Summary
מיקרוסקופ זריחה intravital (IVFM) של החילונית מוחל בשילוב עם דגמים גנטיים בעלי חיים כדי ללמוד את יונת ואת engraftment של תאים hematopoietic גומחות מח עצם (מוניטור).
Abstract
הוכחה גוברת מציין שאת hematopoiesis נורמלי מוסדר על ידי רמזים microenvironmental נפרדות ב ויטביע, הכוללים נישות הסלולר מיוחדים להתכוונן קריטי לתאי גזע hematopoietic (HSC) פונקציות1,2. אכן, תמונה מפורטת יותר של microenvironment hematopoietic זה עכשיו מתעוררים, בו את endosteal, גומחות אנדותל ליצור יחידות פונקציונליות לוויסות האנרגיות HSC רגיל ו שלהם רומא3,4,5 . מחקרים חדשים גילו את החשיבות של תאים perivascular, adipocytes, תאים עצביים תוך שמירה על וויסות HSC פונקציה6,7,8. יתר על כן, יש עדויות לכך תאים שושלות שונות, כלומר התאים מיאלואידית, הלימפה, הבית, שוכנים בתוך נישות ספציפיות בתוך microenvironment מוניטור. עם זאת, מיפוי מלאה של microenvironment את מוניטור ואת דייריו נמצאת בעיצומה.
העכבר הטרנסגניים זנים שושלת היוחסין סמני פלורסנט ספציפי או עכברים מהונדסים חוסר שנבחר מולקולות תאים מסוימים של הגומחה מוניטור זמינים כעת. הנוק-אאוט, שושלת היוחסין מעקב מודלים, בשילוב עם גישות השתלת, מספקים הזדמנות לחדד את הידע על תפקיד ספציפי "נישה" תאים עבור אוכלוסיות hematopoietic מוגדרים, כגון מועדון הכדורגל מונפלייה, תאי-B, T-תאים, התאים מיאלואידית ו תאים erythroid. אסטרטגיה זו יכול להיות potentiated עוד יותר על-ידי מיזוג השימוש של מיקרוסקופ שני הפוטונים של החילונית. על ידי מתן ויוו הדמיה ברזולוציה גבוהה עיבוד תלת-ממדי של החילונית מוניטור, אנו יכולים עכשיו לקבוע במדויק את המיקום שבו הנדונים hematopoietic בבית ויטביע ולהעריך את קינטיקה של התרחבותן לאורך זמן. כאן, ליס-GFP העכברים הטרנסגניים (סימון התאים מיאלואידית)9 ו RBPJ עכברים הנוק-אאוט (שחסר איתות חריץ קנונית)10 משמשים בשילוב עם IVFM כדי לקבוע את engraftment של התאים מיאלואידית microenvironment מוניטור פגומה חריץ.
Introduction
מיקרוסקופ זריחה multiphoton intravital (IVFM) היא טכניקת הדמיה עוצמה המאפשרת ברזולוציה גבוהה, בזמן אמת הדמיה של רקמות עם עומק עד 1 מ מ, בהתאם הרקמה. כאשר חל החילונית העכבר, הוא מאפשר לצפות בהתנהגות של התאים hematopoietic בתוך ויטביע בצורה לא פולשנית עד ל- 60-100 μm11. גישה זו משמשת כאן כדי לקבוע את קינטיקה של engraftment של אבות מיאלואידית נורמלי בעכברים מעלף מוניטור של RBPJ חסר איתות חריץ הקנוני.
העבודה האחרונה של הקבוצה שלנו הפגינו הזה פגום הקנוני חריץ איתות ב ללידים microenvironment מוניטור המחלה כמו myeloproliferative12. אובדן של חריץ איתות הושג על-ידי מחיקת מותנה המחשבים איגוד ה-DNA של RBPJ, גורם שעתוק קריטי במורד הזרם של חריץ הקנוני איתות, באמצעות Mx1-Cre המושרה רקומבינציה10. במחקר זה, שימש המודל עכבריםלקס/סלומון Mx1-Cre/RBPJ. מותנה מחיקה של מוטיב מחייב DNA RBPJ גורמת לאובדן של איתות של כל חריץ קולטנים. במודל Mx1-Cre, Cre הביטוי הוא מונע על ידי האמרגן Mx1 מופעל על מינהל polyI:C וכתוצאה מכך תנאי הגיוס של מחיקה ג'ין יישוב בתאי הדם, כמו גם כמו רכיבים סטרומה באיברים רבים, כולל מוניטור, הטחול והכבד.
Mx1-Cre+/RBPJסלומון/סלומון ועכבריםלקס/סלומון Mx1-Cre–/RBPJ המושרה עם polyI:C (לכאן בזמן שנסעתי מסומן כמו RBPJKO ו- RBPJWT, בהתאמה) היו אולם מוקרן, מושתלים עם נורמלי, פראי סוג תאים hematopoietic. החל מן השבוע 4 לאחר ההשתלה, הנמענים RBPJKO פיתח הסטה משמעותית ואחריו טחול מוגדל. למרות RBPJKO עכברים המוצגים אחוז מוגברת של אבות מיאלואידית ויטביע בשבוע 8 לאחר ההשתלה, בנקודות זמן מאוחר יותר, ניתוח של מוניטור שבועות 4 ו- 6 לא חשפו הבדלים מרשים בתוכן התאים מיאלואידית שלהם לעומת שליטה RBPJWT הנמענים. התבוננות זו, יחד עם העובדה כי Mx1-Cre מתבטא באיברים שונים hematopoietic, העלה את השאלה אם microenvironment מוניטור הייתה השפעה ישירה על אתחול של פנוטיפ myeloproliferative.
כדי לקבוע אם ויטביע היה אתר הראשוני הקריטי להתפתחות המחלה, שימשה IVFM של החילונית העכבר בשילוב עם השתלת (BMT), המודל הנוק-אאוט RBPJ ו שושלת מערכת מעקב מוניטור. העכברים הטרנסגניים לבטא EGFP תחת השליטה של יזם (Lys-GFP) ליזוזים ספציפי9 שימשו כדי להשיג תאי התורם יכול, ניתן לאבחן בזמן מוניטור הדמיה לאחר BMT. ליזוזים הביטוי הוא ספציפי התאים מיאלואידית וסימון Lys-GFP לתאים מ המייצר מיאלואידית נפוצות (CMP) בוגרת גרנולוציט13.
IVFM של ויטביע בנקודות זמן שונות הראו כי תאים Lys-GFP שני חיבורים באופן דומה לנמענים מוניטור של RBPJWT ו- RBPJKO, אבל מורחבת, engrafted מהר יותר ב הנמענים מוניטור של RBPJKO. הבדל זה היה דרמטי בנקודת זמן קודמת (לשבוע שבין 2) וירידה לאורך זמן (שבועות 4 ו- 6). עם זאת, בנקודות זמן מאוחר יותר אלה, של תא hematopoietic לאותו הנמען הראה על עלייה מתמדת במספר התאים מיאלואידית במחזור PB והערכת מותאם הטחול של עכברים RBPJKO, המציין את פלט מוגברת של תאים מ ויטביע למחזור. ניתוח של ליס-GFP תאים לוקליזציה ב ויטביע של המושתלים עכברים בגיל 6 שבועות גילה כי התאים מיאלואידית היו המתגוררים רחוק יותר להערכת microenvironment RBPJKO מאשר בפקד.
באופן קולקטיבי, השילוב של IVFM עם מודלים בבעלי חיים ספציפיים אלה מספק תובנות על הדינמיקה engraftment של התאים מיאלואידית microenvironment RBPJKO מוניטור. עיצוב ניסיוני ואת בשיטה כמותית המתוארים כאן מוצע כמו פרדיגמה שניתן להחיל כדי לטפל שאלות דומות. לדוגמה, השימוש של השושלת ספציפיים אחרים תא מעקב מודלים, כגון RAG1-GFP14 או15 Gata1-GFP עכברים, עשוי לאפשר בעקבות התנהלות הלימפה או אבות erythroid, בהתאמה, בתוך ויטביע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוצדורות הכרוכות של חיות בוצעו עם ההרשאות של טיפול בעלי חיים, להשתמש הוועדה של אינדיאנה הספר לרפואה של אוניברסיטת. ודא לדבוק החקיקה על ניסויים בבעלי חיים של המדינה שבו מתבצעת העבודה.
1. הכנת עכברים הנמען- / - Mx1CreRBPJ
- לחצות Mx1-Cre+ עכברים עם RBPJלקס/סלומון עכברים10 להשיג Mx1-Cre RBPJ-סלומון/סלומון -עכברים-12 וחיובי Mx1-Cre שלילי RBPJסלומון/סלומון הארנבונים מאותה להשתמש כפקדים. ודא את גנוטיפ ב- PCR10.
- להשתמש בשבוע 6-8-Mx1Cre בת+/RBPJסלומון/סלומון עם Mx1Cre–/RBPJסלומון/סלומון עכברים כדי לבצע את תנאי הגיוס polyI:C.
-
מזריקים polyI:C µg 200 i.p. Cre+ , יצורים– עכברים. לתת זריקה polyI:C אחת בכל יום אחר במשך 3 ימים בשבוע הראשון. לתת זריקה polyI:C אחת בשבוע השני, 7 ימים אחרי הזריקה הקודמת (ארבע זריקות סה כ).
- השתמש RBPJKO (המושרה Mx1Cre+/RBPJסלומון/סלומון) ו RBPJWT (המושרה Mx1Cre–/RBPJסלומון/סלומון) עכברים כ נמענים 3 שבועות אחרי הזריקה האחרונה polyI:C.
הערה: מומלץ להשתמש עכברים שנגזרות pI: pC 3 שבועות לאחר ההזרקה. התגובה IFNα מופעלת על ידי polyI:C גורם שינויים משמעותיים ויטביע, והתוצאה היא הרחבת immunophenotypic HSC וירידה הפלט של אבות בוגרת לתוך ה16,דם היקפיים17. ייצוג של ערכות המשנה hematopoietic הוא מנורמל 3 שבועות לאחר ההזרקה, העכברים יכול להיות מנוצל ללא תופעות מבלבלים של דלקת. פרוטוקול זה אינדוקציה מוטבה עבור RBPJ. אם מוחק גנים שונים, פרוטוקול אינדוקציה עשויים להשתנות בהתאם הבונה, מחיקה יש לאמת. אנחנו לאמת ~ 100% מחיקה של האזור RBPJ בין אתרי loxP מאת RT-PCR לאחר סך של ארבע זריקות polyI:C.
- השתמש RBPJKO (המושרה Mx1Cre+/RBPJסלומון/סלומון) ו RBPJWT (המושרה Mx1Cre–/RBPJסלומון/סלומון) עכברים כ נמענים 3 שבועות אחרי הזריקה האחרונה polyI:C.
2. הכנה של תאים במח העצם של התורם Lys-EGFP השתלת
- המתת חסד עכבר Lys-EGFP אחד (פחמן דו חמצני ואחריו נקע בצוואר הרחם) 1 או 2 h לפני ההשתלה.
- תרסיס על פני הגוף החי עם 70% אתנול.
- השתמש מספריים כירורגיים עושים חתך בעור על שתי הרגליים מסביב לקרסול, עם מלקחיים כירורגיים למשוך החוצה העור והפרווה יחד כדי לחשוף רקמת שריר נקי.
- השתמש מספריים כירורגיים כדי להסיר כמה שיותר שרירים ברגליים ככל האפשר. בעזרת מספריים, לחתוך את העצמות (ב הברך והקרסול משותפת) ולנקות את כל רקמת השריר הנותר מן עצמות הירך tibias בעזרת גזה ספוגים. מניחים את העצמות (שתי עצמות הירך ו- tibias שני) לתוך צלחת 6-ובכן המכיל DMEM 10% FBS.
- לרסק עצמות מרגמה עם PBS EDTA קר 2 מ מ 10 מ"ל, pipet תאי מח העצם כדי להביא את התאים לתוך תא בודד ההשעיה. לחלופין, לרוקן את העצמות עם 2 מ מ EDTA PBS 3 פעמים מכל צד עם מזרק 1 מ"ל.
- לסנן את התאים במח העצם באמצעות מסנן 70-מיקרומטר לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. מסנן שטיפה עם 2-3 מ"ל של PBS. ספין של התאים למטה 10 דקות ב 460 x g, resuspend התאים 10 מ"ל של טרי DMEM 10% FBS.
- לספור תאים במח העצם על hemocytometer ולהתאים את הריכוז של 1.5 x 107 תאים למ"ל בשנת IMDM ללא סרום. השתמש 3 x 106 תאים לכל חיה עם נפח של 200 µL. כ 1/3 תאים של מוניטור סה כ הם תאים מיאלואידים GFP + תאים. להשאיר את התאים על הקרח עד מוכן להזרקה. השתמש 0.5 x 105 תאים כדי לקבוע GFP הביטוי על-ידי FACS9.
3. השתלת מח עצם ליס-GFP תאים לתוך RBPJKO עכברים
- לרסן את הנמען עכברים בכלוב פאי. להאיר עכברים עם מנה קטלנית של קרינת גמא (1,200 ראד) על בעוצמה Cs 137. להשתמש בפרוטוקול מנה מפוצלת: 900 rads בשעות הערב ואחריו 300 rads למחרת בבוקר (16 שעות אחד מהשני).
- השתלת העכברים הנמען RBPJWT ו- RBPJKO אולם לקרינה h 5-6 לאחר המנה השנייה של קרינה. להזריק מוניטור תאים שנקטפו Lys-EGFP עכברים-ריכוז של 3 x 106 תאים לכל בעלי חיים דרך הזנב וריד זריקה (ראה פירוט עבור קציר תאים בסעיף 2).
- תמונה גדודים עצמאיים של עכברים המושתלים מאת IVFM בנקודות זמן שונות: 24 h, ולאחר שבועות 2, 4 ו-6, כמפורט להלן (ראה סעיף 4 & 5 עבור ויוו הדמיה ההליך).
4. ניתוח לקראת הדמיה Intravital
- לחטא כלי ניתוח. שניים בסדר מלקחיים (אחד ישר, אחד בזווית), זוג מספריים בסדר גמור וזוג אחד של מחט. להכין אזור פעיל עם כל ציוד הדרוש עבור ההליך.
- לתת זריקת הרדמה קטמין קוקטייל IP בעכבר (חריגות השירותים הווטרינריים 2.5-5 מ"ג/ק"ג + איזופרומאזין 1.0-2.5 מ"ג/ק"ג + קטמין 90-100 מ"ג/ק"ג) בעזרת מזרק המחט 26-28 גרם. חיה יהיה פיקוח כל 15 דקות במהלך ההליך, הרדמה ניתן להשלים לפי הצורך-¼ של המנה המקורית.
- הנח את העכבר על מקור חום תקין (כרית החימום של 37 ° C, חיה מוגן מפני מגע ישיר עם חימום pad) ולפקח באופן חזותי את קצב הנשימה.
- בדוק רפלקסים באמצעות הבוהן לצבוט התגובה. ודא כי החיה לגמרי תחת הרדמה לפני תחילת כל הניתוחים.
- שימוש 26-28. קוטר מחט מזרק לתת עכברים זריקה וריד הזנב של סמן וסקולרית פלורסנט (לתוספי, 100 μL של פתרון 20 מ"ג/מ"ל)
- הוטרינר העין משחה חלות על שתי העיניים. קליפ המשטח הגבי של ראשה עם קוצץ חשמלי קטן. להחיל על הסרת שיער קרם 5 דק להשתמש גזה ספוגים להסיר את השמנת ולאחר מכן לשטוף עם מי מלח. תכינו את הקרקפת נקי עם אלכוהול 70% באמצעות מקלון צמר גפן.
- להשתמש מלקחיים בסדר, מספריים לעשות חתך בעור קו האמצע קטנים (10-20 מ מ) על הקרקפת לחשוף את המשטח הגבי הגולגולת המשמש כבסיס. השתמש משי כירורגי 5-0 כדי למקם את התפרים שני בעור בכל צד של החתך, יצירת דש לחשוף את קליפת הגולגולת עבור הדמיה.
- הצב והעכברים על גבם ויציפו את הקרקפת חשוף בקערת זכוכית תחתון מלא בשמן מיקרוסקופ. תחבורה החיה mutiphoton הדמיה חדר.
- מניחים את החיה על הבמה מיקרוסקופ החילונית על המנה זכוכית מעל המטרה, ואז יכסה עם 37° C כרית החימום (חיה חייבת להיות מוגנת ממגע ישיר עם חום).
5-in Vivo הדמיה ברזולוציה גבוהה של החילונית העכבר
- השתמש מערכת קונאפוקלית הפוכה שונה עבור הדמיה multiphoton (ראה חומרים טבלה). הוראות היצרן הבא לכוון לייזר הפוטונים 2 כדי 830 nm, מקום 20 X W, נה 0.95 המטרה עדשה מיקרוסקופ האף חתיכה. ואבדוק יישור קרן לייזר.
הערה: מערכות מיקרוסקופ זקוף הנפוץ ביותר על מחקרים אלו, אך גם יכול להיות מנוצל מערכת multiphoton הפוך. במחקר זה, שימש מכשיר stereotaxic atraumatic מעוצב מותאם אישית. למרות שיש מספר התקנים זמינים מסחרית stereotaxic למערכות מיקרוסקופ זקוף, יש אין התקן stereotaxic זמינים מסחרית עבור מערכת הפוך המיקרוסקופ מכוון אבטחת הגולגולת העכבר. כחלופה למכשיר stereotaxic מותאם אישית, ניתן לאבטח את הגולגולת בעמדה מעל המטרה ניצול שיטות שונות קלטת או דבק ליציבות. - לפתוח תוכנה רכישת התמונה. בהגדרות של"רכישת" לוח בדוק אם אחת מצב סריקה כיוונית נבחרה. להגדיר את מהירות סריקה כדי 4 μs לפיקסל, קצב הפריימים כדי 512 x 512 פיקסלים, זום 1.5. בחר 20 X W נה 0.95 המטרה מהרשימה של עדשות המטרה זמין כדי להתאים את העדשה בכיוון של nosepiece.
- גישה "רשימת לצבוע" מלוח "התמונה רכישה הבקרה" ובחר "שני הפוטונים". פתח את החלון "אור נתיב & צובעת" ובחר DM690-980 עירור DM. פתח הצמצם לייזר P 2 על-ידי סימון תיבת הסימון ביחידת הלייזר 2. בחלון "מיקרוסקופ בקר", בחר RDM690 מראה.
- בחר "EPI המנורה", בחר B/G epi-מסנן קוביה ולהתמקד המטרה על גבי הדגימה כדי להמחיש את זרימת הדם ואת הגומחה מח עצם קליפת הגולגולת, באמצעות התייחסות ההסתעפות של הווריד המרכזי של (א), את התפר כלילית (b) (איור 2 א).
-
איסוף תמונות באמצעות מצב שאינו descanned. בחר 3 גלאים חיצוניים: detector1 PMT כדי לאסוף את האות SHG של קולגן (מסנן פליטה - 430/100 ננומטר), חאספ detector2 לאות GFP לאסוף (מסנן פליטה - 525/50) ו חאספ detector3 כדי לאסוף את האות של TRITC-לתוספי (מסנן פליטה - 605/90 ננומטר).
- לבצע הדמיה בקצב הסריקה של 4μs/פיקסל עם אין בממוצע כדי למזער את phototoxicity. איסוף תמונות בלייזר קבוע כוח, גלאי רווח התרגלו לנצל את מלוא הטווח הדינמי של הגלאי עם רוויה מינימלי.
- לאסוף שורה של סעיפים דרך העומק של רקמות (60 x 1 μm Z-במחסן) 6 מחוזות מח עצם קליפת הגולגולת. השתמש בהגדרות גודל צעד של 1 μm, זום 1.5 ואת גודל המסגרת 512 x 512 פיקסלים (מיקרומטר מיקרומטר x 423 423).
הערה: באופן כללי הזמן הכולל הנדרש כדי התמונה עכבר אחד היא h 1-1.5.
6. ניתוח כמותי
- לבצע את התמונה כימות ותלת מימד שחזורים באמצעות תמונות תלת-ממד/4 יח ייעודי כימות והדמיה תוכנה לפי הוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). דמיינו באופן אינטראקטיבי Z-במחסן תלת-ממד ניצול הקרנה בעוצמה מקסימלית (MIP), מיזוג אלפא או צל הקרנה אחסון עיבוד אלגוריתמים.
- קטע GFP תאים באמצעות "מודול פילוח אובייקט ספוט". החל האוסף אריתמטית עיבוד (ערוץ חיסור) לחסל את ספירת חיובי כוזב GFP תאים (זו מבטלת את האות של תאי עצם הצגת פלורסצנטיות חזקה בערוצים ירוק ואדום).
- לבצע פילוח משטח להערכת ועצם באמצעות המודול פילוח של פני השטח. אם נדרש, לחשב מרחקים של תאים לכל אחת המשטחים לעיל על-ידי החלת אלגוריתמים X-מתח שנקרא "מרחק של ספוט אל פני השטח".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
גדודים של 2 RBPJKO, 2 RBPJWT נמענים היו עם תמונה בהפעלה הדמיה בודדים בנקודות זמן שונות: 24 שעות ביממה ו- 2, 4 ו- 6 שבועות לאחר ההשתלה של תאים מוניטור Lys-GFP (זרימת עבודה מודגם ב איור 1A).
כל עכבר, נרכשו תמונות מאזורים תקן 6 החילונית מוניטור, המזוהה על-ידי מיקומם ביחס ההסתעפות של הווריד המרכזי (איור 2 א, ), את התפר כלילית (איור 2 א, ב'). הזרקה של לתוספי טקסס-אדום לפני הדמיה מאפשר זיהוי אלה ציוני דרך הבחירה של 6 אזורים (איור 2 א): השמאלית העליונה, בינוני, נכון (UL, UM, UR), ואת השמאלית התחתונה, בינוני ונכון (LL, LM, LR). 60 x 1 μm z-במחסן שנאסף בכל אזור, מעובד כמו תלת-ממדי מקסימלי עוצמת הקרנה (MIP), (איור 2B); הקרנה צל תלת-ממדי, הכולל את העצם הרכיב (אפור) שנוצר על ידי מיקרוסקופ הרמונית דור (SHG) השני חיטוט קולגן הארגון (איור 2C); לבסוף, תלת-ממדי Segmented תמונה, אשר מאפשר כימות של תאים ומדידת מרחקים שלהם מן העצם בכלי הדם (איור דו-ממדי).
בגלל ההבדלים הפוטנציאליים בהעדפות ביות של תאים hematopoietic באזורים שונים של החילונית מוניטור לאחר ההשתלה, חשוב לדגימת אזורים מרובים בהחילונית של העכבר בכל. איור 3 מראה דוגמה של חלוקת תאים באזורי 6 מנותח RBPJWT אחד, נמען אחד RBPJKO ב 2 שבועות לאחר BMT (ירוק - התאים מיאלואידית, אפור-עצם) באמצעות אלגוריתם 3עיבוד היטל הצל. מספר התאים לפי אזור נע מ 64 עד 258 העכבר RBPJWT ומ 265 כדי 573 העכבר RBPJKO. התוצאות הסופיות מבוטא ואז המספר הממוצע של האזורים 6 ניתחו: מספר של תאים לכל אזור / per העכבר (ממוצע 135 ב RBPJWT לעומת 469 ב- RBPJKO). ניסוי זה נציג מציין כי יש וריאציה גדולה יותר בחלוקת התא לכל אזור RBPJWT יותר של הנמען RBPJKO. יתר על כן, בנוסף וריאציית נמצאו באזורים קליפת הגולגולת בתוך עכבר, אשר נפוצה, ישנם וריאציות בין עכברים בודדים בתוך אותה קבוצה. לכן, חשוב כי עבור כל נקודת זמן עכברים לפחות 4 עוברים הערכה לכל ניסוי כדי להשיג מינימום של אזורים 24 עד 30 סה כ כדי להיות מנותח לכל תנאי.
איור 4 מציג את הדינמיקה של קדמון מיאלואידית הרחבה חריץ פגומים מוניטור microenvironment לעומת שליטה מעל 6 שבועות לאחר ההשתלה. בניסוי זה נציג, 8 RBPJWT ועכברים RBPJKO 8 היו מושתלים, עם תמונה בנקודות הזמן המצוין (שני עברים RBPJWT, שני עברים RBPJKO בכל נקודה בזמן). איור 4A מציג שחזור תלת-ממדי נציג של 1 מתוך 6 אזורים רכשה. לתאים בכל האזורים 6 נספרו, המספר הממוצע של תאים/אזור של שני עכברים בכל נקודה בזמן (סה כ 12 אזורים) מחושב עבור נמענים RBPJWT ו- RBPJKO (איור 4C). ניתוח זה עולה כי: (i) בתאי התורם Lys-GFP נמענים RBPJWT ו- RBPJKO יש יעילות דומה של ביות; ii) התאים המושתלים RBPJKO להרחיב במהירות רבה יותר ויש מספר כפול של התאים המושתלים RBPJWT בשבוע 2 לאחר BMT; iii) בתאים RBPJWT נמענים להרחיב מאוחר יותר והם קיפול כפול גבוה יותר מאשר בתאי RBPJKO נמענים בשבוע 4 לאחר BMT; ו- iv) את המספר בהן RBPJWT והן RBPJKO הנמענים הופכים דומים בשבוע 6 לאחר BMT. ניתוח של התאים מיאלואידית תורם PB מציין תפוקה גבוהה יותר של התאים מיאלואידית מהנמענים מוניטור של RBPJKO יותר מהנמענים מוניטור של RBPJWT בשבוע 4, בזמנו כאשר העכברים מוניטור של RBPJKO הראו את התוכן נמוכה יותר של תאים Lys-GFP. הניתוח המשולב של התאים מיאלואידית תושבי ויטביע ושל התאים מיאלואידית במחזור חמאת בוטנים, מצביעים על כך ב ויטביע RBPJKO microenvironment ליס-GFP תאים הרחב מוכן לגייס במהירות רבה יותר. ניתוח FACS מקבילים של תאים Lys-GFP בעצמות ארוכות מוניטור מן העכברים אותו הראו מגמה דומה לזה שנצפה על ידי IVFM; עם זאת, ההבדלים בין התנאים היו שפחות מודגשת (איור 4B).
מדידה של המרחק של תאים בודדים Lys-GFP מן העצם או את להערכת מוצג באיור5. במחקר זה נציג, שימש ניתוח תלת-ממדי פילוח של האזור LM של קליפת הגולגולת RBPJWT ו- RBPJKO-6 שבועות מן BMT (איור 5A). מרחק העצם ולכלי חושבו עבור כל תא באזור: 200 תאים RBPJWT, 255 התאים ב- RBPJKO, לפיכך, המבוטא ממוצע. ניתוח הנתונים מראה כי תאים Lys-GFP לשפה במרחק דומה מן העצם בעכברים RBPJWT ו- RBPJKO (11 μm), אבל הן שוכנות רחוקים יותר מכל להערכת בעכברים RBPJKO מאשר בעכברים RBPJWT (15 μm לעומת 5 μm, בהתאמה). תוצאה זו הוא מסקרן, כמו ב- RBPJKO עכברים Lys-GFP תאים גייסה למחזור יותר בעכברים RBJWT, וכך וכך ניתן לצפות בתרגום קרוב כדי כלי. עם זאת, זה אפשרי כי ההבדל בלוקליזציה משקף במה שונים של הבידול של אלה שתי האוכלוסיות (ב RBPJWT ו RBPJKO), בשלב זה יכולות להתבצע על ידי ניתוח זה. המשמעות של תוצאה זו להיות כוללים את מאגר גדול יותר של תאים בכל האזורים 6 ועל ידי שילוב של ניתוח FACS.
באופן כללי, שיוצרת התוצאות מתקבלים כאשר מספר קטן של אזורים מנותחים לכל העכבר. הדמיה היא במיוחד בנקודות זמן מוקדם בעקבות BMT, כמו הקרנה קטלני נזקים להערכת את דליפת לתוספי של נימים מפחית את התמונה בחדות. לכן חשוב שתהיה כמות גדולה של חזרות, במיוחד בנקודות הזמן המוקדם ביותר.
SHG הוא כלי שימושי עבור חוקרים הארגון סיבי קולגן ב- 3D. זה מסדר שני לא לינארית אופטי תהליך אשר מקורו של מבנים כגון סיבי קולגן פו-טי אי-צנטרוסימטריות ומקדם גבוה של לא-לינאריות מסדר שני. כאשר אור התקרית אינטנסיבי אינטראקציה עם מבנים אלו, שהיא מייצרת אור פעמיים את תדירות התקרית או חצי אורך הגל התקרית. לכן, אין תיוג נדרשת על מנת ללכוד את האות SHG במהלך 2-פוטון מיקרוסקופ. עם 830 nm עירור אורך גל, לנו ללכוד את האות SHG ערוץ הצבע הכחול עם פליטה מסנן 430/100 ננומטר.
איור 1: זרימת עבודה ניסויית. (א) אינדוקציה של Mx1-Cre/RBPJ עכבריםלקס/סלומון להפיק RBPJKO ו- RBPJWT עכברים ~ 4 שבועות מראש הדמיה; (B) הכנה של מוניטור תאים מן העכברים הטרנסגניים Lys-GFP; (ג) השתלת של מוניטור Lys-GFP תאים לתוך אולם לקרינה RBPJKO או RBPJWT נמענים; (ד) IVFM של קליפת הגולגולת העכבר-24 שעות, 2, 4, 6 שבועות לאחר BMT, ואחריו המתת חסד וניתוח מוניטור מאת FACS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: IVFM של הגומחה וסקולרית BM. (א) התמונה פוטון מרובה פסיפס של קליפת הגולגולת העכבר Lys-EGFP מציג את האזורים תקן 6 של הדמיה (UL: השמאלי, UM העליון: התיכון העליונה, UR: העליון נכון, LL: להוריד שמאלה, LM: להוריד את התיכון, LR: הימנית התחתונה) (התאים מיאלואידית ירוק, אדום, להערכת; אפור, עצם) 10 X הגדלה; (B-D) מוניטור נישה פירוט שיאריך: MIP (B), השלכה צל תלת-ממדי (C), התמונה פילוח תלת-ממדי (D). תמונות עובדו - באמצעות תמונות תלת-ממד/4 יח ייעודי כימות והדמיה תוכנה (טבלה 1). גודל ברים = μm 50 B, C, ד אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Engraftment התאים מיאלואידית בשבוע 2- תמונות של ליס-GFP תאים (ירוק) ועצם פני השטח (אפור) באזורים מוניטור 6 מן העצם קליפת הגולגולת של RBPJWT אחד, עכבר אחד RBPJKO (u: העליונה, l: שמאל, מ': התיכון, r: נכון). גודל ברים = 50 μm. מהגרפים (מימין) מציינים את מספר התא שנספרו בכל אזור (טווח RBPJWT 64-258; RBPJKO טווח 265-573), שלהם STD המספר הממוצע 135 + /-73, 469 STD + /-121. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: קינטיקה של התאים מיאלואידית Engraftment ובעקבות פלט BMT. (א) תמונות של ליס-GFP תאים (ירוק), עצם משטח (אפור) באזור נציג אחד מן החילונית של עכבר RBPJWT ו- RBPJKO אחד בכל הנקודות הזמן המצוין. גודל ברים = 50 μm; (B) נקודה לחומה הצג אחוז Lys-GFP תאים חיוביים על ידי cytometry זרימה בתוך ויטביע של עצמות ארוכות שנקטפו באותו העכבר עם תמונה ויוו (מעל). (ג) מגרפים מצביעים על המספר הממוצע של תאים/אזור בעכברים 2 (סה כ 12 אזורים) בכל נקודה בזמן, + /-סטנדרטי (D) קו גרף קיפול עלייה המספר הכולל של נויטרופילים (לספור במונה תא) הציג את PB של העכברים אותו מ ב (א) בנקודות זמן שצוין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: לוקליזציה של התאים מיאלואידית היחסית מוניטור עד העצם וכדי להערכת את. (א) נציג תמונות מקוטע תלת-ממדי של תאים Lys-GFP, להערכת, ו ליס-GFP תאים ועצמות באותו אזור של קליפת הגולגולת עצמות של נמענים RBPJWT ו- RBPJKO בשבוע 6 מ BMT. גודל ברים = 50 μm. (B) גרף מסכם את המרחק הממוצע ב μm + /-SEM של ליס-GFP תאים מן השטח העצם או את להערכת. מספר התאים נמדד: RBPJWT n = 200 תאים ו- RBPJKO n = 255 התאים. מרחק של תאים Lys-GFP להערכת גדול ב RBPJKO מ RBPJWT עכברים, p < 0.001 (-t-test של התלמיד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר בעל עיצוב ניסיוני אופטימיזציה ללמוד את קינטיקה של תאים hematopoietic engraftment על ידי מיקרוסקופ נמכרות Intravital. במחקר זה, הרחבת ובתאים מיאלואידית ונדירה של מוניטור WT או בכל חריץ איתות מוניטור פגום היה מסומנים בהחילונית עצם על ידי הבאים Lys-GFP התאים מיאלואידית חיובי לאחר BMT אל נמענים RBPJWT או RBPJKO. גישה זו מוצע מודל שניתן להחיל על שאלות דומות, לדוגמה: אני) כדי לקבוע את ההרחבה ואת לוקליזציה בתוך גומחות מוניטור של תאים של שושלות אחרות, כגון erythroid הלימפה, או תאים megakaryocytic, באמצעות כמו תאי התורם תאים hematopoietic נושאת שושלת היוחסין הספציפי היזמים נוהג GFP או עגבניות-אדום; ii) כדי להעריך גורמים שונים מיקרו-סביבתי באמצעות קו מסוים או העכברים הטרנסגניים אחרים כמו נמענים.
כוחו של פרוטוקול זה הדמיה העצם קליפת הגולגולת, היא כי ציוני הדרך אנטומיים משמש כדי לבחור את האזורים מוניטור, נגע הסתעפות של הווריד המרכזי, את התפר כלילית, סביר נשמרים בעכברים כל, המתיר עקביות בין הפרט ניסויים תוך מוותרים על הדרישה של שלב אוטומטית. בנוסף, השימוש של דגם ה-GFP כדי לעקוב אחר תאים hematopoietic הוכיח כיעיל מאוד, כאמור GFP אות יציב בתנאים שיוצרת, כמו לאחר הקרנה. לבסוף, תיאר הסידור הדמיה, באמצעות מיקרוסקופ הפוך התקן stereotaxic מותאם אישית שבו העכבר הוא במצב פרקדן, למזער באופן משמעותי נשימה חפצים.
שני היבטים של עיצוב ניסיוני זה, אם תיושם, עלול להוביל שימוש רחב יותר ויעיל יותר של IVFM של החילונית. ראשית, יהיה חשוב למטב, לתקנן את הפרוטוקולים של האורך הדמיה המאפשר התבוננות העכבר אותו בנקודות זמן שונות (מיום 2 מספר שבועות) לאחר התערבות (קרי BMT או טיפול) במקום להשתמש גדודים עצמאיים של עכברים. גם גישה זו דורשת תנאים מתאימים עבור שחזור לאחר הניתוח ושימוש באמצעים כדי לנטרל דלקת, זיהום, צלקת היווצרות באתר הדמיה, היישום שלה מוגבלת כעת. שנית, זה יהיה יקר לפתח מערך של שושלת היוחסין מעקב העכבר מודלים נושאת חלבונים פלואורסצנט תאים מסוימים של הגומחה מוניטור (לב וכלי דם, endosteal, perivascular ו עצביים) לשלב תא hematopoietic פונקציות ספציפיות מאפייני גומחות מוניטור.
הדמיה של העצם יש עדיין כמה אתגרים והמגבלות בהשוואה לרקמות אחרות. למרות מיקרוסקופ שני הפוטונים יכולים לחדור רקמות עמוק בתוך 100-1000 מיקרון, זה עדיין מאתגר את התמונה דרך כל עובי העצם קליפת הגולגולת. תמונות לאבד איכות עם הגדלת עומק אז פרוטוקול כאן מתאר ניתוח אמין של מוניטור אזורים הערימות עבה 60 מיקרון. גורם נוסף שיכול לגרום חוסר עקביות או הדמיה שיוצרת הוא מעוקל צורת העצם קליפת הגולגולת, אשר יכול להביא את התמונה מחוץ לפוקוס. חשוב לקיים את הגולגולת ממוקם בצורה מושלמת על המנה זכוכית מעל המטרה, אולי באמצעות מכשיר stereotaxic. אכן, חשוב גודל הגולגולת: הגולגולת של עכברים צעירים מדי או קטן מדי עלול לא מתאימות בצורה מושלמת stereotaxic התקן מסוים. לדוגמה, המכשיר מנוצל כאן אינה מתאימה לגילאים 6 שבועות ולא פחות מ 20 גרם עכברים.
הגבלה נוספת הוא מערכת ההדמייה מנוצל במחקר זה הוא מוגבל ל- 3 ערוצים. כמו ערוץ הצבע הכחול מוקצית באופן אוטומטי כדי לאסוף את אי-תיוג מבוסס SHG אות של הקולגן העצם, רק 2 ערוצים זמינים עבור תיוג פלורסצנטיות ספציפיים. בנוסף, מערכת זו יש מגבלה מהירות של מסגרת/ש' 1-2 μs לפיקסל להתעכב זמן ואת גודל המסגרת 512 x 512 פיקסלים, אשר אינה אידיאלית עבור תהליכים דינאמיים מהר (כגון מידת זרימת הדם והערכת תא גיוס בזרם הדם).
אתגר משמעותי הוא ההקרנות שבוצעה עבור BMT פשרות על להערכת התקינות. נוכח ויטביע לאחר הקרנה לדליפת דם גורם קשיים עם פילוח/כימות של מבנים בודדים, אשר יכול להוות קושי בניתוח כמותי.
לבסוף, חשוב לקחת בחשבון כי הדמיה של עכבר אחד לוקח כ 1 h, המספר של עכברים יכולים לדימות ביום נתון הוא מוגבל (עכברים ~ 4-6). לפיכך, הגדלת גודל המדגם כדי להשיג כוח של ניתוח עשויים לדרוש מספר ניסויים עצמאית, אשר יכול להגביר את השתנות.
בעקבות פרוטוקול זה, מספר התאים hematopoietic ליס-GFP+ תאים זוהה על ידי IVFM ב ויטביע לאחר 24 שעות של BMT ~ 30 תאים/אזור וזה הוא די מספר קטן בהשוואה קלט הראשונית של תאים (3 x 106). אמנם, חלק מהבעיה תופיפצה תא השמנה בריאה והוא כבד לפני יונת ויטביע בעקבות הזרקת עירוי, נותר להיחקר אם ישנם אזורים החילונית שונים מאלה שנבחרו בו התאים המושתלים בבית גבוה יותר יעילות.
יונת, engraftment של תאים לתוך ויטביע לאחר BMT בדרך כלל ואחריו cytometry זרימה על ידי מדידה של סמנים CD45.1/CD45.2, ה-GFP, אסתר succinimidyl Carboxyfluorescein (CFSE) או שילוב של שושלת היוחסין וסמנים תאי גזע. השימוש IVFM, במיוחד בנקודות זמן מוקדם, הופך זמין מידע נוסף וייחודי זה לא יכול להיות מסופק על ידי cytometry זרימה. לדוגמה, לעתים קרובות זה לא קל להבחין על ידי אירועים FACS "תאים" אירועים "חפצים", בפרט כאשר נאסף מספר נמוך של אירועים חיוביים (קרי -24 שעות ביממה מ BMT). IVFM מספק מידע על מורפולוגיה ולוקליזציה של התאים מסייע הבחנה זו. באופן דומה, FACS ניתוח של תאים hematopoietic מוניטור לקצור ידי שטיפה או להתרסק העצמות יכלול התאים היו המתגוררים הגומחה תאים שהיו כבר במחזור מערכת כלי הדם. אכן, IVFM מאפשר את ההבחנה והערכה של תאים נחים בתוך נישה מוניטור, תאים מגייסים כוחות למחזור הדם. הבחנה זו היא בעלת ערך רב כשלומדים את קינטיקה של יונת, לוקליזציה, בידול, גיוס במודל נתון. חשוב, IVFM יכול לספק מידע ייחודי על המיקום של התאים hematopoietic ביחס התאים microenvironment ומהווה נישה מסויימת.
שיטות אחרות ששימשו לפנות את ההרכב של הגומחה מוניטור, ניתוח היסטולוגית מסוג שימשו. השוואה בין intravital מיקרוסקופיה של ויטביע וניתוח היסטולוגית מאת מיקרוסקופיה קונפוקלית ביסודיות, באלגנטיות נדון על ידי Lo סלסו. et al. 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
הדמיה התבצע במרכז אינדיאנה על מיקרוסקופ ביולוגי באוניברסיטת אינדיאנה, בבימויו של ד ר קן דאן. המכשיר stereotaxic הוא אב טיפוס ועוצב על ידי מארק Soonpaa, וולס המרכז לחקר רפואת ילדים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), המחקר MPN קרן (NC), שיתוף פעולה CTSI פרויקט IUSM/נוטרה דאם (NC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine cocktail | IU School of Medicine | Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg | |
| TRITC dextran | Tdb Consultancy | TD150-100mg | Other color dextran may be used. |
| Andis hair trimmer | Braintree Scientific | CLP-323 75 | |
| Gauze sponge | Med Vet International | PK224 | 4-ply, 2 x 2 |
| Nair depilatory cream | Commercial store | ||
| Saline | Med Vet International | RXSAL-POD1LT | 0.9% Sodium Chloride poly bottle |
| Insulin syringe | Fisher Scientific | 14-826-79 | 28 g, 1/2 cc |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 00108-11, 00109-11 | straight forcep, angled forcep |
| Scissor | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| 5-0 silk suture | Fisher Scientific | MV-682 | Other non-absorbable suture may be used |
| WillCo- glass bottom dish | WillCo | GWSt-5040 | |
| Optical microscope oil | Leica | ||
| Stereotaxic stage insert | IU School of Medicine | Custom design | |
| Olympus FV1000 confocal microscope system | Olympus | ||
| Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective | Olympus | ||
| Small heating pad | Commercial store | Zoo Med reptile heating pad | |
| Imaris 8.1 imaging software | Bitplane | 3/4 D Image Visualization and Analysis software |
References
- Carlesso, N., Cardoso, A. A. Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).
- Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Naveiras, O., et al. Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).
- Scheiermann, C., et al. Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues. Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 716-726 (2000).
- Han, H., et al. Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision. Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
- Wang, L., et al. Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner. Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).
- Miyamoto, T., et al. Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment. Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).
- Luc, S., et al. Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential. Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).
- Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation. Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).
- Essers, M. A., et al. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).
- Pietras, E. M., et al. Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons. J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. J Vis Exp. (91), e51683 (2014).
