Introduction
טכניקת assay שפותחה לאחרונה תפוקה גבוהה תא בודד מאפשרת אנזימי רומן שיוקרו מספריה גנטית בקנה מידה גדולה מבוססת על הפעילות התפקודית שלהם 1. ברמת התא הבודדה, חלבונים בויסות שעתוק מועסקים כדי לעורר ביטוי גני כתב על ידי חישת מולקולות קטנות מיוצרות כתוצאה של פעילות אנזים היעד. הגישה מוקדם אחד המעורבים את הבידוד של אופרון משפיל-פנול מ Ralstonia eutropha E2 באמצעות הביטוי הגנטי-induced המצע ההקרנה (SIGEX) שיטה, שבה המצע גורם הביטוי של עיתונאי חלבון 2. NhaR של Pseudomonas putida שמש כדי לבחור dehydrogenase benzaldehyde 3, ו LysG מ glutamicum Corynebacterium נוצל להקרנת התפוקה הגבוהה של L- ליזין-ייצור זן חדש מספרי מוטציה מגוונות 4.
בעבר, screeni אנזים גנטימערכת ng (GESS) הוצעה כפלטפורמת הקרנה החלימה בדרך כלל 5. מערכת זו משתמשת רגולטור dimethylphenol הכרה-פנול, DmpR, של פ putida. DmpR (E135K), ו מוטציה של DmpR, יכול להיות מועסק גם GESS (PNP-GESS) לצורך זיהוי של p -nitrophenol (PNP). בנוכחות אנזימי יעד ייצור תרכובות פנוליות, GESS ב E. קולי תאים פולטים אותות קרינה, מה שמאפשר את הבידוד המהיר של תאים בודדים באמצעות סדרן תא מופעל פלואורסצנטי (FACS). אבל הביטוי של אנזים metagenomic שנראה חלש יותר מזו של אנזימים רקומביננטי קונבנציונליים; ולכן, תוכננה GESS לזהות תרכובות פנוליות ברגישות המקסימלית על ידי חוקר את השילוב של אתר ריבוזומלי מחייב (RBS) ורצפים terminator יחד עם תפעול אופטימלי בתנאים 5.
אחד היתרונות הבסיסיים של GESS היא שיטה אחת זה תיאורטי מאפשרת הקרנת ovאה מ -200 סוגים שונים של אנזימים באתר ברנדה (טבלה 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) על ידי העסקת מצעים שונים פשוט. זה היה הראו כי cellulase, lipase, ו hydrolase parathion מתיל (MPH) ניתן לאתר באמצעות PNP-GESS עם מצעים מתאימים של בוטיראט p -nitrophenyl, p -nitrophenyl-cellotrioside, ו parathion מתיל, בהתאמה 5. לאחרונה, הוכח כי phosphatase אלקליין (AP), אשר הוא אחד האנזימים רומן שזוהו באמצעות PNP-GESS, הוא AP thermolabile הראשון נמצא metagenomes ימיים קר המותאמות 6.
הנה, הפרטים של תהליך המיון מוצג עם PNP-GESS גילוי הפעילויות של שלושה סוגים שונים של lipase enzymes-, cellulase, ו phosphatase אלקליין -ואז במהירות בזיהוי אנזימים מועמדים חדשים מספריה metagenomic 5,6. התהליכים כוללים עיבוד מקדים metagenome עם PNP-GESS ותפעול flow סדרן cytometry. בעוד הלהיטים המתקבלים יהיו צורך הרצף של זיהוי נוסף, פרוטוקול זה מכסה את ההליך עד מדרגות אישור פעילות אנזים באמצעות cytometry זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת הספרייה metagenomic עם PNP-GESS
- לבנות ספריה metagenomic ב E. coli עם וקטור fosmid באמצעות ערכת ייצור הספרייה fosmid פי פרוטוקול של היצרן 5.
- Aliquot 100 μl של הספרייה לאחסון ב -70 ° C, אשר מהווה מקור של תאי ספרייה metagenomic.
הערה: הצפיפות האופטית של מדגם נמדד באורך גל של 600 ננומטר (OD 600) של מניית ספרייה זה עומדת על כ -100. - להפשיר 100 μl של הספרייה metagenomic המניות על הקרח ולחסן בבקבוק 500 מ"ל המכיל 50 מ"ל לוריא- Bertani (LB) ו chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ"ל ואחריו 37 הדגירה מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
- קציר התאים צינור חרוטי 50 מ"ל על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 20 דקות ב 4 ° C.
- Resuspend גלולה במהירות 50 מ"ל מים מזוקקים קרים כקרח (DW) ו צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 20 דקות ב 4 ° C שוב.
- מילuspend גלולה ב 50 DW μl קר כקרח עם 10% (v / v) גליצרול. השתמש 50 μl של aliquot תא זה עבור electroporation.
- מניחים את התערובת של תאים electrocompetent 50 μl ו pGESS (E135K) DNA 5 (100ng) בתוך קובט electroporation קרים כקרח electroporate (1.8 ק ו / ס"מ, 25 μF) את התערובת.
- להוסיף במהירות 1 מ"ל סופר מרק אופטימלי עם דיכוי catabolite (SOC) בינוני ו resuspend התאים בעדינות.
- העברת התאים לתוך 14 מ"ל צינור מסביב לתחתית בעזרת פיפטה לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- מורחים 500 μl של תאים התאושש על צלחת מרובעת LB 20 x 20 ס"מ המכיל chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ"ל ו אמפיצילין 50 מיקרוגרם / מ"ל. דגירת צלחת ב 30 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
- גרדו את מושבות באמצעות מגרד תא ולאסוף תאים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל באמצעות אמצעי אחסון תא קר כקרח.
- צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 20 דקות ב 4 °. Resuspend גלולה ב 10 מ"ל אמצעי אחסון תא קר כקרחלהגיע OD של 600 100.
- Aliquot 20 μl של תאים לאחסון ב -70 ° C.
2. הסרת תוצאות חיוביות שגויות מספריית metagenomic
- להפשיר את תאי ספריית metagenomic מניות (משלב 1.13) המכילים fosmid DNA metagenomic ו pGESS (E135K) על קרח.
- לחסן 10 μl של התאים 2 מ"ל LB המכיל אמפיצילין 50 מיקרוגרם / מ"ל ו chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ"ל בתוך שפופרת 14 מ"ל מסביב לתחתית. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד במשך 4 שעות.
- בינתיים, מפעיל את מחשב FACS ולפתוח את תוכנת FACS מחדל. השתמש בהגדרות הבאות: קוטר נחיר, 70 מיקרומטר; פינת פיזור קדימה (FSC-A) רגישות, 300 הגברת V-לוגריתמים; פינת פיזור בצד (SSC-A) רגישות, 350 הגברת V-לוגריתמים; והעמסת isothiocyanate שטח (FITC-A) רגישות, 450 הגברת V-לוגריתמים; פרמטר הסף, FSC-ערך 5.
הערה: גדרות טיפוסיות מובאותעבור מכשיר FACS כפי שמופיע בטבלה של חומרים. התאם את ההגדרות עבור התקני FACS אחרים. - לדלל את תאי ספריית metagenomic משלב 2.2 ידי הוספת 5 μl של המדגם לצינור 5 מיליליטר עגול תחתון המכיל 1 מיליליטר PBS.
- מניח את מדגם הספרייה מדולל על בנמל הטעינה של מכשיר FACS ולחץ על כפתור Load על לוח מחווני רכישת תוכנת FACS.
- התאם את קצב אירוע 1,000 - 1,500 אירועים / sec ידי לחיצה ושליטה על כפתורי קצב הזרימה על לוח המחוונים.
- צור יומן מדורג FSC-A לעומת יומן מדורג SSC-A עלילת פיזור בגיליון גלובלי על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בסרגל הכלים. התאם את שער הפיזור R1 להקיף את אירועי הגופייה (אוכלוסיית חיידקים) באמצעות הלחצן שער המצולע בסרגל הכלים.
- מגרש היסטוגרמה עם ספירת תאים לעומת יומן מדורג FITC-A בגיליון העבודה על ידי לחיצה על כפתור היסטוגרמה. לאחר מכן, להתאים את מתח FITC מן Cytomeכרטיסיית גדרות ter על החלון מפקח הבקרה כזה כי שיאו של ב"התפלגות הפעמון הוא פחות מ -10 2-A FITC.
- צור-A FSC מדורג יומן vs. ביומן FITC-העלילה על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בגליון העבודה הגלובלי. הגדרת R2 שער מיון על המגרש באמצעות הלחצן שער המצולע בסרגל הכלים כך שהשער ממוקם בין + 5% ו -5% תאים ממרכז החלוקה (תאי 10% בסך הכילו סביב הפסגה של הפעמון עקום בצורה).
- מניחים צינור אוסף המכיל 1.2 מ"ל LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ו אמפיצילין chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ"ל במוצא המכשיר FACS ולמיין את 10 6 תאים העונים הן R1 ו- R2 שערים.
- הסר את צינור איסוף, כובע, ו מערבולת בעדינות.
3. הקרנת אנזים metagenomic
- דגירה תאים ממוינים (משלב 2.11) בשעה 37 ° C עם רועד ב 200 סל"ד עד 600 OD מגיע 0.5.
- הוסף 1 μl להעתיק פתרון אינדוקציה כדי להגביר את מספר עותק fosmid התאי. דגירת התאים עבור hr 3 נוסף ב 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 250 סל"ד.
- כדי להכין תאים למיון, להוסיף 0.5 מ"ל של תאים בתרבית ו מצע המתאים (אצטט -nitrophenyl p, p -nitrophenyl-β-D-cellobioside, או פוספט פניל) לתוך צינור 14 מ"ל מסביב לתחתית בריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
- למדגם שליטה, להוסיף 0.5 מ"ל של תאים בתרבית משלב 3.2 לתוך צינור 14 מ"ל מסביב לתחתית. מוסיפים את נפח זהה של PBS כמו נפח המצע בשלב 3.3.
- דגירה שני דגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד במשך 3 שעות.
- בינתיים מכינים את מכונת FACS עם אותו תצורות כמו שלב 2.3.
- הוסף 5 μl של תאים (למיון) ותאי הבקרה שני צינורות 5 מ"ל מסביב לתחתית המכילה 1 מ"ל PBS, בהתאמה.
- מניחים את הצינור המכיל תאים שליטה על tהוא טוען היציאה של FACS ולחץ על הכפתור Load בלוח המחוונים רכישת התוכנה FACS. כוונון קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec ידי שליטת כפתורי קצב זרימה על לוח המחוונים.
- יומן צור מדורגי FSC-A לעומת יומן מדורג SSC-A עלילת פיזור על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בגיליון העבודה הגלובלי של התוכנה ולהתאים את שער הפיזור R1 להקיף את אירועי הגופייה (אוכלוסיית חיידקים) באמצעות הלחצן שער המצולע על סרגל כלים.
- יומן צור מדורגי FSC-A לעומת יומן מדורג FITC-A עלילת פיזור על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בגיליון העבודה ולקבוע R2 שער מיון על המגרש באמצעות הלחצן מצולע השער בסרגל הכלים כך פחות מ -0.1% של תאים שליליים מזוהים בתוך שער R2.
- החזר את הצינור מלא המדגם עם צינור מדגם המיון, להתאים את קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec על ידי שליטה על כפתורי קצב הזרימה על לוח המחוונים.
- מניחים צינור איסוף המכיל 0.5מיליליטר LB במוצא מכשיר FACS ולמיין את 10 4 תאי עונים הם שערי R1 ו- R2.
הערה: קריטריון המיון יכול לנוע בין 0.1% עליונים עד 5% של-A FITC בשער R2. בפרוטוקול זה, תאי 1% עליונים נאספו תוצאות חיוביות. - הסר את צינור איסוף, כובע, ו מערבולת בעדינות.
- מורחים את דגימות 0.5 מ"ל שנאספו על שתי צלחות אגר (90 מ"מ צלחות פטרי) המכיל LB, 50 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין, 12.5 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- במידת הצורך, לבצע סיבובים נוספים של מיון FITC-A העשרה על ידי חזרה על שלבים 3.1-3.14.
4. Hit בחירת אישור פעילות האנזים
- Cytometry זרימת הניתוח
- מהצלחת וטופחה על שלב 3.14, בחר מושבה מראה שום קרינה באמצעות בורר מושבה תחת התצפית של גל 488 ננומטר של נורת ה- LED.
- לחסן את המושבה שנבחר 14 מ"ל roאונד תחתית שפופרת המכילה 2 מ"ל LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין ו -12.5 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol על 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד עד OD שלה 600 מגיע 0.5.
- הוסף 2 μl להעתיק פתרון אינדוקציה כדי להגביר את מספר עותק fosmid התאי. דגירת התאים עבור hr 3 נוסף ב 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 250 סל"ד.
- להכין צינור מסביב לתחתית 14 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של תאים בתרבית (שלב 4.1.3). הוסף מצע מתאים (תצטט p -nitrophenyl, p -nitrophenyl- β -D-cellobioside, או פוספט פניל) בריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
- עבור פקד, להוסיף תאים בתרבית 1 מ"ל משלב 4.1.3 לתוך 14 מ"ל צינור מסביב לתחתית ולהוסיף אותו נפח של PBS כמו נפח המצע בשלב 4.1.4.
- דגירה שני דגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד במשך 3 שעות.
- בינתיים מכינים את מכונת FACS עם אותו תצורות כמו שלב 2.3.
- הוסף 5 μl של תאים שטופלו מלאה המצע עד 5 מ"ל צינורות מסביב לתחתית המכילה 1 מ"ל PBS, בהתאמה.
- מניח את התאים מלאים המכיל צינור על בנמל הטעינה של מכשיר FACS ולחץ על כפתור Load בלוח מחווני רכישת תוכנת FACS. התאם את קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec באמצעות כפתורי קצב זרימה על לוח המחוונים.
- לחץ על כפתור רכישה למדוד-A FITC.
- החזר את הצינור מדגם שליטה עם הצינור מדגם מטופלים המצע. התאם את קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec באמצעות כפתורי קצב זרימה על לוח המחוונים.
- לחץ על כפתור רכישה למדוד-A FITC.
- השווה את הקרינה של שתי הקבוצות של תאים על ידי התוויית היסטוגרמה של ספירת תאים לעומת ביומן מדורג-A FITC.
- מבחני אחרים כדי לאשר פעילות האנזים
- עבור זיהוי נוסף של המועמדים אנזים שנבחרו, לחלץ DNA fosmid באמצעות פרו מיצוי סטנדרטיפרוצדורות מן ערכות ההפקה המסחרית ולנתח את רצף נוקליאוטידים, או לבדוק את פעילות האנזים במבחנה 6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השלושה המצעים פנוליות נבחנו לזהות אנזימי metagenomic רומן מספריה metagenome של משקעים שטוחים גאות אוקיינוס Taean, דרום קוריאה על ידי ביצוע הפרוטוקול המוצע. לבניית הספרייה, ממוצע 30 - 40 רצפי metagenome kb הוכנסו fosmids, אשר מבוססים על E. coli F replicon גורם והציג כעותק יחיד בתא. שים לב fosmids היה בשימוש נרחב לבניית ספריות גנומית מורכבת בשל התפשטות 8 היציבה שלהם.
איור 1 מציג תרשים זרימה קצרה של פרוטוקול ההקרנה כוללת הסילוק של תוצאות חיוביות שגוי עם מיון שלילי (איור 1 א) ואחריו מבחר להיט חיובי עם R1 ו- R2 מיון שערים (איור 1 ב '). הלהיטים הוערכו על ידי השוואת הקרינה של הדגימות עם ובלי מצעים(איור 1 ג). במקרה של הקרנה בתיווך יצטט p -nitrophenyl, חמישה מועמדים של lipase אושרו שבו הקרינה של תאים שטופלו מצע הייתה גבוהה מזו של תאים מלאים (איור 2 א). למרות ההפצות הרחבות של השלושה המועמדים של cellulase באיור 2 ב ', הם גם הראו הבדלים מובהקים של עוצמת FITC הממוצעת של האוכלוסיות. ארבעה מועמדים phosphatase גם הראה רמת הקרינה גבוהה בהשוואה לתאי הביקורת (איור 2 ג). ההבדל קרינה יותר בין תאים שליליים ומועמד פעילות האנזים החזקה ניתן להסיק מאז כתב הקרינה של PNP-GESS תערוכות תגובות כמוני הריכוזים פנול 5.
בפרוטוקול זה, רק את ההבדלים הקרינה אוששו באמצעות זרימת cytometry אבל מבחני זיהוי שונים ניתן ליישם שעות כאמור בשלב 4.2. איור 3 מדגים את הדוגמה של AP זיהוי 6. שיבוט שנבחר בין ארבעים ושבע מושבות פלורסנט מאוד מההקרנה היה רצף ו ORF של המועמד AP זוהה. ORF מוכנס לתוך וקטור הפלסמיד אושר לקיים פעילות AP עם cytometry זרימה. באיור 3, להיט תערוכות אותות קרינה חזקים יותר מאשר תאי נושאים פלסמיד ריק (שלילית). ניתוח נוסף של רצף בפעילות האנזימטית במבחנה גילה כי AP זה היה דומה במידה רבה לזה נקודות גישה ידועות אחרות במאפייניו האנזימטית למעט פעילות קטליטית גבוהה בטמפרטורות נמוכות (35 מעלות צלזיוס) לבין יציבות תרמית מדהימה (65 מעלות צלזיוס) תוך 15 דקות 6 . בנוסף, סוכנות ידיעות AP הוקרן הייתה דומה זמינה מסחרי נקודות גישת הסרת פוספטים מסוף מקצוות מלוכדים ובוטים של DNA פלסמיד לינארית 6.
דק-page = "1"> 
איור 1:. תהליך מיון אנזים Multi (א) הסרת תאים חיוביים שגויים מראים קרינה בלי מצע. שער המיון ממוקם באמצע צפיפות אוכלוסיית תאים כך שהשער כולל 10% של התאים הכוללים. (ב) מיון ניאון גבוהה (FITC-A) תאים (חיובי) סיפוק שערים R1 ו- R2 בנוכחות מצע מתאים. (ג) לאחר הבחירה ובידוד תא בודד, את הפעילות של האנזימים המועמדים נבדקת עם ובלי המצע (מסומן כמו W / מצעי W / O, בהתאמה). הבדל האיתות הברור בין שני המדגמים מרמז וקטור fosmid של התאים מכיל מידע גנטי יעד של עניין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 2: הערכת פעילות אנזים שימוש cytometry זרימה מועמדים אנזים metagenomic הוקרן ידי PNP-GESS עם שלושה מצעים שונים (א) אצטט p -nitrophenyl (pNPA), (ב) p -nitrophenyl-β-D-cellobioside (pNPG2), ו. (C) פוספט פניל. כל המועמדים להראות הבדל איתות ברור בין תאים עם ובלי מצע. פקדים הם התאים ללא טיפול המצע המתאים להם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: אני phosphatase אלקלייןdentification. לוח שמאלי מציג הבדל קרינה הברור בין התאים המכילים את האנזים פגע וקטור פלסמיד ריק (Negative). מימין, assay phosphatase של תאים מחסה הגן המועמד phosphatase ב וקטור פלסמיד על אגר LB המכיל פוספט 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl כמו מצע colorimetric מוצג. מושבות כחולות עולות כי התאים שנבחרו המכילים את גן metagenomic קידוד phosphatase. ראה 6 לקבלת פרטים נוספים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| מספר EC | תיאור | מספר אנזימים לייצור p-nitrophenol | מספר אנזימים לייצור פנול | |
| EC 1 </ Td> | 1.3 | ממלא מקום על קבוצת CH-CH של תורמים | - | 1 |
| Oxidoreductases | 1.11 | Peroxygenase | 2 | - |
| 1.14 | ממלא מקום על תורמים לזווג, עם התאגדות או | - | 2 | |
| הפחתה של חמצן מולקולרי | ||||
| EC 2 | 2.3 | Acyltransferases | 1 | - |
| טרנספראז | 2.4 | Glycosyltransferases | 8 | - |
| 2.5 | קבוצות אלקיל או aryl העברה, למעט קבוצות מתיל | 1 | 1 | |
| 2.7 | העברת קבוצות המכילים זרחן | 1 | 1 | |
| 2.8 | העברת קבוצות המכילות גופרית | 3 | 1 | |
| EC 3 | 3.1 | חוק על אג"ח אסתר | 67 | 16 |
| Hydrolases | 3.2 | Glycosylases | 75 | 21 |
| 3.4 | חוק על קשרים פפטידיים - peptidase | 26 | 4 | |
| 3.5 | חוק על קשרי פחמן-חנקן, למעט אג"ח פפטיד | 5 | 3 | |
| 3.6 | חוק על אנהידריד חומצה | 4 | - | |
| 3.7 | חוק על קשרי פחמן-פחמן | 2 | - | |
| EC 4 | 4.1 | lyases פחמן-פחמן | - | 3 |
| Lyases | 4.2 | lyases פחמן-חמצן | 1 | - |
| 4.3 | lyases פחמן-חנקן | 1 | - | |
| מספר סיכום ביניים של אנזימים | 197 | 53 | ||
| סה"כ אנזימים (למעט אנזימי חפיפה) | 211 | |||
טבלה 1: מספר אנזימים המייצרים p -nitrophenol או פנול ממסד הנתונים ברנדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הגדלת יעילות של biocatalysts ייצור היא מפתח להצלחה-כימי ביו מבוסס תעשיית 9 ו metagenome נחשב לאחד מקור האנזים הטבעי הטוב ביותר. במובן זה, זה הכרחי כדי הקרנת אנזימים רומן מן metagenome שבו רוב המשאבים הגנטיים לא נחקר 10. כמה שיטות הקרנה פותחו ישירות לזהות מוצרי אנזים באמצעות activators תעתיק 11, 12 אולם טכניקות אלו דורשות מערכת תעתיק המטבוליט-תגובה ספציפית. מצד שני, GESS הוא החלים רחב בהתאם לשימוש של פנול או PNP מתויג מצעים. למרות שרוב האנזימים דיווחו לייצר תרכובות פנול או PNP במאגר ברנדה (טבלה 1), (כולל שלוש דוגמאות בעבודה זו) שייכים hydrolase (מספר 3 EC) אנזימים בכיתה, לחקור מצעים פנוליות מגוונת יותר ואפילו בעיצוב מלאכותית מצע העמיד כדילמקד פעילות אנזים, כחלופות של מצעים טבעיים, יכולות להאריך את תחולת מערכת ההקרנה באופן משמעותית. שים לב בבחירת פנול מתאים או PNP מתויג מצע היא אחד הצעדים המכריעים של יישום PNP-GESS מאז חדירות הממברנה ותוצאה הסלולר של המצע באופן משמעותי להשפיע על פרוטוקול ההקרנה. כאן, אנו מראים כי חשובים בתעשייה שלושה סוגים שונים של אנזימים יכולים להיות מזוהים באופן תפוקה גבוהה באמצעות מערכת הקרנה אחת.
הגישה של שימוש FACS, בנוסף הקרנת התפוקה הגבוהה של אנזימי metagenomic, יכולה לחול גם על הנדסת רגולטורים תעתיק (TRS) עבור סגוליות TR שינו. דוגמה אחת היא מחקר שבו גרסה שונה AraC כי זוהה mevalonate במקום arabinose היה מבודד באמצעות FACS, ולאחר מכן מועסקים לתאים מסך ייצור mevalonate 13. כמו כן, השינוי הספציפי של TRs אפשר Furthהנדסה אה של פעילות האנזים. Auto-מוסדר TR, PcaU, תוכנן כדי לזהות 3,4-dihydroxybenzoate (34DHB) ולאחר מכן להחיל אותו למסך אנזימי dehydratase dehydroshikimate (AsbF) ב פעילות מקסימלית שלהם של המרת dehydroshikimate אנדוגני 34DHB 14. הרעיון הבסיסי של מחקרים אלה דומים לזה של PNP-GESS, מאז PNP-GESS משתמשת גרסת DmpR לזהות PNP ומראה ביצועי תפוקה גבוהה הקרנת מספריה גנטית בקנה מידה גדולה. עם זאת, הנדסה סגולית עלולה לגרום חיוביות שגויות לא מכוונות בין הלהיטים, כיוון שהיא עלולה לעורר ביטוי כתב על ידי מעוררי אחרים כתוצאה סגולית התרחב. לכן, רצוי לחקור את אורתוגונליות של תגובת TR לפני TR מוחל. מצד שני, הגדלת רגישות וטווח דינמי של TR יכול לפצות על הדור חיובי כוזב. לדוגמה, הרגישות של GESS שופרה על ידי החדרת RBS אופטימיזציה terminator sequences לתוך המערכת. תוצאות חיוביות שגויות של מערכת ההקרנה ואולי באות תקלה של המעגל הגנטי, כימיקלים פנוליות מכוונים הפעלת TR, צמיחת תאים הטרוגנית, ודיפוזיה חינם של פנול או PNP. תהליכי הסלקציה השליליים של צעדים 2.1 - 2.9 ציפו כדי להסיר תאים חיוביים כוזבים שחרור קרינה ללא טיפול מצע. תאים חיוביים הכוזבים אלה יכולים גם להיות מופחתים על ידי למקסם את יחס האות לרעש של המעגל הגנטי. יחד עם הנדסת RBS ו terminator, השימוש במדיה M9-גלוקוז שפר בצורה משמעותית את האות (פי 7 יותר מאשר תקשורת LB) ב PNP-GESS ביצועים 5. אבל, בפרוטוקול זה, LB שימש כפשרה בין ביטוי גנים metagenomic ידוע ועוצמת אות GESS. חקירת תנאים עדינים יותר של צמיחת תאי PNP-GESS ותוצאת מצע-גלוקוז M9 מאפשרת לשפר את עוצמת האות. רגולציה הדוקה של זמן תגובה של המצעים, בשלב 3.5, היאכמו כן, חשוב למנוע תוצאות חיוביות שגויות מופעלות על ידי פנול או דיפוזיה PNP.
GESS מאפשרת המרה של תפקוד האנזים לתוך ביטוי חלבון הכתב בתיווך שעתוק ברמה מתא בודד אבל זיהוי עקיף באמצעות חלבון הכתב יכול להיות אחת המגבלות המולדות. אז, ב assay האנזים במבחנה LC / GC-MS ניתוח של מוצר צריך להיות במעקב במשך לזיהוי ודאי של מועמד אנזים המשוערת 6,7. כמו כן ניתן להשתמש GESS ללא הצורך בניתוח FACS היקר על ידי הצמדה לכתבים חלופיים כגון גנים עמידים לאנטיביוטיקה או אנזימי chromogenic עם כתבי ניאון. לשיפור נוסף של יישומי GESS, יש צורך להקים שיטה לאפיין פעילות אנזים ולזהות את האנזימים באופן תפוקה גבוהה. יחד עם טכנולוגיות תפוקה גבוהה אחרים, כגון רצף של הדור הבא, GESS יהיה אסטרטגיה בשימוש נרחב עבור חלבון enzyהנדסה זרז אותי בענף מבוסס-ביולוגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-ml conical tube | BD Falcon | ||
| 14-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria-Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 10 g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 0.5 g/L, Magnesium Sulfate 2.4 g/L, Potassium Chloride 186 mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, Yeast extract 5 g/L |
| Cell storage media | 2x YT broth, 15% Glycerol, 2% Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
References
- Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J.
- Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).
- Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. Selection of biocatalysts for chemical synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).
- Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13 (5), R40 (2012).
- Choi, S., et al. Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits. ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).
- Lee, D. H., et al. A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments. BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector. Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).
- Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes. Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).
- Lorenz, P., Eck, J.
- Uchiyama, T., Miyazaki, K. Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes. Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).
- Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes. Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).
- Tang, S. Y., Cirino, P. C. Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein. Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).
- Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).
