات الحبل الشوكي التجريبية (SCI) 15 دقيقة بعد SCI هناك نقص التروية حاسما على مستوى مركز الزلزال في حين بقي SCBF صمحفوظة في المناطق لا تزال سليمة النائية. في المناطق المتاخمة للمركز (منقاري والذيلية على حد سواء)، يتم تقليل SCBF بشكل كبير. هذا يتوافق مع سبق وصفها "منطقة شبه الظل الدماغية". يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أننا قد وصفت كيفية استخدام CEU في الفئران اصابات النخاع الشوكي نموذج كدمة، هذا البروتوكول يمكن تعديلها لتناسب أهداف تجريبية أخرى أو نماذج اصابات النخاع الشوكي. اخترناه لقياس SCBF عند نقطتين فقط الوقت (قبل الإصابة و 15 دقيقة بعد SCI)، إلا أن عدد من النقاط الوقت والتأخير بين القياسات SCBF يمكن تكييفها لتلبية احتياجات دراسات أخرى. على سبيل المثال، في عملنا السابق 17، قمنا بقياس SCBF على خمس نقاط زمنية متتالية على مدار الساعة الأولى بعد اصابات النخاع الشوكي. من المهم أن نلاحظ أنه في مجموعة صورية (لا SCI)، فوجئنا أن نلاحظ انخفاض تدريجي في SCBF. بينما كنا نخشاه في البداية أن تكرار ضخ microbubble قد يضر الأوعية الدموية في النخاع الشوكي، مزيد من التجارب (بيانات غير منشورة) أكد أن هذه التغيرات ناجمة عن التغيرات التدريجية في الظروف الفسيولوجية الأنسجة المحلية (درجة الحرارة، والماء) الناجم عن الثقب، وكذلك لفترات طويلة معرض للركان دورا والأنسجة المحيطة إلى الهواء المحيط وهلام الموجات فوق الصوتية. هذه المشاكل شائعة في جميع التجارب التعامل مع دوران الأوعية الدقيقة، كما تداول حساس للغاية لكثير من المعلمات، وبالتالي عرضة للvascoconstriction أو توسع الأوعية. ولذلك، فإننا نوصي بأن الفترة التي يبقى الجروح المفتوحة قصيرة قدر الإمكان. إذا كانت هناك حاجة القياسات SCBF متعددة على مدى فترة طويلة، سيكون من الأفضل لإغلاق الجرح الحيوانية بين عمليات الاستحواذ من أجل استعادة الظروف الفسيولوجية حول وداخل الحبل الشوكي.
ومن الممكن أيضا لتعديل الشكل والحجم والموقع وعدد رويس لتحليل SCBF. واحدة من أهم مزايا CEU هو أن القياسات يمكن أن تكون في أي وقت بعد الانتهاء التجريبي من خلال معالجة البيانات المسجلة حاليا. ومن الممكن أيضا أن تكرار القياسات أو تعديل إعدادات قياس / المعايير إذا لزم الأمر.
القرار المكانية من التصوير بالموجات فوق الصوتية يتناسب مع تردد الموجات فوق الصوتية. وارتفاع وتيرة الموجات فوق الصوتية، وأفضل قرار المكاني. وقد استخدمنا أعلى-frequency (12-14 ميجا هرتز) التحقيق، الذي يقدم صورة مع بكسل القرار من حوالي 100 ميكرون. مع أنظمة الاستبانة العالية جدا، وتواتر زيادات تصل إلى 55 ميغاهيرتز وكل بكسل حوالي 20 ميكرون 20. ويمكن أيضا أن هذه الأجهزة يمكن استخدامها لCEU، التي تصور أكثر من ذلك بكثير على وجه التحديد توزيع SCBF في لحمة. ومع ذلك، فإن أنظمة الاستبانة العالية جدا هي أكثر تكلفة بكثير.
وقد اقترحت عدة تقنيات أخرى لقياس SCBF في SCI، ولكن لديهم كل القيود فريدة من نوعها. بعض، مثل المجهرية المشعة 7،8 أو C14-iodo-الأنتيبيرين تصوير الإشعاع الذاتي 9، تتطلب التضحية بالحيوانات. في هذه الحالات، يجب أن تحصد الحبل الشوكي للتحليل. من ناحية أخرى، فإن تقنية إزالة الهيدروجين 10، يتطلب داخل النخاع الإدراج الكهربائي قد تعدل في الواقع SCBF. وعلاوة على ذلك، لا يمكن إلا أن يتم القياس في منطقة محدودة جدا من لحمة الحبل الشوكي. المجهر الضوئيمن خلال نافذة الشوكي يوفر أيضا وسيلة لتقييم دوران الأوعية الدقيقة، ولكن هذا النهج لديه عمق محدودة جدا من المراقبة. أنه يسمح فقط لمراقبة التداول في مسألة الحنون سطحية وليس ضمن لحمة 16.
في الأدب، وعادة ما تؤدى في الوقت الحقيقي في الجسم الحي تقييم SCBF بواسطة دوبلر الليزر التصوير 11-13. ولكن، حتى هذه التقنية لديها العديد من القيود. أولا، لأن الليزر هو أقل من 1 مم في القطر، SCBF لا يمكن تقييمها في منطقة محظورة جدا المقابلة لشبه المجال لحوالي 1 ملم في القطر. منذ الحبل الشوكي لفأر حوالي 3 مم في القطر، ومساحة محدودة من التحليل هو العائق الرئيسي. وعلاوة على ذلك، كما بينا ذلك SCBF في الحبل الشوكي سليمة ليس متجانسا، فمن المهم لقياس SCBF في مساحة أكبر للتمثيل الصحيح للدوران الأوعية الدقيقة الأنسجة. ثانيا، ليزر لديه عمق محدود من الاختراق وبالتالي DETECTS SCBF سطحية. ونتيجة لذلك، فهو يقيس ليس فقط متني SCBF ولكن أيضا أن من الأم الحنون (الذي يحيط حمة). منذ الأم الحنون لديها نظام الأوعية الدموية فريدة من نوعها والتي لا تخضع لآليات لصناعة السيارات التنظيمية نفس السفن متني، قد تكون هذه المعلومات مضللة. وأخيرا، فإن الليزر دوبلر لا توفر أية معلومات المورفولوجية. CEU يتغلب على هذه القيود من خلال عرض الصور المورفولوجية من الحبل (B-اسطة)، في حين عرض فريد عامل تباين التي يمكن تحديدها بوضوح ضمن لحمة.
على الرغم من العديد من المزايا لمناهج أخرى، لديها CEU أيضا بعض القيود متميزة. منذ يتم إجراء قياسات على شريحة السهمي ثنائية الأبعاد (عادة ما تكون موازية لقناة المركزية)، SCBF من مناطق أخرى من لحمة لا يمكن الوصول إليها. وعلاوة على ذلك، فإن المعلومات التي تم إنشاؤها بواسطة قطعة سلك واحد ثنائية الأبعاد سهمي الشوكي قد لا تكون ممثلة للالحبل كله. Nevertheleقوات الأمن الخاصة، وهذا يمكن أن يسيطر عليها عدة الاحتياطات. أولا، من خلال تكرار القياسات في الموقع نفسه، أدلى القياس الأول (الحبل الشوكي سليمة) يمكن استخدامها كقيمة أساسية. ثانيا، عن طريق جرح في خط الوسط الحبل الشوكي (إصابة الثنائية)، وينبغي أن تكون التغييرات SCBF متماثل بين اليسار واليمين (بيانات غير منشورة). هذه الاحتياطات تساعد على ضمان أن تحليل شريحة السهمي واحدة غير كافية لتعكس التوزيع الطولي العالمي للSCBF.
التكلفة العالية للآلات الموجات فوق الصوتية هي قيد آخر. ومع ذلك، توجد عدة حلول لاستهداف هذه المشكلة. أولا، يمكن لبعض المختبرات تتفاوض على قرض مؤقت من قبل الشركة المصنعة لتجاربهم. كما آلات الموجات فوق الصوتية هي للنقل، وقروض مؤقتة ممكنة. وقد كان هذا هو النهج المتبع من قبل مختبرنا. بدلا من ذلك، يمكن لمجموعة من المختبرات تجمع الموارد لشراء الجهاز وتقسيم التكاليف. خلاف ذلك، فإن العديد من المؤسسات الجامعية لديها مرافق التصوير وجهاز الموجات فوق الصوتيةالصورة يمكن أن تكون على النحو الموصى الأدوات الأساسية. وبالتالي، يمكن أن يسمح الحيوانات نقل مرفق التصوير لتقييم CEU ثم اعادته لتجارب أخرى.
لتقييم التغيرات الأوعية الدموية، وكيل النقيض (microbubbles) يجب أن يتم حقنه عن طريق الوريد. على الرغم من أن قسطرة الوريد الوداجي أو الفخذ هي الغازية ومحفوفة بالمخاطر، وعروق يمكن الوصول إليها بسهولة وتحديدها بوضوح. في المقابل، حقن الوريد الذيل هو أقل تغلغلا كبيرا، ولكن السفينة يتميز سيئة / مرئية للقسطرة المناسبة. لذلك، هناك خطر يتمثل في أن طرف الإبرة لن يتم وضعها بشكل صحيح داخل الوريد أو أنها قد تتحرك أثناء الحقن، والمساس التجربة بأكملها. لهذا السبب، ونحن نفضل استخدام حبل الوريد وإدخال قسطرة للتسريب microbubble ثابت.
عظام فقرة تحيط الحبل الشوكي. كما تنعكس الموجات فوق الصوتية من خلال العظام وليس يمكن أن تمر من خلال laminas الحبل الشوكي، يتطلب التصويرإزالة العظام (الثقب) لفتح نافذة الصوتية. أسهل طريقة لفتح قناة العمود الفقري لإزالة القوس الخلفي للفقرة من خلال الثقب. في هذا البروتوكول، ونحن بحاجة إلى الثقب من أربعة مستويات لتصور جزء طويل من الحبل الشوكي، بما في ذلك مركز الزلزال، ومنطقة شبه الظل والمناطق النائية من الحبل الشوكي سليمة. على الرغم من أن معظم النماذج SCI التجريبية تتطلب الثقب (للتطبيق مقطع أو المسبار كدمة)، وهذه عادة ما تتكون من إزالة الصفيحة 1-2. على نطاق واسع الثقب على مستوى 4 هو الحد آخر من دراستنا. ومع ذلك، إذا كان المرء يحتاج فقط لدراسة منطقة مركز الزلزال وغبش، يمكن إجراء الثقب أقل اتساعا ويوصى.
في الختام، على الرغم من عدة حدود المبينة أعلاه، CEU هو أداة مفيدة لتقييم التغيرات SCBF وتأثير العلاجات المختلفة (أغراض بحثية). هذا يمكن الاعتماد عليها، في الوقت الحقيقي، في الجسم الحي النهج المثالي للنظر في العلاج للحد مننقص التروية واللاحقة نخر الأنسجة بعد اصابات النخاع الشوكي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Fixator Hoffman 3 | Stryker, Kalamazoo, USA | Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe | |
| Toshiba Applio | Toshiba, Tokyo, Japan | Ultrasound machine | |
| Sonovue | Bracco, Milan, Italy | Contrast agent : microbubbles | |
| Vueject pump | Bracco, Milan, Italy | Electric pump for infusion of microbubbles bolus | |
| Aquasonic Ultrasound Gel | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves | |
| Isovet | Piramal Healthcare, Mumbai, India | Isoflurane used for anesthesia | |
| Ultra Extend | Toshiba, Tokyo, Japan | Software used for quantification of spinal cord blood flow | |
| Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6 | Canadian Tire, Toronto, Canada | Set of pliers for Do-it-yourself job |
References
- Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: a systematic review of current treatment options. Clin Orthop Relat Res. 469 (3), 732-741 (2011).
- Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
- MacDonald, J. W., Sadowsky, C.
- Mautes, A. E., Weinzierl, M. R., Donovan, F., Noble, L. J. Vascular events after spinal cord injury: contribution to secondary pathogenesis. Phys Ther. 80 (7), 673-687 (2000).
- Martirosyan, N. L., et al. Blood supply and vascular reactivity of the spinal cord under normal and pathological conditions. J Neurosurg Spine. 15 (3), 238-251 (2011).
- Blight, A. R. Cellular morphology of chronic spinal cord injury in the cat: analysis of myelinated axons by line-sampling. Neuroscience. 10 (2), 521-543 (1983).
- Bassingthwaighte, J. B., et al. Validity of microsphere depositions for regional myocardial flows. Am J Physiol. 253 (1 Pt 2), H184-H193 (1987).
- Drescher, W. R., Weigert, K. P., Bunger, M. H., Hansen, E. S., Bunger, C. E. Spinal blood flow in 24-hour megadose glucocorticoid treatment in awake pigs. J Neurosurg. 99 (3 Suppl), 286-290 (2003).
- Golanov, E. V., Reis, D. J. Contribution of oxygen-sensitive neurons of the rostral ventrolateral medulla to hypoxic cerebral vasodilatation in the rat. J Physiol. 495 (Pt 1), 201-216 (1996).
- Ueda, Y., et al. Influence on spinal cord blood flow and function by interruption of bilateral segmental arteries at up to three levels: experimental study in dogs). Spine (Phila Pa 1976). 30 (20), 2239-2243 (2005).
- Carlson, G. D., et al. Sustained spinal cord compression: part II: effect of methylprednisolone on regional blood flow and recovery of somatosensory evoked potentials). J Bone Joint Surg Am. 85-A (1), 95-101 (2003).
- Hamamoto, Y., Ogata, T., Morino, T., Hino, M., Yamamoto, H. Real-time direct measurement of spinal cord blood flow at the site of compression: relationship between blood flow recovery and motor deficiency in spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 32 (18), 1955-1962 (2007).
- Horn, E. M., et al. The effects of intrathecal hypotension on tissue perfusion and pathophysiological outcome after acute spinal cord injury). Neurosurg Focus. 25 (5), E12 (2008).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Ishikawa, M., et al. Platelet adhesion and arteriolar dilation in the photothrombosis: observation with the rat closed cranial and spinal windows. J Neurol Sci. 194 (1), 59-69 (2002).
- Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 37 (22), E1376-E1382 (1976).
- Huang, L., et al. Quantitative assessment of spinal cord perfusion by using contrast-enhanced ultrasound in a porcine model with acute spinal cord contusion). Spinal Cord. 51 (3), 196-201 (2012).
- Postema, M., Gilja, O. H.
- Soubeyrand, M., Badner, A., Vawda, R., Chung, Y. S., Fehlings, M. Very High Resolution Ultrasound Imaging for Real-Time Quantitative Visualisation of Vascular Disruption After Spinal Cord Injury. J Neurotrauma. , (2014).
- Akhtar, A. Z., Pippin, J. J., Sandusky, C. B. Animal models in spinal cord injury: a review. Rev Neurosci. 19 (1), 47-60 (2008).
