본래 마우스 독도에 β 세포 분열 촉진 물질의 지속적인 관리<em> 전의 VIVO</em> 생분해 성 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 마이크로 스피어를 사용하여
Summary
Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.
Abstract
생체 재료의 개발은 췌장 β 세포를 포함한 세포 및 조직 유형의 다양한 표적 약물 전달의 가능성을 증가 현저했다. 또한, 생체 재료 입자, 하이드로 겔 및 비계는 독특한 기회를 제공하는 것은 유지 관리하려면 제어 약물 전달은 β 세포를하는 문화와 이식 조직 모델에서. 이러한 기술은 본래 섬과 병진 관련 시스템을 이용하여 후보 β 세포 증식 인자에 대한 연구를 허용한다. 또한, 배양 시스템에서 β 세포 증식을 자극 후보 인자의 효과 및 타당성을 결정하는 것은 생체 내 모델 전진 전에 중요하다. 여기서 우리가 관심있는 생분해 성 화합물 (COI) -loaded 폴리 (락트산 – 코 – 글리콜 산) 인 시츄 이형 O에서 유지의 효과를 평가하기위한 목적으로 (PLGA) 마이크로 스피어와 본래 마우스 아일렛 배양 공동하는 방법을 서술β 세포 증식에 F 분열 촉진 인자. 이 기술은 상업적으로 입수 가능한 시약을 사용하여 원하는화물을 함유하는 PLGA 미립자를 생성하는 방법에 대해 상세히 설명한다. 설명 된 기술은 예를 들어 재조합 인간 결합 조직 성장 인자 (rhCTGF)를 사용하지만, COI 다양한 용이하게 사용될 수있다. 또한,이 방법은 β 세포 증식을 평가하는 데 필요한 시약의 양을 최소화하기 위하여 96 웰 플레이트를 사용한다. 이 프로토콜은 용이하게 다른 생체 물질 및 세포 생존 및 분화 상태와 같은 다른 내분비 세포의 특성을 이용하도록 구성 될 수있다.
Introduction
췌장 β 세포는 몸의 유일한 인슐린 생산 세포이며 혈당 항상성을 유지하는 것이 중요하다. 건강한 사람이 충분한 β 세포 질량을 적절히 혈당을 조절하는 역할을하지만, 당뇨병을 가진 개인이 불충분 β 세포 질량 및 / 또는 1,2- 기능을 특징으로한다. 이 β 세포 증식을 유도하여 궁극적으로 β 세포 질량을 증가시키고 당뇨병 3 개인 글루코스 항상성을 복원 할 수 있도록 제안되어있다. 효과적인 치료법이 개발되기 전에 그러나, 평가, 그대로 섬에 잠재적 인 β 세포 증식 화합물의 확인이 필요합니다. 당뇨병을 가진 개인에 사체 인간의 독도의 이식은 몇 시간 동안 혈당 항상성을 복원되지만 가용성이 실험 절차의 성공은 섬의 후방에 이식 가능한 인간 섬의 부족에 의해 베타 세포 사멸에 의해 방해된다어 이식 4. 에도 인슐린 생성 세포의 증식을 유도하는 인자를 발견하여, 주요 문제는 여전히 생체 관련 사이트에 이들 인자를 전달 존재한다. β 세포 증식 화합물의 지속 로컬 배달을 위해 하나의 전략은 폴리 (락트산 – 코 – 글리콜) 산 (PLGA)입니다. PLGA는 FDA에서 사용의 역사는 높은 안전성, 생분해 성 및 확장 릴리스 역학 5 때문에 약물 전달 제품을 승인했다. 즉, PLGA는 생체 내에서 자연적으로 또는 체내에서 대사를 발생하는 젖산 및 글리콜 산으로 배양 중 물로 가수 분해를 통해 락 타이드와 글리콜 라이드의 공중 합체이다. 캡슐화 된 약물 화합물의 확산 및 / 또는 변형 – 방출 조절기구 모두 주위 환경에 방출 될 수있다. COI의 캡슐화 unencapsula 비교 시약의 생체 이용률을 개선 효소 분해에 대한 보호를 제공테드 COI 5. 우리는 PLGA 미세 문화에 그대로 섬에 후보 화합물을 관리하는 데 사용 될 수 있으며, 궁극적으로 생체 내에서하는 것이 좋습니다. 이식 프로토콜을 탐험하기 전에 생체을 섬에 β 세포 분열 촉진 물질을 관리하는 PLGA의 효능을 테스트하는 것은 매우 중요하다.
현재 살아있는 동물의 β 세포 증식을 측정하는 기술도 없다. 실험 따라서 immunolabeling에 대한 pancreata의 다음 해부 및 가공과, 동물을 사는 이들 화합물의 투여를 필요로 생체 내에서 잠재적 인 증식 성 화합물의 효과를 평가합니다. 이러한 프로토콜은 비싸고 힘들고, 그리고 그들이 아일렛 도달 할 어떤 보장없이 전신적으로 투여되는 화합물을 필요로한다. 반대로, 여러 β 불멸화 세포주 배양 인슐린 생성 세포의 연구에 사용할 수 있지만, 이들 세포주는 섬 구조와 environmen 부족t는 유기체 (6) 생활에서 발견. β 불멸화 세포주는, 따라서, 생체 내에서 내인성 β 세포 복제보다 훨씬 높은 수준을 갖는 증식을 유도하는 화합물의 분석이 복잡 특징으로한다. 이 연구에서 우리는 성인 쥐에서 분리 된 그대로 독도를 사용하는 프로토콜을 설명합니다. β 세포주 달리 그대로 섬 정상 섬 구조를 유지한다. 마찬가지로, 직접 배양 그대로 섬에 증식 화합물을 투여하는, 생체 내에서 실시한 실험 달리 상당히 정확하게 β 세포 증식을 측정하기 위해 필요한 시약의 양을 감소시킨다.
현재의 연구는이 예에서는, COI를 관리 할 PLGA를 활용, 재조합 인간의 결합 조직 성장 인자 (rhCTGF). 이 일에 화합물의 지속적인 방출을 허용 여기에 기술 된 방법은 배양 섬에 원료 화합물의 관리를 통해 상당한 이점을 부여E 매질. 특히,이 시험은 단백질이 그대로 섬에 관심 항체의 다양한 관리하도록 변형 될 수있다. α 세포를 포함하는 다른 내분비 세포 유형에 효과가 또한 분석 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
문화의 β 세포 증식의 연구는 일반적으로 여러 가지 어려움에 의해 방해된다. 우선, β 불멸화 세포주 라이브 아일렛 내인성 β 세포에서 발견 된 것보다 더 높은 정도의 증식을 특징으로한다. 또한 이러한 불멸화 세포주 정상 β 세포 기능에 중요한 일반 아키텍처 부족하다. 이 두 가지 사실이 결과는 생체 내에서 또는 전체 섬에서 시험했을 때 성립됩니다 불후의 β 세포 라인을 사용하여 얻…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.
Materials
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000-69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000-98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105°C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
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