Sustained Verabreichung von β-Zellen-Mitogene zu Intact Maus Inselchen<em> Ex Vivo</em> Verwendung von biologisch abbaubaren Poly (Milch-co-Glykolsäure) Microspheres
Summary
Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.
Abstract
Die Entwicklung von Biomaterialien erhöht signifikant das Potential für eine gezielte Arzneimittelabgabe an eine Vielzahl von Zell- und Gewebetypen, einschließlich den pankreatischen β-Zellen. Darüber hinaus Biomaterial Partikel, Hydrogele und Gerüste bieten auch eine einzigartige Gelegenheit, steuerbaren Medikamentenabgabe aufrechterhalten, zu verabreichen zu ß-Zellen in Kultur und transplantierte Gewebe-Modelle. Diese Technologien ermöglichen die Untersuchung der Kandidaten β-Zell-Proliferation Faktoren intakte Inseln und translational relevanten System. Außerdem β-Zell – Proliferation in einem Kultursystem die Wirksamkeit und Durchführbarkeit der Kandidatenbestimmungsfaktoren für die Stimulierung ist von entscheidender Bedeutung vor uns auf in – vivo – Modellen zu bewegen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Zusammenarbeit Kultur intakte Maus Inselchen mit biologisch abbaubaren Verbindung von Interesse (COI) beladene Poly (Milch-co-Glykolsäure) (PLGA) Mikrokugeln für die Zwecke der die Auswirkungen der anhaltenden Bewertung der in – situ – Freisetzung of mitogenen Faktoren auf β-Zellproliferation. Diese Technik beschreibt im Detail, wie PLGA-Mikrokügelchen zu erzeugen, um eine gewünschte Ladung unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien enthält. Während die beschriebene Technik rekombinantes menschliches Bindegewebe-Wachstumsfaktor (rhCTGF) als Beispiel verwendet wird, könnte eine Vielzahl von COI ohne weiteres verwendet werden. Zusätzlich verwendet dieses Verfahren 96-Well-Platten, die Menge der Reagenzien zu minimieren, notwendig, β-Zellproliferation zu beurteilen. Dieses Protokoll kann ohne weiteres auf die Verwendung des alternativen Biomaterialien und anderen endokrinen Zelleigenschaften angepasst werden, wie das Überleben von Zellen und Differenzierungsstatus.
Introduction
Pancreatic β-Zellen sind die einzigen Insulin-produzierenden Zellen im Körper und sind kritisch Blutzucker Homöostase aufrechtzuerhalten. Während gesunde Individuen ausreichend β-Zellmasse aufweisen und Funktion richtig Blutzucker, Personen mit Diabetes durch unzureichende β-Zellmasse charakterisiert und / oder Funktions 1,2 regulieren. Es ist vorgeschlagen worden , dass β-Zell – Proliferation induzierende letztlich β-Zellmasse erhöhen und Glukose – Homöostase bei Patienten mit Diabetes 3 wieder herzustellen. Allerdings Evaluierung und Validierung von potentiellen β-Zell-proliferative Verbindungen in intakten Inseln ist notwendig, bevor wirksame Therapien entwickelt werden können. Die Transplantation von menschlichen Kadaver Inseln in Personen mit Diabetes stellt Blutzucker-Homöostase für einige Zeit, aber die Verfügbarkeit und den Erfolg dieses experimentellen Verfahrens wird durch einen Mangel an menschlichen Inselchen für Transplantation und von ß-Zelltod in den kleinen Inseln achtern behinderter Transplantation 4. Selbst mit der Entdeckung von Faktoren , die die Vermehrung von Insulin-produzierenden Zellen zu induzieren, eine große Herausforderung noch existiert , diese Faktoren zu den relevanten Stellen in vivo zu liefern. Eine Strategie für eine nachhaltige lokale Auslieferung von β-Zellen-proliferative Verbindungen ist Poly (Milch-co-Glykolsäure) (PLGA). PLGA hat eine Geschichte der Verwendung in FDA Drug – Delivery – Produkte zugelassen seiner hohen Sicherheit durch, die biologische Abbaubarkeit und erweiterte Freisetzungskinetik 5. Insbesondere ist PLGA ein Copolymer aus Lactid und Glycolid , das mit Wasser durch Hydrolyse abgebaut wird entweder in vivo oder in Kultur zu Milchsäure und Glykolsäure, die natürlich Metaboliten im Körper auftreten. Die verkapselte Wirkstoff-Verbindung kann sowohl durch Diffusion und / oder Abbau gesteuerte Freisetzungsmechanismen in die Umgebung freigesetzt werden. Verkapselung von COI bietet Schutz vor enzymatischem Abbau, die Verbesserung der Bioverfügbarkeit des Reagens gegenüber unencapsulated COI 5. Wir schlagen vor , dass PLGA – Mikrokügelchen verwendet werden können Kandidatenverbindungen auf intakte Inseln in Kultur zu verabreichen, und letztlich in vivo. Testen der Wirksamkeit von PLGA β-Zell – Mitogene zu verabreichen vivo zu Inselchen ex ist kritisch , vor der Transplantation Protokolle untersucht werden.
Derzeit gibt es keine Technik, β-Zellproliferation in lebenden Tieren zu messen. Experimente Wirksamkeit potenzieller proliferative Verbindungen in vivo zu beurteilen , daher Verabreichung dieser Verbindungen erfordern Tiere zu leben, mit anschließender Trennung und Verarbeitung von Bauchspeicheldrüsen für Immunmarkierung. Solche Protokolle sind teuer und mühsam, und erfordern die Verbindung systemisch verabreicht werden, ohne Garantie, dass sie die Inseln zu erreichen. Umgekehrt sind einige immortalisierte β-Zelllinien für die Untersuchung von Insulin-produzierenden Zellen in Kultur zur Verfügung, aber diese Zellinien fehlt das islet Architektur und environment gefunden in lebenden Organismen 6. Immortalisierte β-Zelllinien sind auch als mit einem viel höheren Grad an Replikations als endogene β-Zellen in vivo charakterisiert, wodurch Analyse von Verbindungen komplizieren die Proliferation induzieren. In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll, das intakte Inseln, isoliert aus erwachsenen Mäusen verwendet. Im Gegensatz zu β-Zelllinien behalten intakte Inseln normale Inselarchitektur. Ebenso reduziert im Gegensatz zu Experimenten in vivo durchgeführt, Verabreichen proliferative Verbindungen direkt mit kultivierten intakte Inseln signifikant die Menge an Reagenzien , die genau erforderlich ist , um β-Zell – Proliferation zu messen.
Die vorliegende Studie verwendet PLGA ein COI, in diesem Beispiel rekombinantes menschliches Bindegewebe-Wachstumsfaktor (rhCTGF) zu verabreichen. Das hier beschriebene Verfahren verleiht einen signifikanten Vorteil gegenüber der Verabreichung von rohen Verbindung zu kultivierten Inseln, wie es für eine kontinuierliche Freisetzung der Verbindung in th erlaubte Medien. Bemerkenswert ist, kann dieser Assay eine Vielzahl von Proteinen und Antikörpern von Interesse intakte Inseln zu verabreichen, werden modifiziert. Auswirkungen auf andere endokrine Zelltypen, einschließlich α-Zellen, ebenfalls analysiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Studie der β-Zellproliferation in Kultur wird typischerweise durch mehrere Schwierigkeiten behindert. Zunächst verewigt β-Zelllinien werden durch höhere Grad der Proliferation gekennzeichnet als das, was in endogenen β-Zellen in lebenden Inseln zu finden ist. Außerdem fehlt diesen immortalisierten Zelllinien die normale Architektur kritisch für die normale β-Zellfunktion. Diese beiden Tatsachen machen es schwierig , zu bestimmen , ob die Resultate mit dem verewigte β-Zelllinien erhalten wird wahr halten , w…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.
Materials
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000-69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000-98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105°C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
References
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823 (2012).
- Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).
- Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
- Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255 (2007).
- Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).
- Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).
- Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).
- Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).
- Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX – a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).
- Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).
- Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).
- Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).
- Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).
