Administration soutenue de mitogenes β-cellules à Intact Islets souris<em> Ex Vivo</em> Utilisation Biodegradable poly (acide lactique-co-glycolique) Microsphères
Summary
Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.
Abstract
Le développement de biomatériaux a augmenté de manière significative le potentiel de délivrance de médicament ciblant une variété de types de cellules et de tissus, y compris les cellules ß pancréatiques. En outre, biomatériaux particules, hydrogels et échafauds fournissent également une occasion unique pour administrer soutenue, l'administration de médicaments commandable pour ß-cellules en culture et dans des modèles de tissus transplantés. Ces technologies permettent l'étude des facteurs de prolifération des cellules β candidat en utilisant des îlots intacts et un système de translation correspondant. En outre, la détermination de l'efficacité et la faisabilité des facteurs candidats pour stimuler la prolifération des cellules β dans un système de culture est essentielle avant de passer à des modèles in vivo. Nous décrivons ici une méthode de co-culture des îlots de souris intactes avec un composé biodégradable d'intérêt (COI) de poly chargé en (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) microsphères dans le but d'évaluer les effets de durable in situ la libération oLes facteurs mitogenes f sur la prolifération des cellules β. Cette technique décrit en détail comment générer des microsphères de PLGA contenant un chargement souhaité en utilisant des réactifs disponibles dans le commerce. Bien que la technique décrite utilise le facteur humain recombinant conjonctifs de croissance du tissu conjonctif (rhCTGF) à titre d'exemple, une grande variété de conflits d'intérêts pourrait facilement être utilisé. En outre, ce procédé utilise des plaques à 96 puits pour réduire au minimum la quantité de réactifs nécessaires pour évaluer la prolifération des cellules β. Ce protocole peut être facilement adaptée à l'utilisation de biomatériaux et d'autres caractéristiques alternatives de cellules endocrines telles que la survie cellulaire et l'état de différenciation.
Introduction
les cellules ß pancréatiques sont les seules cellules productrices d'insuline dans le corps et sont essentiels pour maintenir l'homéostasie du glucose sanguin. Bien que les individus en bonne santé ont une masse β-cellulaire suffisante et fonctionnent pour réguler correctement la glycémie, les personnes atteintes de diabète sont caractérisées par la masse β-cellulaire insuffisante et / ou de la fonction 1,2. Il a été proposé que l' induction de la prolifération des cellules β peut finalement augmenter la masse β-cellulaire et de rétablir l' homéostase du glucose chez les personnes atteintes de diabète 3. Toutefois, l'évaluation et la validation des β-cellulaires composés prolifératives potentiels dans les îlots intacts est nécessaire avant des traitements efficaces peuvent être développées. La transplantation d'îlots humains cadavériques dans les individus atteints de diabète restaure le sang homéostasie du glucose pendant un certain temps, mais la disponibilité et le succès de cette procédure expérimentale est entravée par un manque d'îlots humains disponibles pour la transplantation et par la mort des cellules ß dans les îlots arrièreer greffe 4. Même avec la découverte de facteurs qui induisent la multiplication des cellules productrices d'insuline, un défi majeur existe encore dans la prestation de ces facteurs à des sites pertinents in vivo. Une stratégie pour une délivrance locale prolongée de composés β-proliférative cellulaire est l'acide poly (lactique-co-glycolique) (PLGA). PLGA a une histoire d'utilisation dans la FDA a approuvé des produits d'administration de médicaments en raison de son haut niveau de sécurité, la biodégradabilité et la cinétique de libération prolongée 5. Plus précisément, le PLGA est un copolymère de lactide et de glycolide qui se dégrade par hydrolyse avec de l' eau , soit in vivo ou dans une culture en acide lactique et acide glycolique, qui sont des métabolites présents naturellement dans l'organisme. Le composé de médicament encapsulé peut être libéré dans l'environnement à la fois par diffusion et / ou des mécanismes de libération dégradation contrôlée. Encapsulage de CI procure une protection contre la dégradation enzymatique, à améliorer la biodisponibilité du réactif par rapport à unencapsulated COI 5. Nous suggérons que les microsphères de PLGA peuvent être utilisées pour administrer les composés candidats à des îlots intacts dans la culture, et finalement in vivo. Tester l'efficacité de PLGA pour administrer des mitogenes de cellules β d'îlots ex vivo est essentiel avant que les protocoles de transplantation sont explorées.
À l'heure actuelle, il n'y a pas de technique pour mesurer la prolifération des cellules β chez les animaux vivants. Des expériences visant à évaluer l' efficacité des composés prolifératives potentiels in vivo nécessitent donc l' administration de ces composés aux animaux vivants, à la dissection ultérieure et le traitement des pancreata pour immunomarquage. Ces protocoles sont coûteux et laborieux, et exigent le composé à être administrés par voie systémique, sans aucune garantie qu'ils atteindront les îlots. A l'inverse, plusieurs lignées cellulaires immortalisées-β sont disponibles pour l'étude des cellules productrices d'insuline dans la culture, mais ces lignées cellulaires manquent de l'architecture de l'îlot et environment trouvée dans les organismes vivants 6. Β-lignes cellulaires immortalisées sont également caractérisés comme ayant un degré beaucoup plus élevé de la réplication de cellules ß endogène in vivo, ce qui complique l' analyse des composés qui induisent la prolifération. Dans cette étude, nous décrivons un protocole qui utilise des îlots intacts isolés à partir de souris adultes. Contrairement aux lignes β-cellulaires, îlots intacts conservent l'architecture d'îlots normal. De même, contrairement aux expériences menées in vivo, l' administration des composés prolifératifs directement à îlots intacts de culture réduit de manière significative la quantité de réactifs nécessaire pour mesurer avec précision la prolifération des cellules β.
L'étude actuelle utilise PLGA pour administrer un conflit d'intérêts, dans cet exemple, le facteur de croissance du tissu humain recombinant (rhCTGF). La méthode décrite ici confère un avantage significatif sur l'administration du composé brut à des îlots de culture, car elle permet une libération continue du composé dans emédias électroniques. En particulier, ce test peut être modifié pour administrer une grande variété de protéines et d'anticorps d'intérêt pour les îlots intacts. Effets sur d'autres types de cellules endocrines, y compris les cellules alpha, peuvent également être analysées.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'étude de la prolifération β-cellulaire dans la culture est généralement entravée par plusieurs difficultés. Tout d'abord, les lignées cellulaires immortalisées-β sont caractérisés par des degrés de prolifération que ce qu'on trouve dans les cellules ß des îlots endogènes vivants supérieurs. En outre, ces lignées cellulaires immortalisées manquent de l'architecture normale critique pour la fonction β-cellulaire normale. Ces deux faits font qu'il est difficile de déterminer si l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.
Materials
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000-69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000-98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105°C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
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