Introduction
Недавно был разработан с высокой пропускной способностью методикой определения одноклеточного позволяет новые ферменты , которые будут экранированы от крупномасштабной генетической библиотеки на основе их функциональной активности 1. На одном уровне клетки, белки, регулирующие транскрипцию используются, чтобы вызвать экспрессию гена-репортера путем обнаружения малых молекул, которые образуются в результате активности целевого фермента. Одним из первых подход предусматривал выделение фенола деградирующих оперона из Ralstonia eutropha Е2 с использованием субстрата индуцированной генетической экспрессии скрининг метод (SIGEX), в котором подложка индуцирует экспрессию белка - репортера 2. NhaR из Pseudomonas putida был использован для выбора бензальдегида дегидрогеназы 3 и LysG из Corynebacterium glutamicum был использован для высокопроизводительного скрининга нового L-лизин штамма из различных мутантных библиотек 4.
Ранее генетический фермент screeniСистема нг (GESS) была предложена в качестве общего применения скрининга платформы 5. Эта система использует регулятор ДИМЕТИЛФЕНОЛА фенол-распознающих, DmpR, Р. putida. DmpR (E135K), и мутант DmpR, также могут быть использованы в GESS (PnP-GESS) для обнаружения р -nitrophenol (PnP). В присутствии ферментов - мишеней , продуцирующих фенольные соединения, ГЕСС в E. палочка клетки испускает флуоресцентный сигнал, что позволяет быстрое выделение отдельных клеток с помощью флуоресцентного активированного сортировщика клеток (FACS). Но экспрессия метагеномной фермента, как представляется, слабее, чем у обычных рекомбинантных ферментов; Таким образом, GESS был разработан для обнаружения фенольных соединений с максимальной чувствительностью, исследуя сочетание сайта связывания рибосом (RBS) и терминатор последовательностей наряду с оптимального рабочего состояния 5.
Одним из основных преимуществ GESS является то, что это единственный метод теоретически позволяет скрининг OVэр чем 200 различных типов ферментов , в базе данных Бренда (таблица 1, HTTP: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) путем простого использования различных субстратов. Было показано , что целлюлазы, липазы и метилпаратиону гидролазы (MPH) можно обнаружить с помощью ПНП-Гесс с соответствующими субстратами р нитрофенил бутирата, р - нитрофенил-cellotrioside и метилпаратиона, соответственно 5. Недавно было доказано , что щелочной фосфатазы (АР), которая является одним из новых ферментов , идентифицированных с использованием ПНП-Гесс, является первым термолабильных А.П. найден в холодоадаптированных морских метагеномов 6.
Здесь, подробная информация о процессе скрининга представлен с PnP-GESS обнаружения деятельности трех различных типов enzymes- липазы, целлюлазы и щелочной фосфатазы -И быстрого выявления новых кандидатов ферментов из метагеномной библиотеки 5,6. Процессы включают метагенома предварительную обработку с ПНП-GESS и эксплуатации флвл цитометрии сортировщика. В то время как полученные удары должны быть секвенированы для дальнейшей идентификации, этот протокол охватывает процедуру до шаги ферментативного подтверждения активности с использованием проточной цитометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка библиотеки метагеномной с ПНП-GESS
- Построить метагеномной библиотеку в E. палочка с fosmid вектором с использованием набора fosmid производства библиотеки в соответствии с протоколом производителя 5.
- Аликвоты по 100 мкл библиотеки для хранения при -70 ° C, что является источником метагеномных библиотеки клеток.
Примечание: Оптическая плотность образца , измеренной при длине волны 600 нм (OD 600) этого фонда библиотеки составляет около 100. - Разморозить 100 мкл основного метагеномной библиотеки на льду и инокуляции в 500 мл колбу, содержащую 50 мл Лурия-Бертани (LB) и 12,5 мкг / мл хлорамфеникола, за которой следует 37 ° C инкубации в течение 2 ч.
- Сбора клеток в 50 мл коническую пробирку центрифугированием при 1000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С.
- Ресуспендируют осадок быстро в 50 мл охлажденного льдом дистиллированной воды (DW) и центрифуге при 1000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С снова.
- Resuspend осадок в 50 мкл охлажденного льдом DW с добавлением 10% (об / об) глицерина. Используйте 50 мкл этой клеточной аликвоты для электропорации.
- Поместите смесь электрокомпетентных клеток 50 мкл и pGESS (E135K) 5 ДНК (100 нг) в охлажденный льдом кювету для электропорации и электропорации (1,8 кВ / см, 25 мкФ) смеси.
- Быстро добавить 1 мл супер оптимальной бульон с катаболитной репрессии (SOC) среды и ресуспендирования клеток мягко.
- Передача клеток в 14 мл с круглым дном трубки с помощью пипетки и инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа.
- Спред 500 мкл выделенных клеток на LB 20 х 20 см квадратной пластины, содержащей 12,5 мкг / мл хлорамфеникола и 50 мкг / мл ампициллина. Инкубируйте планшет при 30 ° С в течение 12 часов.
- Скрип колонии с помощью мобильного скребок и собирают клетки в 50 мл коническую трубку с помощью ледяной носитель клеток.
- Центрифуга при 1000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С. Ресуспендируют осадок в 10 мл охлажденного льдом носителей клетокдостичь OD 600 из 100.
- Аликвоты по 20 мкл клеток для хранения при -70 ° C.
2. Удаление ложных срабатываний из библиотеки метагеномной
- Растаяйте запаса метагеномных библиотеки клеток (из стадии 1.13), содержащих метагеномной fosmid ДНК и pGESS (E135K) на льду.
- Инокулируйте 10 мкл клеток в 2 мл LB, содержащей 50 мкг / мл ампициллина и 12,5 мкг / мл хлорамфеникола в 14-мл с круглым дном трубки. Инкубируют при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту в течение 4 часов.
- В то же время, включите машину FACS и откройте программное обеспечение FACS по умолчанию. Используйте следующие параметры: диаметр кончика насадки, 70 мкм; Форвард Scatter Area (FSC-A) чувствительность, 300 V-логарифмическое усиление; Боковой Scatter Площадь (SSC-A) чувствительность, 350 V-логарифмическое усиление; Флуоресцеинизотиоцианатом Площадь (FITC-A) чувствительность, 450 V-логарифмическое усиление; пороговый параметр, FSC-значение 5.
Примечание: Типовые настройки приведеныдля FACS устройства , указанного в таблице материалов. Настройка параметров для других устройств FACS. - Развести метагеномных библиотеки клеток из шага 2.2 добавлением 5 мкл образца к 5-мл с круглым дном пробирку, содержащую 1 мл PBS.
- Поместите разбавленный образец библиотеки на порт погрузки прибора FACS и нажмите на кнопку Загрузить на панели управления Приобретение программного обеспечения FACS.
- Установите частоту событий на 1000 - 1500 событий / сек, нажав и управления кнопки Flow Rate на приборной панели.
- Создать журнал масштабируется FSC-A против журнала масштабируется SSC-график рассеяния на глобальном листе, нажав на кнопку Dot участок в панели инструментов. Отрегулируйте Разброс R1 затвора, чтобы охватить Синглетное события (бактериальная популяция) с помощью кнопки Полигон Gate в панели инструментов.
- Участок гистограмма с количеством клеток по сравнению с журнала масштабируется FITC-A на листе, нажав на кнопку Гистограмма. Затем отрегулируйте напряжение FITC от CytomeВкладка Параметры тер на окне инспектора управления таким образом, что пик распределения в форме колокола составляет менее 10 2 ФИТЦ-A.
- Создание журнала масштабируется FSC-A против. журнал FITC-Участок, нажав на кнопку Dot участка на мировом листе. Установить сортировочный R2 затвора на участке с помощью кнопки Полигон Gate на панели инструментов, так что ворота расположены между + 5% и -5% клеток от центра распределения (всего 10% клеток вокруг пика BELL- образной кривой).
- Поместите пробирку , содержащую 1,2 мл LB , содержащей 50 мкг / мл ампициллина и 12,5 мкг / мл хлорамфеникола на выходе из прибора FACS и отсортировывать 10 6 клеток , удовлетворяющие оба R1 и R2 ворота.
- Снимите трубку сбора, колпачок и осторожно завихрения.
3. метагеномной Фермент Скрининг
- Инкубируйте отсортированных клеток (со стадии 2.11) при 37 ° С при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту до OD 600 достигает 0,5.
- Добавить 1 мкл раствора скопировать индукции для усиления внутриклеточного fosmid числа копий. Инкубируйте клетки еще в течение 3 ч при 37 ° C при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.
- Для подготовки клеток для сортировки, добавьте 0,5 мл культивируемых клеток и соответствующего субстрата (п - нитрофенил ацетат, р - нитрофенил-β-D-целлобиозида, или фенил , фосфат) в 14-мл с круглым дном трубки в конечной концентрации 100 мкМ.
- Для получения контрольной пробы, добавляют 0,5 мл культивируемых клеток из шага 3.2 в 14-мл с круглым дном трубки. Добавьте тот же объем PBS в объеме субстрата в стадии 3.3.
- Выдержите двух образцов при 37 ° С при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту в течение 3 часов.
- В то же время, подготовить машину FACS с теми же конфигурациями, как на стадии 2.3.
- Добавьте 5 мкл клеток (для сортировки) и контрольных клеток на две 5 мл круглодонную пробирки, содержащие 1 мл PBS, соответственно.
- Поместите пробирку, содержащую контрольные клетки на Тон порт погрузки из FACS и нажмите на кнопку Загрузить на панели управления Приобретение программного обеспечения FACS. Регулировка частоты событий 1000 - 3000 событий / сек с помощью кнопки управления Flow Rate на приборной панели.
- Создание журнала масштабируется FSC-A против журнала масштабируется SSC-точечный график, нажав на кнопку Dot участка на мировом листе программного обеспечения и регулировки разброса R1 затвора , чтобы охватить Синглетное события (бактериальное население) с помощью кнопки Полигон Gate на панель инструментов.
- Создание журнала масштабируется FSC-A vs. журнал масштабируется FITC-точечный график, нажав на кнопку Dot участка на листе и установить сортировочный R2 затвора на участке с помощью кнопки Полигон Gate на панели инструментов , так что менее 0,1% от негативные клетки обнаруживаются в ворота R2.
- Заменить контрольный образец трубки с сортировочной пробирки с образцом, и регулировать скорость событий 1000 - 3000 событий / сек, управляя кнопками Flow Rate на приборной панели.
- Поместите пробирку, содержащую 0,5мл LB на выходе из прибора FACS и разобравшись 10 4 клеток , удовлетворяющие обе ворота R1 и R2.
Примечание: критерий сортировки может находиться в диапазоне от верхнего от 0,1% до 5% от FITC-А в воротах R2. В этом протоколе, топ 1% клеток были собраны в качестве позитивов. - Снимите трубку сбора, колпачок и осторожно завихрения.
- Намажьте емкостью 0,5 мл собранных образцов на двух чашках с агаром (90 мм чашках Петри), содержащих LB, 50 мкг / мл ампициллина, 12,5 мкг / мл хлорамфеникола, и инкубируйте при 37 ° С в течение ночи.
- При необходимости выполнить дополнительные раунды сортировки для FITC-A обогащения, повторив шаги 3.1-3.14.
4. Хит Выбор и активность энзимов Подтверждение
- Анализ проточной цитометрией
- Из инкубированных пластины на шаге 3.14, выберите колонию, не оказывающем флуоресценции с использованием сборщика колонии под наблюдением 488 нм длины волны светодиодной подсветки.
- Привить выбранную колонию в 14 мл роунд дном пробирку , содержащую 2 мл LB , содержащей 50 мкг / мл ампициллина и 12,5 мкг / мл хлорамфеникола , при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту , пока его OD 600 достигает 0,5.
- Добавьте 2 мкл раствора скопировать индукции для усиления внутриклеточного fosmid числа копий. Инкубируйте клетки еще в течение 3 ч при 37 ° C при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.
- Приготовьте 14 мл с круглым дном трубки и добавляют 1 мл культивируемых клеток (шаг 4.1.3). Добавьте соответствующий субстрат (р - нитрофенил ацетат, р -nitrophenyl- & beta ; -D-целлобиозида или фенил , фосфата) в конечной концентрации 100 мкМ.
- Для контроля, добавьте по 1 мл культивируемых клеток с шага 4.1.3 в 14 мл с круглым дном, добавить необходимые тот же объем PBS в объеме субстрата в стадии 4.1.4.
- Выдержите двух образцов при 37 ° С при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту в течение 3 часов.
- В то же время, подготовить машину FACS с теми же конфигурациями, как на стадии 2.3,
- Добавьте 5 мкл контрольного и субстрата клеток, обработанных по 5 мл круглым дном пробирки, содержащие 1 мл PBS, соответственно.
- Поместите пробирку, содержащую контрольные клетки на погрузочной порту устройства FACS и нажмите на кнопку Загрузить на панели управления Приобретение программного обеспечения FACS. Установите частоту событий на 1000 - 3000 событий / сек с помощью кнопок Flow Rate на приборной панели.
- Нажмите на кнопку Acquisition для измерения FITC-A.
- Заменить пробирку управления с подложкой обработанной пробы трубки. Установите частоту событий на 1000 - 3000 событий / сек с помощью кнопок Flow Rate на приборной панели.
- Нажмите на кнопку Acquisition для измерения FITC-A.
- Сравните флуоресценции двух групп клеток путем построения гистограммы числа клеток по сравнению с лог масштабируется FITC-A.
- Другие анализы, чтобы подтвердить активность фермента
- Для дальнейшей идентификации отобранных кандидатов ферментов, экстракт fosmid ДНК с использованием стандартной про экстракциицедуры из коммерческих наборов экстракции и анализа нуклеотидной последовательности, или проверить активность фермента 6,7 в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Три фенольные субстраты были рассмотрены с целью идентификации новых метагеномных ферменты из метагенома в библиотеке океанских приливов и отливов плоских осадков в Тэанской, Южная Корея, следуя предлагаемого протокола. Для строительства библиотеки, в среднем 30 - метагенома последовательности 40 кб были вставлены в fosmids, которые основаны на E. палочка F фактор репликон и представлены в виде одной копии в клетке. Обратите внимание , что fosmids широко используются для построения сложных геномных библиотек из - за их устойчивое распространение 8.
На рисунке 1 показана краткая блок - схема протокола скринингового включая устранение ложных срабатываний с отрицательным сортировкой (Рисунок 1) , а затем положительный отбор хит с R1 и R2 затворы (сортировочный рисунок 1 В). Удары оценивали путем сравнения флуоресценции образцов с и без подложек(Рисунок 1 С). В случае р - нитрофенил ацетат опосредованного скрининга, пять кандидатов липазы были подтверждены , где флуоресценция субстратных клеток , обработанных были выше , чем у контрольных клеток (рисунок 2 А). Несмотря на широкие распределения трех кандидатов целлюлазы на рисунке 2 B, они также показали четкие различия в средней интенсивности FITC популяций. Четыре кандидата фосфатазы также показали высокий уровень флуоресценции по сравнению с контрольными клетками (рисунок 2 C). Чем больше разница флуоресценции между отрицательными и кандидата клеток , тем сильнее активность фермента может быть выведенным после флуоресценции репортера PnP-GESS показывает количественные ответы на концентрации фенола 5.
В этом протоколе, только различия флуоресценции были подтверждены с помощью проточной цитометрии, но различные идентификационные анализы могут быть применены упоминалось в шаге 4.2. Рисунок 3 демонстрирует пример идентификации AP 6. Выбранный клон среди сорока семи высоко флуоресцентных колоний от скрининга, секвенируют и был идентифицирован Фильтр ORF кандидата AP. ORF, встраивают в плазмидный вектор был подтвержден, чтобы иметь активность AP с проточной цитометрии. На рисунке 3, хит показывает более сильный сигнал флуоресценции , чем клетки , несущие пустой плазмидой (отрицательную). Дальнейший анализ последовательности и экстракорпоральное ферментативной активности обнаружено , что этот АП была очень похожа на другие известные точки доступа в ее ферментативной характеристик за исключением высокой каталитической активности при более низких температурах (35 ° C) и замечательной тепловой неустойчивости (65 ° C) в течение 15 мин 6 , Кроме того, скрининг АП был сопоставим с коммерчески доступными точками доступа удаления концевых фосфатов из липких и тупые концы линеаризованной плазмидной ДНК 6.
Рисунок 1:. Мульти Фермент Скрининг Процесс (A) Удаление ложно-положительных клеток с флуоресценцию без подложки. Сортировочный ворота расположены в середине плотности популяции клеток таким образом, что затвор включает в себя 10% от общего количества клеток. (Б) Сортировка высокой флуоресценцией (FITC-А) клетки (положительных) , удовлетворяющих R1 и R2 ворота в присутствии соответствующего субстрата. (С) После выбора и выделения отдельных клеток, активность ферментов - кандидатов исследовали с использованием и без подложки (обозначенный как W / и субстраты Вт / O, соответственно). Разница четкий сигнал между двумя образцами предполагает fosmid вектор клеток содержит генетическую информацию целевой интерес. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Активность фермента Оценка с помощью проточной цитометрии метагеномной кандидатов фермента , экранированные PnP-GESS с тремя различными подложками (А) р - нитрофенил ацетат (pNPA), (В) р - нитрофенил-β-D-целлобиозид (pNPG2), и. (С) фенил фосфат. Все кандидаты показывают четкое различие сигнала между клетками с и без подложки. Элементы управления являются клетки без их соответствующей обработки субстрата. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: щелочной фосфатазы Identification. Левая панель показывает четкое различие флуоресценции между клетками , содержащими фермент хит и пустой плазмидный вектор (отрицательный). Справа фосфатазы анализ клеток, несущих ген-кандидат фосфатазы в плазмидный вектор на Ьь агар, содержащий 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфата в качестве колориметрического субстрата показана. Синие колонии показывают, что выбранные ячейки содержат метагеномной ген, кодирующий фосфатазу. См 6 для более подробной информации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Номер EC | Описание | Количество п-нитрофенол производства ферментов | Количество фенола производства ферментов | |
| EC 1 </ TD> | 1.3 | Действуя на CH-CH группой доноров | - | 1 |
| Оксидоредуктазы | 1.11 | Peroxygenase | 2 | - |
| 1.14 | Действуя на спаренных доноров, с включением или | - | 2 | |
| восстановление молекулярного кислорода | ||||
| EC 2 | 2.3 | ацилтрансферазы | 1 | - |
| Трансферазы | 2.4 | гликозилтрансферазами | 8 | - |
| 2.5 | Передача алкильные или арильные группы, отличные от метильных групп | 1 | 1 | |
| 2.7 | Перенос фосфорсодержащие группы | 1 | 1 | |
| 2.8 | Перенос серосодержащих групп | 3 | 1 | |
| EC 3 | 3.1 | Закон об эфирных связей | 67 | 16 |
| Гидролазы | 3.2 | гликозилазами | 75 | 21 |
| 3.4 | Закон о пептидных связей - пептидазы | 26 | 4 | |
| 3.5 | Закон о углерод-азотных связей, кроме пептидных связей | 5 | 3 | |
| 3.6 | Закон о кислотных ангидридов | 4 | - | |
| 3.7 | Закон о углерод-углеродных связей | 2 | - | |
| EC 4 | 4.1 | Углерод-углеродные лиазы | - | 3 |
| Лиазы | 4.2 | Углерод-кислородные лиазы | 1 | - |
| 4.3 | Углерод-азотные лиазы | 1 | - | |
| Итого количество ферментов | 197 | 53 | ||
| Общее количество ферментов (за исключением внахлест ферментов) | 211 | |||
Таблица 1: Количество Ферменты , которые продуцируют р -nitrophenol или фенолом из базы данных Бренда.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Повышение эффективности производства биокатализаторов является ключевым для успеха био-химической промышленности , основанной 9 и метагенома считается одним из лучших естественных источника фермента. В этом смысле важно скрининга новых ферментов из метагенома , где большинство генетических ресурсов не были изучены 10. Существует несколько методов отбора были разработаны , которые непосредственно обнаружить ферментные продукты с использованием активаторы транскрипции 11, 12 , но эти методы требуют конкретный метаболит реагирующих систему транскрипционной. С другой стороны, ГЕСС широко применим в зависимости от применения фенола или pnp-меченый субстратов. Хотя большинство из зарегистрированных ферментов , производящих фенол или PnP соединений в базе данных Бренда (таблица 1), ( в том числе трех примеров в этой работе) принадлежат гидролазы (ЕС номер 3) класс ферментов, исследуя более разнообразные фенольных субстратов и даже проектирования искусственного субстрат подвергаяцелевой активность фермента, в качестве альтернативы природных субстратов, может существенно расширить сферу применения системы скрининга. Следует отметить, что выбор подходящего фенола или pnp-меченый субстрат является одним из важных этапов применения ПНП-GESS со времени проницаемости мембраны и клеточного эффекта подложки существенно влияют на протокол скрининга. Здесь мы покажем, что промышленно важные три различных типа ферментов могут быть идентифицированы в высокой пропускной способности способом, используя единую систему скрининга.
Подход с использованием FACS, в дополнение к высокой скрининга метагеномных ферментов, могут быть также применены к инженерно-транскрипционных регуляторов (TRS) для TR измененном специфичности. Одним из примеров является исследование , в котором AraC вариант , который обнаружен мевалонатного вместо арабинозы был выделен с помощью FACS, а затем используется для ячеек экрана , производящих мевалонатного 13. Кроме того, изменение специфичности TRs позволило Фюртэр инженерия активности фермента. Авто-TR регулируется, PcaU, был разработан для обнаружения 3,4-дигидроксибензоата (34DHB) , а затем применяется для скрининга dehydroshikimate дегидратазе ферментов (AsbF) при их максимальной активности преобразования эндогенного dehydroshikimate в 34DHB 14. Основная концепция этих исследований аналогична PnP-GESS, так как PnP-GESS использует вариант DmpR для обнаружения PnP и показывает высокую производительность, пропускную способность экранировать от крупномасштабной генетической библиотеки. Тем не менее, специфика инженерной может привести к непреднамеренной ложных срабатываний среди хитов, как можно, чтобы вызвать экспрессию репортера другими индукторами в результате уширенной специфичности. Поэтому, было бы желательно, чтобы исследовать ортогональность ответ TR перед нанесением TR. С другой стороны, повышение чувствительности и динамический диапазон TR может компенсировать ложноположительного поколения. Например, чувствительность GESS была улучшена путем введения оптимизированной двоичных объектов и терминатор sequтывает в систему. Ложные срабатывания системы скрининга, возможно, происходят из строя генетической цепи, непреднамеренные фенольные химикаты активирующие TR, рост гетерогенную клеток и свободной диффузии фенола или PnP. как ожидается, 2,9, чтобы удалить ложные положительные клетки рилизинг флуоресценцию без обработки субстрата - Негативные процессы отбора шагов 2.1. Эти ложные положительные клетки могут быть также уменьшена за счет максимального сигнала к шуму генетической цепи. Наряду с RBS и терминатора техники, использования средств массовой информации M9-глюкозы значительно улучшили сигнал ( в 7 раз выше , чем LB СМИ) в 5 производительности PnP-GESS. Но, в данном протоколе, LB, был использован в качестве компромисса между неизвестным метагеномной экспрессии генов и интенсивности сигнала GESS. Исследуя более тонкие условия роста клеток PnP-GESS и эффект подложки в M9-глюкозы позволяет повысить интенсивность сигнала. Tight регулирование времени реакции субстратов, на шаге 3.5, являетсяКроме того, важно, чтобы избежать ложных срабатываний, запускаемые фенола или диффузии PnP.
ГЕСС позволяет преобразование функции фермента в экспрессии белка репортер транскрипции опосредованную на уровне одной клетки, но косвенное определение с помощью репортерного белка может быть одним из врожденных ограничений. Так, в пробирке ферментный анализ и LC / ГХ-МС анализ продукта необходимо следовать определенным для идентификации предполагаемого кандидата фермента 6,7. Кроме того, можно использовать Гесс без необходимости анализа дорогостоящих FACS путем присоединения альтернативных репортеров, таких как гены устойчивости к антибиотикам или хромогенных ферментов с люминесцентными репортерами. Для дальнейшего совершенствования применения Гесс, необходимо создать метод для характеристики активности ферментов и идентифицировать ферменты в высокой пропускной образом. Наряду с другими технологиями, высокой пропускной способности, например, следующего поколения секвенирования, GESS будет широко используемой стратегией белка и enzyмне катализатор инженерии в биологии на основе промышленности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-ml conical tube | BD Falcon | ||
| 14-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria-Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 10 g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 0.5 g/L, Magnesium Sulfate 2.4 g/L, Potassium Chloride 186 mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, Yeast extract 5 g/L |
| Cell storage media | 2x YT broth, 15% Glycerol, 2% Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
References
- Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J.
- Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).
- Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. Selection of biocatalysts for chemical synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).
- Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13 (5), R40 (2012).
- Choi, S., et al. Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits. ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).
- Lee, D. H., et al. A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments. BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector. Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).
- Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes. Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).
- Lorenz, P., Eck, J.
- Uchiyama, T., Miyazaki, K. Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes. Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).
- Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes. Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).
- Tang, S. Y., Cirino, P. C. Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein. Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).
- Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).
