Combinando a microscopia Intravital fluorescente (IVFM) com modelos genéticos para estudar a dinâmica de enxertia das células hematopoiéticas para nichos de medula óssea

Resumo

Microscopia de fluorescência intravital (IVFM) da calvária é aplicada em combinação com modelos de animais geneticamente para estudar o homing e enxertia das células hematopoiéticas em nichos de medula óssea (BM).

Resumo

Aumentando a evidência indica que hematopoiese normal é regulada por distintas pistas microenvironmental na BM, que incluem especializados nichos celulares modulando funções de células-tronco hematopoiéticas crítico (HSC)^1,2. De fato, uma imagem mais detalhada do microambiente hematopoiético está a emergir, no qual o endosteal e nichos endoteliais formam unidades funcionais para a regulação da HSC normal e sua progênie^3,4,5 . Novos estudos têm revelado a importância das células perivasculares, adipócitos e células neuronais para manutenção e regulamenta HSC função^6,7,8. Além disso, há evidências de que células de linhagens diferentes, ou seja, células mieloides e linfoides, lar e residam em nichos específicos dentro do microambiente BM. No entanto, um mapeamento completo do microambiente BM e seus ocupantes ainda está em andamento.

Cepas de rato transgênicas expressando marcadores fluorescentes específicos de linhagem ou camundongos geneticamente modificados para falta de moléculas selecionadas em células específicas do nicho BM estão agora disponíveis. Mata-mata e linhagem rastreamento modelos, em combinação com abordagens de transplante, proporcionam a oportunidade de aperfeiçoar o conhecimento sobre o papel dos específicos "nicho" de células para populações hematopoiéticas definidas como HSC, células B, células T, células mieloides e eritroide de células. Esta estratégia pode ser ainda mais potencializada, mesclando-se o uso da microscopia de dois fotões da calvária. Fornecendo imagens de alta resolução na vivo e renderização 3D da calvária BM, agora podemos determinar precisamente o local onde subconjuntos específicos hematopoiéticos para casa em BM e avaliar a cinética de sua expansão ao longo do tempo. Aqui, Lys-GFP ratos transgénicos (marcação de células mieloides)⁹ e RBPJ mata-mata ratos (falta de sinalização de entalhe canônico)¹⁰ são usados em combinação com IVFM para determinar a enxertia das células mieloides de um microambiente BM defeituoso de entalhe.

Introdução

Microscopia de fluorescência do multiphoton intravital (IVFM) é uma poderosa técnica de imagem que permite para o de alta resolução, em tempo real de imagens de tecidos com profundidade de até 1mm, dependendo do tecido. Quando aplicado a calvária de rato, permite observar o comportamento das células hematopoiéticas dentro da BM de forma não-invasiva acima de 60-100 μm¹¹. Esta abordagem é usada aqui para determinar a cinética de enxertia de progenitores mieloides normais nos ratos nocaute BM de RBPJ falta canônica de sinalização Notch.

Trabalho recente do nosso grupo demonstrou que defeituoso sinalização de entalhe ca....

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem a utilização de animais foram realizados com autorização do cuidado Animal e usar o Comité da Indiana University School of Medicine. Certifique-se para aderir à legislação na experimentação animal do país onde o trabalho é realizado.

1. preparação dos ratos de destinatário Mx1CreRBPJ^{- / -}

1. Cruzar os ratos Mx1-Cre⁺ com RBPJ^{salmão/salmão} ratos¹⁰ para obter Mx1-Crenegativo para positivo ^{RBPJsalmão/salmão} ratos¹² e Mx1-Cre littermates de^{salmão/salmão} RBPJ para usar como contro....

Resultados

Coortes de 2 RBPJKO e 2 RBPJWT de destinatários foram fotografadas em uma sessão individual de imagens em pontos diferentes do tempo: 24h e 2, 4 e 6 semanas após o transplante de células de BM Lys-GFP (fluxo de trabalho é ilustrado na figura 1A).

Em cada rato, imagens foram adquiridas de 6 regiões padrão da calvária BM, identificado por sua posição em relação a bifurcação da veia central (Figura 2A

Discussão

Este protocolo descreve um delineamento experimental otimizado para estudar a cinética da enxertia de células hematopoiéticas por microscopia Intravital fluorescente. Neste estudo, a expansão de células progenitoras mieloides em um BM WT ou em um entalhe sinalização defeituoso BM foi controlada a calvária óssea por células mieloides positivas seguintes de Lys-GFP após TMO em destinatários RBPJWT ou RBPJKO. Esta abordagem é proposta como um modelo que pode ser aplicado para responder a perguntas semelhantes, por exemplo: .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Coquetel de cetamina	IU School of Medicine		Cetamina 90-100 mg / kg, xilazina 2,5-5,0 mg / kg, Acepromazina 1,0-2,5 mg / kg
TRITC dextrano	Tdb Consultoria	TD150-100mg	Outra cor dextrana pode ser usada.
Aparador de cabelo Andis	Braintree Scientific	CLP-323 75
Esponja de gaze	Med Vet International	PK224	4 camadas, 2 x 2
Creme depilatório Nair	Loja
Saline	Med Vet International	RXSAL-POD1LT	0,9% Cloreto de sódio frasco poli
Seringa de insulina	Fisher Scientific	14-826-79	28 g, 1/2 cc
Fórceps Fino	Ferramentas de Ciência Fina	00108-11, 00109-11	fórceps reto, fórceps angular
Tesoura	Ciência Fina	15018-10
Porta-agulha	Ferramentas de Ciência Fina	12002-14
5-0 sutura de seda	Fisher Scientific	MV-682	Outra sutura não absorvível pode ser usada
WillCo- prato de fundo de vidro	WillCo	GWSt-5040
Óleo de microscópio óptico	Leica
Inserção de platina estereotáxica	IU School of Medicine	Design
personalizado Olympus FV1000 sistema de microscópio confocal	Objetivo Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95	Olympus
Pequena almofada de aquecimento	Loja		Zoo Med réptil almofada de
aquecimento Imaris 8.1 software de imagem	Bitplane		3/4 D Software de visualização e análise de imagem

comercial Ferramentas de comercial