Bozulmamış Fare Adacık için β-hücre mitogenlerin Sürekli İdaresi<em> Ex Vivo</em> Biyolojik olarak parçalanabilir poli (laktik-ko-glikolik asit) mikro kullanılması
Summary
Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.
Abstract
biyo gelişimi, pankreas β-hücreleri de dahil olmak, hücre ve doku tiplerinin çeşitli hedeflenen ilaç iletimi için potansiyel önemli ölçüde arttırmıştır. Buna ek olarak, biyomalzeme parçacıklar, hidrojeller ve iskeleleri de eşsiz bir fırsat sunmak sürekli yönetebileceğini için, kontrol ilaç dağıtım ß-hücrelerinin kültür ve nakledilen doku modelleri. Bu teknolojiler sağlam adacıklar ve bir öteleme ilgili sistemini kullanarak aday β-hücre çoğalma faktörleri çalışma izin verir. Ayrıca, bir kültür sistemi içinde β-hücresi çoğalmasının uyarılması için aday faktörlerinin etkinliği ve uygulanabildiğini ortaya in vivo modeller ilerlemeden önce önemlidir. Bu yazıda, ilgi biyobozunur bileşik (ÇÇ) -yüklü poli (laktik-ko-glikolik asit) in situ bırakma o da sürekli etkilerini değerlendirmek amacıyla (PLGA) mikroküreler ile bozulmamış fare adacıklar kültür işbirliği için bir yöntem tarifβ-hücre çoğalması f mitojenik faktörler. Bu teknik, ticari olarak temin edilebilir maddeler kullanarak istediğiniz kargo içeren PLGA mikro küreler oluşturmak için nasıl ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. tarif edilen teknik, bir örnek olarak, rekombinant insan bağ dokusu büyüme faktörü (rhCTGF) kullanırken, COI çok çeşitli kolaylıkla kullanılabilir. Buna ek olarak, bu yöntem, β-hücresi çoğalmasını değerlendirmek için gerekli reaktiflerin miktarını en aza indirmek için, 96 gözlü levhalar kullanmaktadır. Bu protokol, hali hazırda alternatif bir biyo materyaller ve hücre yaşamım ve durumu gibi diğer endokrin hücre özelliklerini kullanmak için adapte edilebilir.
Introduction
Pankreas β-hücrelerinin vücuttaki yalnızca insülin üreten hücreler ve kan glukoz homeostazı sürdürmek için önemlidir. Sağlıklı bireylerin yeterli β-hücresi kütlesi ve uygun kan şekeri düzenleme işlevi de, diyabetli kişilerin yeterli β-hücresi kütlesi ve / veya fonksiyonu 1,2 ile karakterize edilmektedir. Β-hücresi çoğalmasını indükleyen sonuçta β-hücresi kütlesini artırmak ve diyabet 3 bireylerde glikoz dengesini geri olabilir önerilmiştir. etkili tedavilerin geliştirilebilir önce ancak, değerlendirme ve bozulmamış adacıklardaki potansiyel β-hücresi proliferatif bileşiklerin doğrulama gereklidir. Diyabetli bireyler haline kadavra insan adacıklar Nakli süredir kan glikoz dengesini geri yükler, ancak kullanılabilirliği ve bu deneysel işlemin başarısı adacıkları kıç nakli için mevcut insan adacık bir sıkıntısı ve ß-hücre ölümüne tarafından engellenirer nakli 4. Hatta insülin üreten hücrelerin çoğalmasını faktörlerin keşfiyle, büyük bir sorun hala in vivo ilgili sitelere bu faktörlerin teslim bulunmaktadır. β-hücresi proliferatif bileşiklerinin sürekli olarak verilmesi için bir strateji, poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA). PLGA FDA kullanım öyküsü, yüksek güvenlik, biyolojik olarak parçalanma ve uzatılmış salım kinetik 5 sayesinde ilaç verme ürünlerini onaylı vardır. Özellikle PLGA in vivo ya da vücutta doğal olarak oluşan metabolitlerin laktik asit ve glikolik asit içine kültüründe ya su ile hidroliz ile degrade laktit ve glikolid kopolimeridir. Kapsüllenmiş madde bileşiği, difüzyon ve / veya bozunma kontrollü salım mekanizmalarının her ikisi tarafından çevredeki salınabilir. COI kapsüllenmesi unencapsula göre reaktif biyolojik alınabilirliğini geliştirmek için, enzimatik bozulmaya karşı koruma sağlarted COI 5. Bu PLGA mikro-kültür, bozulmamış adacıklardaki Aday bileşiklerin uygulanması için kullanılan ve edilebilir nihai olarak canlı üzerinde olduğunu göstermektedir. Transplantasyon protokolleri incelenmiştir önce ex vivo adacıklar için β-hücre mitojenler yönetmek için PLGA etkinliğini test önemlidir.
Şu anda, canlı hayvanlarda β-hücresi çoğalmasını ölçmek için herhangi bir teknik yoktur. Deneyler, bu nedenle immunolabeling için Pankreatanın sonraki diseksiyon ve işleme, canlı hayvan bu bileşiklerin tatbikatını gerektiren in vivo potansiyel proliferatif bileşiklerinin etkinliğini değerlendirmek. Bu protokoller, pahalı ve zahmetli olan, ve adacıklar ulaşacak bir garantisi olmadan, sistemik olarak uygulanabilir bileşiğin gerektirir. Bunun aksine, çok ölümsüzleştirilmiş β-hücreleri, kültür insülin üreten hücrelerin çalışma için kullanılabilir, ancak bu hücre hatları adacık mimarisi ve ORTAM eksikliğit organizmalar 6 canlı bulundu. Ölümsüzleştirilmiş β-hücre hatları da, böylece, in vivo endogen β-hücrelerinin daha replikasyon çok daha yüksek bir derecesine sahip proliferasyonunu bileşiklerin analizi komplike olarak karakterize edilir. Bu çalışmada, yetişkin farelerden izole edilen sağlam adacıklar kullanan bir protokol açıklar. β-hücresi çizgileri farklı olarak, bozulmamış adacıklardaki normal adacık mimarisi korur. Benzer şekilde, doğrudan kültür, bozulmamış adacıklardaki proliferatif bileşiklerin uygulanması İn vivo yapılan deneylerde, aksine önemli ölçüde doğru β-hücresi çoğalmasını ölçmek için gerekli olan reaktifler miktarını azaltmaktadır.
Bu çalışma, bu örnekte, bir COI yönetmek için PLGA kullanan rekombinant insan bağ dokusu büyüme faktörü (rhCTGF). Bu inci halinde bileşik sürekli salgılanmasına izin veren burada tarif edilen yöntem, kültürlenmiş adacık ham bileşiğin tatbikat üzerine önemli bir avantaj kazandırane medya. Özellikle, bu deney proteinler ve bozulmamış adacıklardaki ilgi antikorların çeşitli yönetmek için değiştirilebilir. α-hücreleri de dahil olmak üzere başka endokrin hücre tipleri üzerinde etkiler de analiz edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
kültür içinde β-hücresi çoğalmasının bir çalışma tipik olarak birkaç zorluklar tarafından engellenmiştir. İlk olarak, ölümsüzleştirilmiş β-hücresi çizgileri canlı adacıklar endojen β-hücrelerinde bulunan daha çoğalmasının yüksek derecede karakterize edilir. Buna ek olarak, bu ölümsüz hücre kuşakları, normal β-hücresi fonksiyonu için kritik normal yapısını yoksundur. Bu iki olgu sonuçlar, in vivo ya da bütün adacıklar test edildiğinde de geçerli olacaktır ölü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.
Materials
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000-69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000-98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105°C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
References
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823 (2012).
- Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).
- Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
- Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255 (2007).
- Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).
- Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).
- Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).
- Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).
- Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX – a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).
- Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).
- Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).
- Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).
- Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).
