Summary
Intravital fluorescensmikroskopi (IVFM) av calvarium används i kombination med genetiska djurmodeller studera homing och engraftment av hematopoetiska celler i benmärgen (BM) nischer.
Abstract
Ökande bevis indikerar att normala blodbildningen regleras av distinkta microenvironmental ledtrådar i BM, som omfattar specialiserade cellulära nischer modulerande kritiska hematopoetiska stamceller (HSC) funktioner1,2. Faktiskt, en mer detaljerad bild av den hematopoetiska mikromiljö växer nu fram, där de endosteala och endotel nischer utgör funktionella enheter för regleringen av normal HSC och deras avkomma3,4,5 . Nya studier har visat vikten av perivaskulär, adipocyter och neuronala celler att underhålla och reglera HSC funktion6,7,8. Dessutom finns det bevis för att celler från olika härstamningar, dvs myeloiska och lymfoida celler, hem och uppehålla sig inom specifika nischer inom den BM mikromiljö. En fullständig kartläggning av den BM närmiljön och ombordvarande är dock fortfarande pågår.
Transgena möss stammar uttrycker härstamning specifika fluorescerande markörer eller möss genetiskt konstruerade för att saknar markerade molekyler i specifika celler i BM nisch finns nu tillgängliga. Knock-out och härstamning spårning modeller, i kombination med transplantation metoder, ger möjlighet att förfina kunskapen om specifika ”nisch” roll celler för definierade hematopoetiska befolkningar, såsom HSC, B-celler, T-celler, myeloida celler och erytroid celler. Denna strategi kan förstärkas ytterligare genom en sammanslagning av användning av 2-foton mikroskopi av calvarium. Genom att tillhandahålla i vivo hög upplösning imaging och 3D-rendering av den BM calvarium, kan vi nu bestämma just den plats där enskilda hematopoetiska undergrupper hemma i BM och utvärdera kineticsen av sin expansion över tid. Här, Lys-GFP transgena möss (märkning myeloida celler)9 och RBPJ knock-out möss (saknar kanoniska Notch signalering)10 används i kombination med IVFM för att bestämma engraftment av myeloida celler till en Notch defekt BM mikromiljö.
Introduction
Intravital multiphoton fluorescensmikroskopi (IVFM) är en kraftfull imaging teknik som möjliggör den högupplösta, realtid imaging av vävnader med djup upp till 1mm, beroende på vävnaden. När tillämpas på mus calvarium, tillstånd det att observera beteendet hos de hematopoetiska cellerna inom BM i ett icke-invasivt sätt upp till 60-100 μm11. Detta tillvägagångssätt används här att bestämma kineticsen av engraftment av normala myeloida i de BM av RBPJ knock-out möss som saknar kanoniska Notch signalering.
Senaste arbete från vår grupp visat att defekta kanoniska Notch signalering i BM mikromiljö leder till en myeloproliferativ-liknande sjukdom12. Förlust av Notch signalering erhölls genom villkorad radering av DNA bindande domän RBPJ, den kritiska transkriptionsfaktor nedströms av kanoniska Notch signalering, använder Mx1-Cre inducerad rekombination10. I denna studie användes Mx1-Cre/RBPJlox/lox möss modellen. Villkorliga radering av DNA-bindande motiv av RBPJ resulterar i förlust av signalering från alla Notch receptorer. I Mx1-Cre modellen, Cre uttryck drivs av promotorn Mx1 aktiveras vid administrering av polyI:C resulterar i induktion av riktade gene borttagning i blodkroppar samt liksom stromal komponenter av flera organ, inklusive BM, mjälten och levern.
Mx1-Cre+/RBPJlox/lox och Mx1-Cre–/RBPJlox/lox möss inducerad med polyI:C (härefter anges som RBPJKO och RBPJWT, respektive) var dödligt bestrålade och transplanteras med normala, vildtyp hematopoetiska celler. RBPJKO mottagare från vecka 4 efter transplantation, och utvecklat betydande leukocytos följt av splenomegali. Även om RBPJKO möss presenteras ökade andelen myeloida i BM vid 8 veckor efter transplantationen och vid senare tidpunkter, visade analys av BM vid vecka 4 och 6 inte slående skillnader i deras myeloida cellinnehåll jämfört med kontroll RBPJWT mottagare. Denna observation, tillsammans med det faktum att Mx1-Cre uttrycks i olika hematopoetiska organ, tog upp frågan om den BM mikromiljö haft direkt inverkan på inledandet av myeloproliferativa fenotypen.
För att avgöra huruvida BM var kritiska första plats för sjukdomsutvecklingen, användes IVFM av mus calvarium i kombination med BM transplantation (BMT), RBPJ knock-out modellen och en släktlinje spårningssystem. Transgena möss att uttrycka andra under kontroll av den specifika lysozym arrangör (Lys-GFP)9 användes för att få givare celler som kan visualiseras under BM imaging efter BMT. Lysozym uttryck är specifika för myeloida celler och Lys-GFP markerar celler från den gemensamma myeloida stamceller (CMP) till mogen granulocyt13.
IVFM av BM vid olika tidpunkter visat att Lys-GFP celler homed på samma sätt till BM av RBPJWT och RBPJKO mottagare, men expanderade och rekonstituerades snabbare i BM av RBPJKO mottagarna. Denna skillnad var dramatisk vid den tidigare tidpunkten (vecka 2) och minskade över tid (veckor 4 och 6). Dock vid dessa senare tidpunkter, utvärdering av hematopoetiska facket på samma mottagare visade en stadig ökning av antalet myeloida celler som cirkulerar i PB och lokaliserade i mjälten hos RBPJKO möss, vilket indikerar en ökad produktion av celler från BM i cirkulationen. Analys av Lys-GFP celler lokalisering i BM av transplanterade möss på 6 veckor visade att myeloida celler var bosatta längre från kärlsystemet i den RBPJKO närmiljön än i kontrollen.
Sammantaget gav kombinationen av IVFM med dessa specifika djurmodeller insikter i engraftment dynamik av myeloida celler i den RBPJKO BM mikromiljö. Experimentell design och kvantitativ metod beskrivs här föreslås som ett paradigm som kan användas för att ta itu med liknande frågor. Exempelvis användning av andra cell specifika härstamning spårning modeller, såsom RAG1-GFP14 eller Gata1-GFP15 möss, tillåta efter uppförandet av lymfoida eller erytroid progenitorceller, respektive i BM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som inbegriper användning av djur utfördes med tillstånd av djur vård och använda kommittén av Indiana University School of Medicine. Se till att följa lagstiftningen om djurförsök i det land där arbetet utförs.
1. beredning av Mx1CreRBPJ- / - mottagare möss
- Korsa Mx1-Cre+ möss med RBPJlox/lox möss10 att få Mx1-Crepositiva RBPJlox/lox möss12 och Mx1-Cre negativa RBPJlox/lox littermates att använda som kontroller. Verifiera genotypen av PCR-10.
- Använd 6-8 veckan-gamla Mx1Cre+/RBPJlox/lox och Mx1Cre–/RBPJlox/lox möss att utföra polyI:C med induktion.
-
Injicera polyI:C 200 µg i.p. i Cre+ och Cre– möss. Ge en polyI:C injektion varannan dag i 3 dagar första veckan. Ge en polyI:C injektion vecka 7 dagar efter föregående injektion (fyra injektioner sammanlagt).
- Använda RBPJKO (inducerad Mx1Cre+/RBPJlox/lox) och RBPJWT (inducerad Mx1Cre–/RBPJlox/lox) möss som mottagare 3 veckor efter den sista injektionen i polyI:C.
Obs: Det rekommenderas att använda möss som induceras av pI: pC 3 veckor efter injektionen. IFNα responsen utlöses av polyI:C inducerar betydande förändringar i den BM, vilket resulterar i en immunophenotypic utbyggnad av HSC och minskade produktionen av mogen stamfäder i perifert blod16,17. Representation av hematopoetiska delmängder är normaliserade 3 veckor efter injektion och mössen kan utnyttjas utan de störande effekterna av inflammation. Detta induktion protokoll har optimerats för RBPJ. Om du tar bort en annan gen, protokollet induktion kan variera beroende på konstruktionen, och borttagningen måste valideras. Vi validerat ~ 100% borttagning av regionen RBPJ mellan loxP platser genom RT-PCR efter totalt fyra polyI:C injektioner.
- Använda RBPJKO (inducerad Mx1Cre+/RBPJlox/lox) och RBPJWT (inducerad Mx1Cre–/RBPJlox/lox) möss som mottagare 3 veckor efter den sista injektionen i polyI:C.
2. beredning av Lys-andra givare benmärgsceller för Transplantation
- Avliva en Lys-andra mus (koldioxid följt av cervikal dislokation) 1 eller 2 h innan transplantation.
- Spraya på djurens kroppsyta med 70% etanol.
- Använd kirurgisk sax göra ett snitt i huden på båda benen runt ankeln och med kirurgisk pincett drar bort hud och päls tillsammans för att exponera ren muskelvävnad.
- Använd kirurgisk sax för att ta bort så mycket muskler på benen som möjligt. Med en sax, klippa benen (på knäet och fotleden) och rengör eventuella återstående muskelvävnad från lårbenet och skenbenet med gasväv svampar. Placera ben (två lårbenet och två förbenade) i en 6-well platta innehållande DMEM 10% FBS.
- Krossa benen i en mortel med 10 mL kallt 2mM EDTA PBS och Pipettera benmärgsceller för att få celler i encelliga suspension. Alternativt, spola benen med 2 mM EDTA PBS 3 gånger från varje sida med en 1 mL spruta.
- Filtrera benmärgscellerna använder ett 70 µm filter i en 15 mL centrifugrör. Skölj filtret med 2-3 mL PBS. Snurra cellerna ner 10 min vid 460 x g, Omsuspendera cellerna i 10 mL färsk DMEM 10% FBS.
- Räkna benmärgsceller på en hemocytometer och justera koncentration till 1,5 x 107 celler/mL i IMDM utan serum. Använd 3 x 106 celler per djur med en volym på 200 µL. Ca 1/3 celler av totala BM är myeloisk GFP + celler. Lämna cellerna på is tills redo för injektion. Använd 0,5 x 105 celler för att avgöra GFP uttryck av FACS9.
3. benmärgstransplantation Lys-GFP celler i RBPJKO möss
- Hindra mottagaren möss i en paj bur. Bestråla möss med en dödlig dos av gammastrålning (1,200 Rad) på en Cs 137 irradiator. Använda en delad dos protokollet: 900 rads på kvällen följt av 300 rads nästa morgon (16 h apart).
- Transplantera dödligt bestrålat RBPJWT och RBPJKO mottagare möss 5-6 h efter den andra dosen av strålning. Injicera BM celler skördas från Lys-andra möss vid en koncentration på 3 x 106 celler per djur via svans ven injektion (se Detaljer för skörd celler i avsnitt 2).
- Bild oberoende kohorter av transplanterade möss av IVFM vid olika tidpunkter: 24 h, och vecka 2, 4 och 6, som beskrivs nedan (se avsnitt 4 & 5 för i vivo imaging förfarande).
4. kirurgisk beredning för Intravital Imaging
- Sterilisera Kirurgiska instrument. Två fina pincett (en rak, en vinklad), ett par fina sax och ett par av nålförare. Förbereda operativa område med alla förnödenheter som behövs för förfarandet.
- Ge musen en IP-injektion av ketamin cocktail bedövningsmedel (xylazin 2,5-5 mg/kg + Acepromazin 1,0-2,5 mg/kg + ketamin 90-100 mg/kg) med en 26-28 G nål spruta. Djuret kommer att övervakas varje 15 min under förfarandet och bedövningsmedel kommer att kompletteras efter behov på ¼ av den ursprungliga dosen.
- Placera musen på en ordentlig värmekälla (37 ° C värmedyna, djur skyddas från direkt kontakt med värmedyna) och visuellt övervaka andningsfrekvensen.
- Kontrollera reflexer med tån nypa svar. Se till att djuret är helt under narkos inför kirurgiska ingrepp.
- Använd en 26-28 gauge nål spruta att ge möss en svans ven injektion av en fluorescerande vaskulär markör (Dextran, 100 μL av 20 mg/mL lösning).
- Gälla båda ögonen vet ögat salva. Klipp den dorsala ytan av djurets huvud med små elektriska hårklippningsmaskiner. Applicera en Hårborttagningscreme för 5 min. Använd gasbinda svampar att ta bort krämen och skölj sedan med koksaltlösning. Prep ren hårbotten med 70% alkohol med hjälp av en bomullspinne.
- Använd fina pincett och sax för att göra en liten mittlinjen huden snitt (10-20 mm) på hårbotten för att exponera underliggande dorsala skalle ytan. Använd 5-0 kirurgiska silk för att placera två vistelse suturer i huden på varje sida av snittet, skapa en flik för att exponera calvarium för avbildning.
- Placera mössen på ryggen och dränka exponerade hårbotten i ett glas botten skål fylld med mikroskopet olja. Transportera djur till den mutiphoton imaging rum.
- Placera djuret på Mikroskop scenen med den calvarium placerad på glas skålen framför målet och sedan täcka med en 37° C värmedyna (djur måste skyddas från direkt kontakt med värme).
5. in Vivo högupplöst avbildning av mus Calvarium
- Använda en inverterad confocal system för multiphoton imaging (se material tabell). Följande anvisningar ratta en 2-photon laser till 830 nm, en 20 X W, NA 0,95 objektiv i mikroskopet näsa bit och kontrollera laser beam justeringen.
Obs: Upprätt Mikroskop system är vanligast för dessa studier, men en inverterad multiphoton system kan också utnyttjas. I denna studie användes en anpassade utformade atraumatiska stereotaxic enhet. Det finns flera kommersiellt tillgängliga stereotaxic enheter för upprätt Mikroskop system, finns det ingen kommersiellt tillgänglig stereotaxic enhet för ett inverterat Mikroskop system syftar till att säkra mus skallen. Som alternativ till en anpassad stereotaxic enhet, kan skallen säkras i position ovanför målet utnyttja olika tejp eller lim metoder för stabilitet. - Öppna ett bildbehandlingsprogram för förvärvet. I ”förvärv inställningar” kontrollera panelen om en riktad genomsökningsläge är markerad. Ställa in hastigheten på Skanna till 4 μs/pixel, bildhastighet till 512 x 512 pixlar och zooma till 1,5. Välj 20 X W Na 0,95 mål från listan över tillgängliga objektiv att matcha linsen placerad i revolvern.
- Åt ”färgämne” från ”bild förvärv” Kontrollpanelen och välj ”två Photon”. Öppna fönstret ”ljus väg & färgämnen” och välj DM690-980 excitation DM. öppna 2P laser slutaren genom att markera kryssrutan i Laserinstrumentet 2. Välj RDM690 spegel i fönstret ”Mikroskop Controller”.
- Välj ”EPI LAMP”, Välj B/G epi-filter kub och koncentrera målet på preparatet till visualisera vaskulär flöde och den calvarium benmärg nisch, använder som referens bifurkation av central ven (a) och koronar suturen (b) (figur 2A).
-
Samla bilder med hjälp av icke-descanned läge. Välj tre externa detektorer: PMT detector1 att samla SHG signal av kollagen (utsläpp filter - 430/100 nm), GaAsP detector2 att samla god Jordbrukarsed signal (utsläpp filter - 525/50) och GaAsP detector3 att samla in signal av TRITC-dextran (utsläpp filter - 605/90 nm).
- Utföra avbildning på en avsökningshastighet av 4μs/pixel med ingen genomsnitt för att minimera fototoxicitet. Samla bilder på en konstant laser power och detektor vinst justeras för att utnyttja det fulla dynamiska omfånget av detektorn med minimal mättnad.
- Samla in rad sektioner genom djup vävnad (60 x 1 μm Z-stackar) från 6 områden av calvarium benmärg. Använd steg storleksinställningar 1 μm, zoom 1,5 och 512 x 512 pixlar ramstorlek (423 µm x 423 µm).
Obs: Övergripande fullständig tiden krevad till bild en mus är 1-1,5 h.
6. kvantitativ analys
- Utföra de bild kvantifiering och 3D rekonstruktioner med en dedikerad 3D / 4D bild kvantifiering och visualisering programvara enligt tillverkarens anvisningar (se Material tabell). Visualisera interaktivt Z-stackar i 3D utnyttja maximal intensitet projektion (MIP), alpha-blandning eller shadow projection volym rendering algoritmer.
- Segmentera GFP celler med hjälp av den ”plats objekt segmentering modul”. Tillämpa stack aritmetiska bearbetning (kanal subtraktion) för att eliminera falska positiva räknas av GFP celler (Detta eliminerar signal av benceller visar stark fluorescens i grön och röd kanaler).
- Utföra segmentering av kärlsystemet och ben yta använder modulen Surface segmentering. Om så krävs, beräkna avstånd av celler till någon av de ovanstående ytorna genom att använda X-tension algoritmer som kallas ”avstånd av spot till ytan”.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kohorter av 2 RBPJKO och 2 RBPJWT mottagare var avbildad i en individuell bildsession vid olika tidpunkter: 24 h och 2, 4 och 6 veckor efter transplantation av BM Lys-GFP celler (arbetsflöde illustreras i figur 1A).
I varje mus förvärvades bilder från 6 standard regioner i den BM calvarium, identifieras genom sin ställning i förhållande till bifurkationen av central ven (figur 2A, en) och koronar suturen (figur 2A, b). Injektion av Dextran Texas-röd före imaging tillåter identifiering av dessa landmärken och val av 6 områden (figur 2A): övre vänstra, Medium och rätt (UL, UM, UR), och nedre vänstra, Medium och rätt (LL, LM, LR). 60 x 1 μm z-stackar samlas in från varje region och återges som 3D-Maximal intensitet projektion (MIP), (figur 2B). 3D-skugga-projektion, vilket inkluderar Ben komponenten (grå) genereras av andra harmoniska generation (SHG) microscopyen sondera kollagen organisation (figur 2 c); och slutligen en 3-D segmenterade bild, som tillåter kvantifiering av celler och mätning av deras avstånd från benet och fartyg (figur 2D).
På grund av potentiella skillnader i målsökande preferenser av hematopoetiska celler i de olika regionerna av den BM calvarium efter transplantation är det viktigt att provet flera regioner i calvarium av varje mus. Figur 3 visar ett exempel på cell distribution i 6 regioner analyseras i en RBPJWT och en RBPJKO mottagare på 2 veckor efter BMT (grön - myeloida celler, grå-ben) med shadow projection 3D-rendering algoritm. Antalet celler per region varierade från 64 till 258 i RBPJWT musen och 265 till 573 i RBPJKO musen. Slutliga resultaten uttrycks då som Genomsnittligt antal 6 regioner analyseras: antal celler per region och mus (genomsnitt 135 i RBPJWT vs 469 i RBPJKO). Detta representativa experiment visar att det finns en större variation i cell fördelning per region i RBPJWT än mottagare i RBPJKO. Dessutom utöver den variation som finns i de calvarium regionerna inom en mus, som är vanligt, finns det variationer bland enskilda möss inom samma grupp. Det är därför viktigt att för varje tidpunkt utvärderas minst 4 möss per experiment för att få minst en totalt 24 till 30 regioner analyseras per tillstånd.
Figur 4 visar dynamiken i myeloida stamceller expansion i en Notch defekt BM mikromiljö jämfört med kontroll över 6 veckor efter transplantation. I detta representativa experiment, var 8 RBPJWT och 8 RBPJKO möss transplanteras och avbildas på angivna tidpunkter (2 RBPJWT möss och 2 RBPJKO möss vid varje tidpunkt). Figur 4A visar en representativ 3D-rekonstruktion av 1 av 6 regioner förvärvade. Celler i var och en av Regionkommittén 6 räknades och det genomsnittliga antalet celler/region om två möss som vid varje tidpunkt (totalt 12 regioner) beräknades för RBPJWT och RBPJKO mottagare (figur 4 c). Denna analys indikerar att: (i) donatorcellerna Lys-GFP i RBPJWT och RBPJKO mottagare har en liknande målsökande effektivitet; (II) celler i RBPJKO mottagarna expandera snabbare och är dubbelt så många celler i RBPJWT mottagarna på vecka 2 efter BMT; (III) celler i RBPJWT mottagare expandera senare och är 2-faldigt högre än celler i RBPJKO mottagare vid vecka 4 efter BMT; och iv) cell nummer i både RBPJWT och RBPJKO mottagare bli liknande vecka 6 efter BMT. Analys av givare myeloida celler i PB indikerar en högre produktion av myeloida celler från BM av RBPJKO mottagare än från BM av RBPJWT mottagarna vid vecka 4 vid tidpunkten när BM av RBPJKO möss visade en lägre halt av Lys-GFP celler. Den kombinerade analysen av myeloida celler bosatt i BM och myeloida celler som cirkulerar i PB, visar att närmiljön Lys-GFP celler expandera i den RBPJKO BM och är redo att mobilisera snabbare. Parallella FACS analys av Lys-GFP celler i långa ben BM från samma möss visade en trend liknande den som observerades av IVFM; skillnader mellan villkoren var dock mindre uttalad (figur 4B).
Mätning av avståndet mellan enskilda Lys-GFP celler från benet eller vaskulatur visas i figur 5. I denna representativa studie, 3D-segmentering analys av regionen LM i RBPJWT och RBPJKO calvarium på 6 veckor från BMT användes (figur 5A). Avstånd från ben och fartygen beräknades för varje cell i regionen: 200 celler i RBPJWT och 255 celler i RBPJKO, och således, uttryckt som genomsnitt. Analysen visar att Lys-GFP celler lokalisera på liknande avstånd från benet i RBPJWT och RBPJKO möss (11 μm), men att de bor mer avlägsen från kärlsystemet i RBPJKO möss än i RBPJWT möss (15 μm vs 5 μm, respektive). Detta resultat är spännande, som i RBPJKO möss Lys-GFP celler mobiliserade i cirkulationen mer än i RBJWT möss och skulle alltså förväntas att lokalisera närmare till fartyg. Det är dock möjligt att skillnaden i lokalisering återspeglar ett annat skede av differentiering av dessa två populationer (i RBPJWT och RBPJKO), en punkt som inte kan tas upp av denna analys. Betydelsen av detta resultat kommer att följas upp med en större pool av celler i alla 6 regioner och genom att kombinera FACS analys.
Övergripande, suboptimala resultat erhålls när ett litet antal regioner analyseras per mus. Bildbehandling är särskilt utmanande på tidiga punkter efter BMT, som dödliga bestrålning skadar vaskulatur och läckage av dextran från kapillärer minskar avbildadefinitionen. Det är således viktigt att ha ett stort antal repetitioner, särskilt på de tidigaste tidpunkterna.
SHG är ett användbart verktyg för att undersöka kollagen fiber organisation i 3D. Det är en andra ordningens ickelinjär optisk process som härstammar från strukturer såsom kollagenfibrer som har icke-centrosymmetry och en hög andra ordningens nonlinear friktionskoefficient. När intensiv infallande ljuset interagerar med sådana strukturer, genererar ljus på två gånger incident frekvensen eller halv incident våglängden. Därför behövs ingen märkning för att fånga SHG signal under 2-foton mikroskopi. Med 830 nm excitation våglängd fånga vi SHG signal i den blå kanalen med utsläpp filter 430/100 nm.
Figur 1: Experimentella arbetsflödet. (A) induktion av Mx1-Cre/RBPJlox/lox möss att generera RBPJKO och RBPJWT möss ~ 4 veckor tidigare imaging; (B) beredning av BM celler från Lys-GFP transgena möss; (C) Transplantation av BM Lys-GFP celler i dödligt bestrålat RBPJKO eller RBPJWT mottagare. (D) IVFM av musen calvarium på 24 h, 2, 4 och 6 veckor efter BMT, följt av dödshjälp och BM analys av FACS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: IVFM av BM vaskulär nisch. (A) mosaik multi photon bild av Lys-andra mus calvarium visar 6 standard regionerna Imaging (UL: övre vänstra, UM: övre mitten, UR: övre högra, LL: lägre vänster, LM: lägre mitten, LR: nedre högra) (grön, myeloida celler, röd, kärlsystemet, gray, ben) 10 X förstoring; (B-D) BM nisch detalj återges som: (B) MIP, (C) 3D-skugga projektion, (D) 3D-segmentering bild. Bilderna bearbetades - använder en dedikerad 3D / 4D bild kvantifiering och visualisering programvara (tabell 1). Skala barer = 50 μm i B, C, D. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Myeloida celler Engraftment vid vecka 2. Bilder av Lys-GFP celler (grön) och ben yta (grå) i 6 BM regioner från calvarium ben av en RBPJWT och en RBPJKO mus (U: övre, L: vänster, M: mitten, R: rätt). Skala barer = 50 μm. Stapeldiagram (till höger) indikerar antalet cell som räknas i varje region (RBPJWT range 64-258; RBPJKO intervall 265-573) och deras genomsnittliga antalet 135 STD + / 73 och 469 STD + / 121. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Kinetik av myeloida celler Engraftment och utdata efter BMT. (A) bilder av Lys-GFP celler (grön) och benytan (grå) i en representativ region från calvarium av en RBPJWT och RBPJKO mus vid varje tidpunkter anges. Skala barer = 50 μm. (B) Dot blotting Visa procentandelen Lys-GFP positiva celler av flödescytometri inom BM på långa-ben skördats från samma mus avbildas i vivo (ovan). (C) stapeldiagram visar Genomsnittligt antal celler/region i 2 möss (totalt 12 regioner) vid varje tidpunkt, +/-STD. (D) linje graf visar faldig ökning av det totala antalet neutrofiler (räknas upp av cellen counter) presenteras i PB av samma möss än i (A) vid de angivna tidpunkterna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Lokalisering av myeloida celler i BM släktingen till benet och vaskulatur. (A) representativa 3-D segmenterade bilder av Lys-GFP celler och kärlsystemet, och Lys-GFP celler och ben i samma område i calvarium ben i RBPJWT och RBPJKO mottagare vecka 6 från BMT. Skala barer = 50 μm. (B) stapeldiagram sammanfattar den genomsnittliga avståndet i μm +/-SEM av Lys-GFP celler från benytan eller i kärlsystemet. Antalet celler mätt i: RBPJWT n = 200 celler och RBPJKO n = 255 celler. Distansera av Lys-GFP celler från kärlsystemet är större i RBPJKO än RBPJWT möss, p < 0,001 (Student's t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här protokollet beskriver en experimentell design optimerad för att studera kinetiken för hematopoetiska celler engraftment av Intravital fluorescerande mikroskopi. I denna studie, var utbyggnaden av myeloida stamceller i en WT BM eller i ett snäpp signalering defekt BM spåras i det ben calvarium av följande Lys-GFP positiva myeloida celler efter BMT in RBPJWT eller RBPJKO mottagare. Detta tillvägagångssätt föreslås som en modell som kan tillämpas på adress liknande frågor, till exempel: jag) att fastställa expansion och lokalisering i BM nischer av celler av andra härstamningar, såsom lymfoida, erytroid eller megakaryocytic celler, med hjälp av som givare celler hematopoetiska celler bär härstamning specifika initiativtagare körning GFP eller tomat-röd; (II) att bedöma olika mikro-miljömässiga bestämningsfaktorer genom att använda andra specifika KO eller transgena möss som mottagare.
Styrkan i detta protokoll som avbildning i calvarium ben, är att de anatomiska landmärken som används för att välja Regionkommittén BM, bifurkation av central ven och koronar suturen, rimligen kan bevaras i alla möss, medger enhetlighet mellan enskilda experiment samtidigt avstå från kravet på ett automatiserat Stadium. Dessutom, användning av GFP modellen att spåra hematopoetiska celler visade sig vara mycket effektivt, enligt GFP en stabil signal under suboptimala förhållanden, såsom efter bestrålning. Slutligen, imaging set-up beskrivs, med ett inverterat Mikroskop och en anpassad stereotaxic enhet där musen är i ryggläge, kraftigt minimera andning artefakter.
Två aspekter av denna försöksplanering, kan om det genomförs, leda till en bredare och mer effektiv användning av IVFM av calvarium. Först, det är viktigt att optimera och standardisera protokoll längsgående imaging att låta observationen av samma mus vid olika tidpunkter (från dag 2 till flera veckor) efter intervention (dvs BMT eller terapi) istället för att använda oberoende kohorter av möss. Eftersom denna metod kräver lämpliga villkor för efter kirurgi återvinning och användning av åtgärder för att motverka inflammation, infektion, och ärr bildas på platsen för imaging, är dess tillämpning för närvarande begränsad. För det andra kommer det vara värdefullt att utveckla en rad härstamning spårning musmodeller bära fluorescerande proteiner i specifika celler i BM nisch (vaskulär, endosteala, perivaskulär och neuronala) att kombinera hematopoetiska cellfunktioner med specifika egenskaperna hos BM nischer.
Avbildning av ben har fortfarande några utmaningar och begränsningar jämfört med andra vävnader. Trots två-photon mikroskopet kan tränga igenom 100-1000 micron djupt i vävnaderna, är det fortfarande utmanande att bilden genom hela tjockleken på calvarium ben. Bilder förlorar kvalitet med ökande djup så protokollet här beskrivs tillförlitlig analys av BM regioner från 60 micron tjock stackar. En annan faktor som kan leda till inkonsekvens eller suboptimala imaging är den böjda formen på calvarium ben, som kan ge bilden ur fokus. Det är viktigt att ha skallen placerad perfekt på glas skålen framför målet, möjligen med en stereotaxic enhet. Storleken på skallen är faktiskt viktigt: skallen av möss för ung eller liten kanske inte passar perfekt i en given stereotaxic enhet. Som ett exempel passar den enhet som utnyttjas här inte möss yngre än 6 veckor och mindre än 20 g.
En ytterligare begränsning är att de bildsystem som används i denna studie är begränsad till 3 kanaler. Som den blå kanalen tilldelas automatiskt samla in icke-märkning baserat SHG signal av kollagen som ben, finns bara 2 kanaler för specifika fluorescens märkning. Detta system har dessutom en hastighetsbegränsning av 1 ram/s 2 μs/pixel uppehålla mig tid och 512 x 512 pixlar storlek, som inte är idealisk för snabb dynamiska processer (t.ex. mätning av blodflöde och utvärdering av cell mobilisering i blodet).
En viktig utmaning är att bestrålning utförs för BMT kompromisser integriteten i kärlsystemet. Närvarande i BM efter bestrålning vaskulär läckage orsakar svårigheter med segmentering/kvantitering av enskilda strukturer, vilket kan innebära svårigheter i kvantitativ analys.
Slutligen är det viktigt att beakta att avbildning av en mus tar ungefär 1 h, och antalet möss som kan avbildas i en viss dag är begränsad (~ 4-6 möss). Således kan öka stickprovsstorleken att få ström av analys kräva flera oberoende experiment, vilket kan öka variabilitet.
Efter detta protokoll är antalet hematopoetiska celler Lys-GFP+ celler upptäckts av IVFM i BM efter 24 h från BMT är ~ 30 celler/region och det ganska litet antal jämfört med den ursprungliga ingången av celler (3 x 10-6). Även om en del av problemet är på grund av cell svällning i lunga och lever innan homing till den BM efter i.v. injektion, det återstår för att undersökas huruvida det finns regioner i calvarium än de som valts där de transplanterade cellerna hemma vid högre effektivitet.
Homing och engraftment av celler till BM efter BMT följs vanligen av flödescytometri genom mätning av CD45.1/CD45.2 markörer, GFP, Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) eller kombination av härstamning och stamceller markörer. Användningen av IVFM, särskilt vid tidiga tidpunkter, gör tillgängliga unika och ytterligare information som inte kan tillhandahållas av flödescytometri. Till exempel ofta det är inte lätt att skilja av FACS händelser som är ”celler” från händelser som är ”artefakter”, i synnerhet när ett lågt antal positiva händelser samlas (dvs på 24 h från BMT). IVFM ger information om morfologi och lokalisering av cellerna som stöd denna distinktion. Likaså inkluderas FACS analys av BM hematopoetiska celler skördas av rodnad eller kraschar ben som var bosatta i nisch och celler som redan var i omlopp i kärlsystemet. IVFM tillåter faktiskt skillnaden och utvärdering av celler som vilar inom BM nisch och celler som mobiliserar i blodomloppet. Denna distinktion är av stort värde när man studerar kineticsen av homing, lokalisering, differentiering och mobilisering i en viss modell. Ännu viktigare, kan IVFM ger unik information om ställning som de hematopoetiska cellerna i förhållande till närmiljön cellerna som utgör en specifik nisch.
Andra metoder som används för att ta itu med sammansättningen av BM nisch, sådan histologisk analys har använts. Jämförelse mellan intravital mikroskopi av BM och histologisk analys av konfokalmikroskopi har diskuterats grundligt och elegant av Lo Celso o.a. 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Imaging genomfördes i Indiana Center för biologiska mikroskopi vid Indiana University, regisserad av Dr. Ken Dunn. Stereotaxic enheten är en prototyp designade och tillverkade av Mark Soonpaa, Wells centrum för pediatrisk forskning. Detta arbete fick stöd av NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), MPN forskningen Foundation (NC) och den CTSI Collaborative projektet IUSM/Notre Dame (NC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine cocktail | IU School of Medicine | Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg | |
| TRITC dextran | Tdb Consultancy | TD150-100mg | Other color dextran may be used. |
| Andis hair trimmer | Braintree Scientific | CLP-323 75 | |
| Gauze sponge | Med Vet International | PK224 | 4-ply, 2 x 2 |
| Nair depilatory cream | Commercial store | ||
| Saline | Med Vet International | RXSAL-POD1LT | 0.9% Sodium Chloride poly bottle |
| Insulin syringe | Fisher Scientific | 14-826-79 | 28 g, 1/2 cc |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 00108-11, 00109-11 | straight forcep, angled forcep |
| Scissor | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| 5-0 silk suture | Fisher Scientific | MV-682 | Other non-absorbable suture may be used |
| WillCo- glass bottom dish | WillCo | GWSt-5040 | |
| Optical microscope oil | Leica | ||
| Stereotaxic stage insert | IU School of Medicine | Custom design | |
| Olympus FV1000 confocal microscope system | Olympus | ||
| Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective | Olympus | ||
| Small heating pad | Commercial store | Zoo Med reptile heating pad | |
| Imaris 8.1 imaging software | Bitplane | 3/4 D Image Visualization and Analysis software |
References
- Carlesso, N., Cardoso, A. A. Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).
- Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Naveiras, O., et al. Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).
- Scheiermann, C., et al. Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues. Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 716-726 (2000).
- Han, H., et al. Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision. Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
- Wang, L., et al. Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner. Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).
- Miyamoto, T., et al. Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment. Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).
- Luc, S., et al. Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential. Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).
- Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation. Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).
- Essers, M. A., et al. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).
- Pietras, E. M., et al. Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons. J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. J Vis Exp. (91), e51683 (2014).
