Поступательный Администрация β-клеток митогенами к неповрежденной островки Mouse<em> Ex Vivo</em> Использование Биоразлагаемые поли (молочной-гликолевой кислоты) микросферы
Summary
Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.
Abstract
Развитие биоматериалов значительно увеличило потенциал для целенаправленной доставки лекарственных средств к различным тканей и клеток типов, в том числе и панкреатических бета-клеток. Кроме того, биоматериала частицы, гидрогели и каркасы также предоставляют уникальную возможность для введения устойчивой, контролируемой доставки лекарственного средства к бета-клеток в культуре и в пересаженных тканей моделей. Эти технологии позволяют изучение факторов пролиферации кандидат β-клеток с использованием интактные островки и поступательно соответствующую систему. Кроме того, определение эффективности и целесообразности факторов кандидатов для стимуляции пролиферации β-клеток в системе культуры имеет решающее значение , прежде чем двигаться вперед , чтобы модели в естественных условиях. Здесь мы опишем метод совместного культивирования неповрежденные островки мыши с биоразлагаемого соединения , представляющего интерес (ИСП) -loaded поли (молочной-гликолевой кислоты) (PLGA) микросферы с целью оценки влияния устойчивого высвобождения на месте O вF митогенных факторов на пролиферацию β-клеток. Этот метод подробно описывает, как генерировать микросферы PLGA, содержащих нужный груз с использованием коммерчески доступных реагентов. В то время как описанный метод использует рекомбинантный фактор человеческого роста соединительной ткани (rhCTGF) в качестве примера, легко может быть использовано широкое разнообразие ИСП. Кроме того, этот метод использует 96-луночные планшеты для минимизации количества реагентов, необходимых для оценки пролиферации β-клеток. Этот протокол может быть легко адаптирован для использования альтернативных биоматериалов и другие характеристики эндокринные клетки, такие как выживаемость клеток и статуса дифференцировки.
Introduction
Панкреатические бета-клетки являются единственными инсулин-продуцирующие клетки в организме и имеют решающее значение для поддержания гомеостаза глюкозы в крови. В то время как здоровые люди не имеют достаточную массу β-клеток и функционируют надлежащим образом регулировать содержание глюкозы в крови, больных сахарным диабетом характеризуются недостаточной массы β-клеток и / или функции 1,2. Было высказано предположение , что индуцирование пролиферации β-клеток в конечном итоге может увеличить массу β-клеток и восстановление гомеостаза глюкозы у пациентов с диабетом 3. Тем не менее, оценка и проверка потенциальных пролиферативных соединений β-клеток в неповрежденных островках необходимо, прежде чем эффективные методы лечения могут быть разработаны. Трансплантация трупных человеческих островков Into людей с диабетом восстанавливает гомеостаз глюкозы в крови в течение некоторого времени, но наличие и успех этой экспериментальной процедуры затрудняется нехваткой людских островками доступных для трансплантации и смерти -клеток в островках на кормеПересадка эр 4. Даже с открытием факторов , которые стимулируют размножение инсулин-продуцирующие клетки, основной проблемой до сих пор существует в реализации этих факторов на соответствующих сайтах в естественных условиях. Одна из стратегий для длительной местной доставки β-клеточных пролиферативных соединений является поли (молочной-со-гликолевой) кислоты (PLGA). PLGA имеет историю использования в FDA одобрило продукцию для доставки лекарств из – за его высокой безопасности, биоразлагаемости и кинетики с длительным высвобождением 5. В частности, PLGA , представляет собой сополимер лактида и гликолида , который деградирует с помощью гидролиза с водой либо в естественных условиях или в культуре в молочную кислоту и гликолевую кислоту, которые в природе метаболитов в организме. Инкапсулированное лекарственное соединение может выделяться в окружающую среду путем диффузии как и / или механизмов высвобождения деградации под контролем. Инкапсуляция ИСП обеспечивает защиту от ферментативного разложения, повышение биодоступности реагента по сравнению с unencapsulaTed ИСП 5. Мы предполагаем , что PLGA Микросферы могут быть использованы для введения соединений – кандидатов к интактным островками в культуре, и в конечном счете в естественных условиях. Тестирование эффективности PLGA для введения β-клеточные митогены к островки ех естественных условиях имеет решающее значение , прежде чем протоколы трансплантации исследуются.
В настоящее время не существует метод для измерения пролиферации β-клеток у живых животных. Эксперименты по оценке эффективности потенциальных соединений пролиферативных в естественных условиях , следовательно , требуют введения этих соединений в живых животных, с последующим рассечением и переработке поджелудочных желез для иммунноокрашивания. Такие протоколы являются дорогостоящими и трудоемкими и требуют соединения для вводить системно, без каких-либо гарантий того, что они будут достигать островки. С другой стороны, несколько иммортализованные β-клеточные линии доступны для изучения инсулин-продуцирующих клеток в культуре, но эти клеточные линии не имеют архитектуру островковых и экологичет найдено в живых организмах 6. Иммортализованные β-клеточные линии также характеризуются как имеющие гораздо более высокую степень репликации , чем эндогенных бета-клеток в живом организме , таким образом , затрудняя анализ соединений , которые индуцируют пролиферацию. В данном исследовании мы опишем протокол, который использует интактные островки, выделенные из взрослых мышей. В отличие от β-клеточных линий, неповрежденные островки сохраняют нормальную архитектуру островок. Точно так же, в отличие от экспериментов , проведенных в естественных условиях, которые применяют пролиферативные соединений непосредственно к культивируемым интактные островки значительно уменьшает количество реагентов , которые необходимы для точного измерения пролиферации β-клеток.
Настоящее исследование использует PLGA для администрирования ИСП, в данном примере, рекомбинантный Connective тканевого фактора роста человека (rhCTGF). Описанный здесь метод дает значительное преимущество перед введением сырого соединения к культивируемым островками, поскольку оно позволяет для непрерывного высвобождения соединения в гоэлектронные средства массовой информации. Следует отметить, что этот анализ может быть модифицирован для введения широкого спектра белков и антител, которые представляют интерес для неповрежденных островках. Воздействие на других эндокринных типов клеток, в том числе альфа-клеток, также могут быть проанализированы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследование пролиферации β-клеток в культуре, как правило, мешает несколько трудностей. Во-первых, иммортализованные β-клеточные линии характеризуются более высокими степенями пролиферации, чем то, что находится в эндогенных бета-клеток в живых островками. Кроме того, эти линии иммор…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.
Materials
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000-69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000-98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105°C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
References
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823 (2012).
- Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).
- Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
- Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255 (2007).
- Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).
- Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).
- Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).
- Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).
- Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX – a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).
- Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).
- Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).
- Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).
- Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).
