無傷のマウスの膵島のβ細胞のマイトジェンの持続的投与<em> ex vivoで</em>生分解性ポリ（乳酸-co-グリコール酸）微小球を使用して
Summary
Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.
Abstract
生体材料の開発は、膵臓β細胞を含む、細胞および組織型の様々な標的化薬物送達の可能性を大幅に増加しています。また、生体材料の粒子、ヒドロゲル、および足場はまた、培養及び移植された組織モデルでβ細胞に対する持続的な、制御可能な薬物送達を管理するためのユニークな機会を提供します。これらの技術は、無傷の膵島と翻訳関連システムを使用して、候補β細胞増殖因子の研究を可能にします。また、培養系でβ細胞増殖を刺激するための候補因子の有効性と実現可能性を決定することは、in vivoモデルを楽しみに移動する前に重要です。ここで、我々は、関心のある生分解性化合物（COI）で無傷のマウスの膵島は、その場放出 O の持続的効果を評価する目的で、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）ミクロスフェア-loaded共培養する方法が記載さβ細胞の増殖に対するF分裂促進要因。この技術は、市販の試薬を用いて所望のカーゴを含有PLGA微小球を生成する方法を詳細に記載しています。記載された技術は、例えば、組換えヒト結合組織成長因子（rhCTGF）を使用しながら、COIの多種多様を容易に使用することができます。さらに、この方法は、β細胞増殖を評価するために必要な試薬の量を最小限にするために96ウェルプレートを使用します。このプロトコルは、容易にそのような細胞生存および分化の状態のような代替の生体材料及び他の内分泌細胞の特徴を使用するように適合させることができます。
Introduction
膵β細胞は体内で唯一のインスリン産生細胞であり、血中グルコース恒常性を維持するために重要です。健康な個体は、十分なβ細胞塊を有し、適切に血糖値を調節するように機能するが、糖尿病を有する個体は、不十分なβ細胞の質量および/または機能1,2を特徴とします。 β細胞の増殖を誘導することは、最終的にβ細胞量を増加させ、糖尿病の3を有する個体においてグルコース恒常性を復元することができることが提案されています。効果的な治療法が開発される前に、しかし、無傷の膵島における潜在的なβ細胞増殖性化合物の評価と検証が必要です。糖尿病を持つ個人に死体ヒト膵島の移植はしばらくの間、血中グルコース恒常性を復元しますが、この実験手順の可用性と成功は、移植のために利用可能なヒト膵島の不足によりおよび膵島の後方におけるβ細胞死によって妨げられていますER移植4。でもインスリン産生細胞の増殖を誘導する因子の発見で、主な課題は、まだin vivoでの関連サイトにこれらの要因を配信中に存在します。 β細胞増殖化合物の持続的局所送達のための1つの戦略は、ポリ（乳酸 – コ – グリコール酸）（PLGA）です。 PLGAは、高い安全性、生分解性、および持続放出動態5による薬物送達製品を承認FDAに使用の歴史を有します。具体的には、PLGAは、 インビボまたは天然に体内で代謝産物を発生している乳酸およびグリコール酸への培養物のいずれかの水で加水分解により劣化ラクチドとグリコリドの共重合体です。封入された薬物化合物は、拡散および/または分解制御放出機序の両方によって、周囲の環境に放出することができます。 COIのカプセル化はunencapsulaに比べ試薬の生物学的利用能を向上させる、酵素分解に対する保護を提供していますテッドCOI 5。我々は、PLGAミクロスフェアは、培養において、最終的にインビボで無傷の膵島に候補化合物を投与するために使用され得ることを示唆しています。移植プロトコルが模索される前に、ex vivoでの膵島するβ細胞マイトジェンを管理するためにPLGAの有効性をテストすることが重要です。
現在、生きた動物におけるβ細胞の増殖を測定するために何の技術がありません。 in vivoでの潜在的な増殖性化合物の有効性を評価するための実験は、したがって、免疫標識のための膵臓のその後の解剖および処理で、動物を生きるために、これらの化合物の投与を必要とします。そのようなプロトコルは、高価で面倒であり、そしてそれらは島に到達するという保証なしに、全身的に投与される化合物を必要とします。逆に、いくつかの不死化β細胞株は、培養物中のインスリン産生細胞の研究に利用可能であるが、これらの細胞株は、膵島アーキテクチャとenvironmenを欠きますtは生物6で見つかりました。不死化β細胞株はまた、このようにして増殖を誘導する化合物の分析を複雑に、 インビボでの内因性のβ細胞よりも複製の非常に高い程度を有することを特徴とします。本研究では、成体マウスから単離された無傷の膵島を使用するプロトコルを記述します。 β細胞株とは異なり、無傷の膵島は、通常の膵島アーキテクチャを保持しています。同様に、培養された無傷の膵島に直接増殖性化合物を投与すること、in vivoで行った実験とは対照的には、かなり正確にβ細胞増殖を測定する必要がある試薬の量を減少させます。
現在の研究は、この例では、COIを投与するためにPLGAを使用し、組換えヒト結合組織成長因子（rhCTGF）。それは目への化合物の継続的な放出を可能にするとして、ここで説明する方法は、培養された膵島への原料化合物を投与する上で重要な利点を付与します電子メディア。特に、このアッセイは、タンパク質と、無傷島に対する目的の抗体の多種多様を投与するために改変することができます。 α細胞を含む他の内分泌細胞型への影響も分析することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
培養中のβ細胞増殖の研究は、一般的にいくつかの困難によって妨げられています。まず、不死化β細胞株は、生膵島における内因性β細胞で見られるものよりも、増殖の高い程度によって特徴付けられます。さらに、これらの不死化細胞株は通常のβ細胞機能のための重要な正常な構造を欠いています。これらの2つの事実は、結果が、インビボまたは全体の島で試験したとき、真の保?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.
Materials
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000-69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000-98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105°C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
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