Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.
Развитие биоматериалов значительно увеличило потенциал для целенаправленной доставки лекарственных средств к различным тканей и клеток типов, в том числе и панкреатических бета-клеток. Кроме того, биоматериала частицы, гидрогели и каркасы также предоставляют уникальную возможность для введения устойчивой, контролируемой доставки лекарственного средства к бета-клеток в культуре и в пересаженных тканей моделей. Эти технологии позволяют изучение факторов пролиферации кандидат β-клеток с использованием интактные островки и поступательно соответствующую систему. Кроме того, определение эффективности и целесообразности факторов кандидатов для стимуляции пролиферации β-клеток в системе культуры имеет решающее значение , прежде чем двигаться вперед , чтобы модели в естественных условиях. Здесь мы опишем метод совместного культивирования неповрежденные островки мыши с биоразлагаемого соединения , представляющего интерес (ИСП) -loaded поли (молочной-гликолевой кислоты) (PLGA) микросферы с целью оценки влияния устойчивого высвобождения на месте O вF митогенных факторов на пролиферацию β-клеток. Этот метод подробно описывает, как генерировать микросферы PLGA, содержащих нужный груз с использованием коммерчески доступных реагентов. В то время как описанный метод использует рекомбинантный фактор человеческого роста соединительной ткани (rhCTGF) в качестве примера, легко может быть использовано широкое разнообразие ИСП. Кроме того, этот метод использует 96-луночные планшеты для минимизации количества реагентов, необходимых для оценки пролиферации β-клеток. Этот протокол может быть легко адаптирован для использования альтернативных биоматериалов и другие характеристики эндокринные клетки, такие как выживаемость клеток и статуса дифференцировки.
Панкреатические бета-клетки являются единственными инсулин-продуцирующие клетки в организме и имеют решающее значение для поддержания гомеостаза глюкозы в крови. В то время как здоровые люди не имеют достаточную массу β-клеток и функционируют надлежащим образом регулировать содержание глюкозы в крови, больных сахарным диабетом характеризуются недостаточной массы β-клеток и / или функции 1,2. Было высказано предположение , что индуцирование пролиферации β-клеток в конечном итоге может увеличить массу β-клеток и восстановление гомеостаза глюкозы у пациентов с диабетом 3. Тем не менее, оценка и проверка потенциальных пролиферативных соединений β-клеток в неповрежденных островках необходимо, прежде чем эффективные методы лечения могут быть разработаны. Трансплантация трупных человеческих островков Into людей с диабетом восстанавливает гомеостаз глюкозы в крови в течение некоторого времени, но наличие и успех этой экспериментальной процедуры затрудняется нехваткой людских островками доступных для трансплантации и смерти -клеток в островках на кормеПересадка эр 4. Даже с открытием факторов , которые стимулируют размножение инсулин-продуцирующие клетки, основной проблемой до сих пор существует в реализации этих факторов на соответствующих сайтах в естественных условиях. Одна из стратегий для длительной местной доставки β-клеточных пролиферативных соединений является поли (молочной-со-гликолевой) кислоты (PLGA). PLGA имеет историю использования в FDA одобрило продукцию для доставки лекарств из – за его высокой безопасности, биоразлагаемости и кинетики с длительным высвобождением 5. В частности, PLGA , представляет собой сополимер лактида и гликолида , который деградирует с помощью гидролиза с водой либо в естественных условиях или в культуре в молочную кислоту и гликолевую кислоту, которые в природе метаболитов в организме. Инкапсулированное лекарственное соединение может выделяться в окружающую среду путем диффузии как и / или механизмов высвобождения деградации под контролем. Инкапсуляция ИСП обеспечивает защиту от ферментативного разложения, повышение биодоступности реагента по сравнению с unencapsulaTed ИСП 5. Мы предполагаем , что PLGA Микросферы могут быть использованы для введения соединений – кандидатов к интактным островками в культуре, и в конечном счете в естественных условиях. Тестирование эффективности PLGA для введения β-клеточные митогены к островки ех естественных условиях имеет решающее значение , прежде чем протоколы трансплантации исследуются.
В настоящее время не существует метод для измерения пролиферации β-клеток у живых животных. Эксперименты по оценке эффективности потенциальных соединений пролиферативных в естественных условиях , следовательно , требуют введения этих соединений в живых животных, с последующим рассечением и переработке поджелудочных желез для иммунноокрашивания. Такие протоколы являются дорогостоящими и трудоемкими и требуют соединения для вводить системно, без каких-либо гарантий того, что они будут достигать островки. С другой стороны, несколько иммортализованные β-клеточные линии доступны для изучения инсулин-продуцирующих клеток в культуре, но эти клеточные линии не имеют архитектуру островковых и экологичет найдено в живых организмах 6. Иммортализованные β-клеточные линии также характеризуются как имеющие гораздо более высокую степень репликации , чем эндогенных бета-клеток в живом организме , таким образом , затрудняя анализ соединений , которые индуцируют пролиферацию. В данном исследовании мы опишем протокол, который использует интактные островки, выделенные из взрослых мышей. В отличие от β-клеточных линий, неповрежденные островки сохраняют нормальную архитектуру островок. Точно так же, в отличие от экспериментов , проведенных в естественных условиях, которые применяют пролиферативные соединений непосредственно к культивируемым интактные островки значительно уменьшает количество реагентов , которые необходимы для точного измерения пролиферации β-клеток.
Настоящее исследование использует PLGA для администрирования ИСП, в данном примере, рекомбинантный Connective тканевого фактора роста человека (rhCTGF). Описанный здесь метод дает значительное преимущество перед введением сырого соединения к культивируемым островками, поскольку оно позволяет для непрерывного высвобождения соединения в гоэлектронные средства массовой информации. Следует отметить, что этот анализ может быть модифицирован для введения широкого спектра белков и антител, которые представляют интерес для неповрежденных островках. Воздействие на других эндокринных типов клеток, в том числе альфа-клеток, также могут быть проанализированы.
Исследование пролиферации β-клеток в культуре, как правило, мешает несколько трудностей. Во-первых, иммортализованные β-клеточные линии характеризуются более высокими степенями пролиферации, чем то, что находится в эндогенных бета-клеток в живых островками. Кроме того, эти линии иммор…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.
Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000-69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000-98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
FreeZone -105°C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |