Hier stellen wir eine Methodik zur Erzeugung und Verabreichung von Verbindungen aus zinsgeladenen Poly(milchsäure-co-glykolsäure) (PLGA)-Mikrosphären an intakte Mausinseln in Kultur mit anschließender Immunfluoreszenzanalyse der β-Zellproliferation vor. Diese Methode eignet sich zur Bestimmung der Wirksamkeit von Kandidaten-β-Zell-Mitogenen.
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Methodenartikel
Sustained Verabreichung von β-Zellen-Mitogene zu Intact Maus Inselchen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Entwicklung von Biomaterialien erhöht signifikant das Potential für eine gezielte Arzneimittelabgabe an eine Vielzahl von Zell- und Gewebetypen, einschließlich den pankreatischen β-Zellen. Darüber hinaus Biomaterial Partikel, Hydrogele und Gerüste bieten auch eine einzigartige Gelegenheit, steuerbaren Medikamentenabgabe aufrechterhalten, zu verabreichen zu ß-Zellen in Kultur und transplantierte Gewebe-Modelle. Diese Technologien ermöglichen die Untersuchung der Kandidaten β-Zell-Proliferation Faktoren intakte Inseln und translational relevanten System. Außerdem β-Zell - Proliferation in einem Kultursystem die Wirksamkeit und Durchführbarkeit der Kandidatenbestimmungsfaktoren für die Stimulierung ist von entscheidender Bedeutung vor uns auf in - vivo - Modellen zu bewegen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Zusammenarbeit Kultur intakte Maus Inselchen mit biologisch abbaubaren Verbindung von Interesse (COI) beladene Poly (Milch-co-Glykolsäure) (PLGA) Mikrokugeln für die Zwecke der die Auswirkungen der anhaltenden Bewertung der in - situ - Freisetzung of mitogenen Faktoren auf β-Zellproliferation. Diese Technik beschreibt im Detail, wie PLGA-Mikrokügelchen zu erzeugen, um eine gewünschte Ladung unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien enthält. Während die beschriebene Technik rekombinantes menschliches Bindegewebe-Wachstumsfaktor (rhCTGF) als Beispiel verwendet wird, könnte eine Vielzahl von COI ohne weiteres verwendet werden. Zusätzlich verwendet dieses Verfahren 96-Well-Platten, die Menge der Reagenzien zu minimieren, notwendig, β-Zellproliferation zu beurteilen. Dieses Protokoll kann ohne weiteres auf die Verwendung des alternativen Biomaterialien und anderen endokrinen Zelleigenschaften angepasst werden, wie das Überleben von Zellen und Differenzierungsstatus.
Einleitung
Pancreatic β-Zellen sind die einzigen Insulin-produzierenden Zellen im Körper und sind kritisch Blutzucker Homöostase aufrechtzuerhalten. Während gesunde Individuen ausreichend β-Zellmasse aufweisen und Funktion richtig Blutzucker, Personen mit Diabetes durch unzureichende β-Zellmasse charakterisiert und / oder Funktions 1,2 regulieren. Es ist vorgeschlagen worden , dass β-Zell - Proliferation induzierende letztlich β-Zellmasse erhöhen und Glukose - Homöostase bei Patienten mit Diabetes 3 wieder herzustellen. Allerdings Evaluierung und Validierung von potentiellen β-Zell-proliferative Verbindungen in intakten Inseln ist notwendig, bevor wirksame....
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Protokoll
Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Vanderbilt Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt und durchgeführt.
1. Labeling COI mit Fluorophore (Optional)
- Wähle einen fluoreszierenden Farbstoff, der mit einer freien primären Amin (beispielsweise auf einem Protein), wie beispielsweise Succinimidylester oder Fluorescein - Derivate reagieren, Mikrokügelchen Ladung zu visualisieren. Auflösen 8x molarer Überschuß (bezogen auf Mol COI) von Fluorophor in 200 ul Dimethylsulfoxid (DMSO).
- Resuspendieren von 50 mg COI bis zu einem Endvolumen von 800 ul in einem Fahrzeug-Lösung (Endkonzentration von 6....
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Ergebnisse
Figur 1 ist eine visuelle Darstellung der Mikrokugeln unter Verwendung des obigen Protokolls erzeugt. Das hier beschriebene Protokoll ergibt rhCTGF beladenen Mikrokügelchen in verschiedenen Größen. Der größte Teil der Mikrokügelchen zwischen 1 und 10 & mgr; m im Durchmesser sein, obwohl einige Mikrokugeln kann größer (Abbildung 2). Falls gewünscht, können Mikrokügelchen eine Größe basierend auf Herstellungsparameter abgestimmt und op.......
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Diskussion
Die Studie der β-Zellproliferation in Kultur wird typischerweise durch mehrere Schwierigkeiten behindert. Zunächst verewigt β-Zelllinien werden durch höhere Grad der Proliferation gekennzeichnet als das, was in endogenen β-Zellen in lebenden Inseln zu finden ist. Außerdem fehlt diesen immortalisierten Zelllinien die normale Architektur kritisch für die normale β-Zellfunktion. Diese beiden Tatsachen machen es schwierig , zu bestimmen , ob die Resultate mit dem verewigte β-Zelllinien erhalten wird wahr halten , wenn sie <.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Die Autoren danken Bethany Carboneau (Vanderbilt University) für die kritische Lektüre dieses Manuskripts. Wir danken auch Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) für die Isolierung von Inselzellen und Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) und Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) für die Nutzung ihrer Zentrifugen- und Gewebekulturanlage. Diese Forschung umfasste die Nutzung des Islet Procurement and Analysis Core des Vanderbilt Diabetes Research and Training Center, das durch NIH-Zuschüsse DK20593 unterstützt wurde. Diese Arbeit wurde durch ein Postdoctoral Fellowship der American Heart As....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Oregon Green 488 Carbonsäure, Succinimidylester, 6-Isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | Zur Markierung von COI mit Fluorophor |
| DMSO Dimethylsulfoxid | Fisher BioReagents | BP231-1 | Zum Auflösen von Fluorophor in Schritt 1 |
| Einweg-PD-10-Entsalzungssäulen | GE Healthcare | 17-0851-01 | Entsalzungssäule in Schritt 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-Lactid-co-glycolid), esterterminiert, Molekulargewicht 54.000 - 69.000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Wird zur Erzeugung von Mikrosphären in Stufe 2 verwendet |
| (vinylalkohol) Molekulargewicht 89.000 - 98.000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Wird zur Erzeugung von Mikrosphären in Stufe 2 |
| verwendet RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | Zur Kultivierung von Inselzellen |
| Dextrose wasserfrei | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Ergänzung für Inselmedien |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotika für Inselmedien |
| Normales Pferdeserum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Ergänzung für Inselmedien |
| 96-Well-Gewebekulturplatte | Corning | 3603 | Für die Kultivierung von Inselzellen |
| Ethylenglyko-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement für Pre-Assay-Inselmedien |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | Zum Spinnen von Zellen auf Objektträger |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | Zum Spinnen von Zellen auf Objektträger |
| Ethylendiamintetraessigsäure | Fisher BioReagents | BP118-500 | Wird bei der Dissoziation von Inselzellen |
| verwendet Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | Zur Fixierung von Zellen |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | Für die Permeabilisierung |
| von Zellen Normales Eselserum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blockierungsreagenzien für Immunfluoreszenz |
| Anti-Ki67-Antikörper | abcam | ab15580 | Für Ki67-Immunfluoreszenz |
| Polyklonales Meerschweinchen Anti-Insulin | Dako | A0564 | Für Insulin-Immunfluoreszenz |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Für Ki67-Immunfluoreszenz |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | Für Insulin-Immunfluoreszenz |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid) | ThermoFisher Scientific | D1306 | Für die Zellkernvisualisierung in Immunfluoreszenz |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Schnelltrocknende Einbettmedien |
| FreeZone -105 ° C 4,5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | Für die Lyophilisierung von Mikrosphären |
Referenzen
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R.
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Nachdrucke und Genehmigungen
