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Biology

Análise cinemática da Divisão Celular e Expansão: Quantificar a base celular de crescimento e de amostragem de desenvolvimento zonas em Published: December 2, 2016 doi: 10.3791/54887
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, University of Antwerp
* These authors contributed equally

Introduction

Análise de crescimento depende de um conjunto de ferramentas que são comumente usados ​​por cientistas de planta para descrever as diferenças de crescimento genótipo determinado e / ou respostas fenotípicas a fatores ambientais. Eles incluem tamanho e peso medições da planta inteira ou um órgão e cálculos de taxas de crescimento para explorar os mecanismos subjacentes de crescimento. Crescimento dos órgãos é determinada por divisão celular e de expansão ao nível celular. Portanto, incluindo a quantificação desses dois processos no crescimento análises é fundamental para compreender as diferenças no crescimento do órgão inteiro 1. Por conseguinte, é fundamental ter uma metodologia adequada para determinar os parâmetros de crescimento celular que é relativamente fácil de usar por laboratórios não especializados.

A análise cinemática já foi estabelecida como uma abordagem fornecendo uma estrutura poderosa para o desenvolvimento de modelos de crescimento de órgãos 2. A técnica foi optimizado para sistemas lineares,tais como raízes e folhas de Arabidopsis thaliana monocotiledóneas, mas também para os sistemas não lineares, tais como folhas dicotiledóneas 3. Hoje em dia, esta metodologia está cada vez mais sendo usado para estudar como genética, hormonal, de desenvolvimento e fatores ambientais influenciam a divisão celular e expansão em vários órgãos (Tabela 1). Além disso, também fornece uma estrutura para conectar processos celulares aos seus regulamentos bioquímicas, moleculares e fisiológicos subjacentes (Tabela 2), embora as limitações podem ser impostas por tamanho do órgão e da organização espacial para técnicas que exigem maiores quantidades de material vegetal (por exemplo, metabólitos medições, proteômica, etc.).

Folhas de monocotiledóneas, como o milho (Zea mays) da folha, representam sistemas lineares em que as células se movem a partir da base da folha em direcção a ponta, passando sequencialmente através da zona de meristema e alongamento para atingir a maturidadezona. Isto o torna um sistema modelo ideal para estudos quantitativos dos padrões espaciais de crescimento de 4. Além disso, folhas de milho têm zonas de grande crescimento (meristema e zona de alongamento abrangendo vários centímetros 5) e proporcionar possibilidades para estudos em outros níveis organizacionais. Isto permite a investigação dos mecanismos de regulação (putativos) que controlam a divisão celular e expansão, quantificada por análise cinemática através de uma série de técnicas moleculares, medições fisiológicas e abordagens de biologia celular (Tabela 2).

Aqui, nós fornecemos um protocolo para a realização de uma análise cinemática em folhas de monocotiledôneas. Em primeiro lugar, vamos explicar como conduzir uma análise adequada de ambos divisão celular e alongamento celular como uma função da posição ao longo do eixo da folha e como calcular parâmetros cinemáticos. Em segundo lugar, também mostrar como este pode ser usado como uma base para a concepção de amostragem. Aqui, discutimos dois casos: de alta resolução de uma amostragemd focado amostragem, permitindo uma melhor interpretação dos dados e economia de tempo / dinheiro, respectivamente.

Tabela 1. Visão Geral de cinemática analisa métodos de quantificação da divisão celular e expansão em vários órgãos.

órgão referência
folhas monocotiledôneas 16, 20, 21, 22
dicas de raiz 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29
folhas de dicotiledôneas 21, 30, 31
atirar meristema apical 32

Tabela 1. Visão Geral de cinemática analisa métodos de quantificação da divisão celular e expansão em vários órgãos.

Tabela 2. A ligação entre os processos celulares quantificados pela análise cinemática a sua regulação ao nível molecular. As referências a diversos estudos de ligação a quantificação de processos celulares com os resultados de ensaios bioquímicos e moleculares em várias espécies e órgãos. Endotransglucosylase xiloglucano (XET), malondialdeído (MDA), quinases dependentes da ciclina (CDK). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

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Protocol

NOTA: O protocolo a seguir para análise cinemática é válida apenas para as folhas durante o crescimento em estado estacionário. Tal implica uma taxa de alongamento foliar estável e padrões espaciais de comprimento e expansão celular em uma folha durante um período de vários dias 6.

1. crescimento da planta e Medidas de alongamento foliar Rate (LER)

  1. Escolha uma folha em crescimento em estado estacionário e um estágio de desenvolvimento de interesse.
    NOTA: Há uma diferença entre o crescimento do steady-state e crescimento repetitivo, o que implica padrões espaciais semelhantes nas folhas sucessivas no mesmo eixo. Durante as fases iniciais de crescimento das mudas, folhas sucessivas normalmente crescem cada vez mais rápido devido ao tamanho crescente da zona de crescimento de 7. Embora algumas posições folha superior pode ter um padrão de crescimento semelhante 8, isto é uma fase transitória que podem ser afectados pelos tratamentos sob investigação. Por isso, é importante comparar as linhas e tr eatments estritamente na mesma posição da folha, mesmo que possa ser desenvolvimento em um momento diferente. Mesmo a uma taxa de alongamento constante, o perfil da taxa de crescimento não é necessariamente a mesma em diferentes fases de desenvolvimento. Portanto, é importante analisar as folhas no mesmo estágio de desenvolvimento 8, normalmente definido pelo número de dias após a emergência.
  2. Para executar uma análise cinemática cheia de crescimento da folha em monocotiledôneas, crescer pelo menos 15 plantas para cada tratamento eo genótipo sob condições controladas em sala de crescimento.
  3. No momento em que a folha de interesse é exibida (surgimento do verticilo de folhas vizinhas), iniciar a medição do comprimento da folha diariamente com uma régua até que a folha seja totalmente expandida (Figura 1-I). comprimento da folha implica o comprimento a partir do nível do solo para a ponta da folha. Tenha cuidado para não quebrar ou danificar a folha, uma vez que este possa alterar o seu crescimento.

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Figura 1:. Visão esquemática de uma análise cinemática de folhas de milho A folha de interesse é medida com uma régua por três dias consecutivos para calcular o alongamento foliar Rate (LER). Em seguida, a folha é colhida e um segmento de três centímetros é usada para a determinação do tamanho de meristema. Isto é feito através da medição do comprimento desde a base até a figura mitótico mais distal, após coloração com DAPI. (A) Os exemplos de figuras de mitose proliferativa e (B) figuras de mitose formativos. As primeiras onze centímetros da base da folha do outro lado da veia meados são usados ​​para cortar dez segmentos de um centímetro de comprimento para medições de células. Essas medições fornecem a base para a criação do perfil de comprimento celular, que serve para determinar o comprimento maduro de células (l MAT) e o comprimento das células que saem do meristema (l div). o l e LER esteira são utilizados para calcular a taxa de produção de células (P), enquanto que L e L div mer são utilizadas para calcular o número de células no meristema (mer N). Por sua vez, P e N mer são utilizadas para calcular a taxa de divisão celular média (D), que é o inverso da duração do ciclo celular (t c). Setas da mesma cor indicam parâmetros que são usados ​​para calcular o parâmetro a seguir nesses flechas. Barras de escala = 40 uM. Algarismos romanos são usados para se referir a procedimentos experimentais específicos descritos no protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. A colheita

  1. Na fase de desenvolvimento de interesse (por exemplo, no terceiro dia após a emergência), escolher pelo menos cinco representante plantes do lote em que a condução da análise cinemática. Continuar a medir o resto das plantas, tal como explicado no passo 1.3 para determinar o comprimento da folha final.
  2. Corte a parte aérea da planta. Para manter a parte meristematic intacta, corte o mais próximo possível às raízes (Figura 1ii).
  3. A partir das folhas externas, remover todos deixa-se à folha de interesse delicadamente desenrolando-los um por um. Se necessário, remover alguns milímetros adicionais a partir da base para separar as folhas. Também remover as folhas apicais e pequenas fechados pela folha de interesse (Figura 1iii).
  4. Cortar um segmento de 3 cm, a partir da base de um lado da veia meio, e armazená-la num tubo de 1,5 ml de teste preenchido com 3: 1 (v: v) de etanol absoluto: uma solução de ácido acético (CUIDADO: usar luvas) a 4 ° C durante 24 horas até vários meses (Figura 1iv). Este segmento será mais tarde utilizada para determinar o comprimento do meristema.
  5. Deoutro lado da veia, cortar um segmento de 11 centímetros a partir da base (Figura 1 v) e colocá-lo em um tubo de 15 ml cheio com etanol absoluto a 4 ° C durante pelo menos 6 horas para remover pigmentos (Figura 1 VI).
    NOTA: Mais tarde, usar apenas os primeiros 10 cm para determinar o perfil de comprimento celular (ver Discussão).
  6. Renovar o etanol absoluto para outra rodada de limpeza a 4 ° C durante pelo menos 24 horas (Figura 1vi).
  7. Finalmente, a substituição de etanol absoluto com ácido láctico puro (CUIDADO: usar luvas) para a limpeza e armazenagem a 4 ° C durante 24 h ou até à sua utilização (Figura 1vi).

3. das medições de comprimento meristema

  1. Preparar um tampão de lavagem contendo 50 mM de cloreto de sódio (NaCl), ácido etilenodiaminotetra-acético 5 mM (EDTA; CUIDADO: usar luvas) e 10 mM de Tris (hidroximetil) aminometano-ácido clorídrico (Tris-HCl; pH 7).
  2. Leve o segmento de 3 cm do ponto 2.4 e assimak-lo no tampão durante 20 minutos (Figura 1vii).
  3. Enquanto espera, usar o tampão de lavagem para preparar uma solução de coloração 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) de 1 ug / ml, mantendo-o em gelo e no escuro.
  4. Manchar os núcleos através da colocação do segmento de meristema para 2-5 min em solução de coloração DAPI. Trabalhar no gelo e no escuro (Figura 1vii).
  5. Verifique se há sinal de fluorescência por rapidamente a montagem do segmento em um vidro microscopia e cobrindo-o com uma tampa de vidro. As células epidérmicas deve mostrar fluorescência, enquanto que as camadas de células subjacentes não deveria.
  6. Se a coloração não é suficiente, colocar o segmento de volta na solução de coloração DAPI durante alguns minutos adicionais.
  7. Para parar a coloração, montar os segmentos em uma gota de tampão de lavagem em uma lâmina de microscopia e cubra com uma tampa de vidro.
  8. Usar um microscópio equipado com UV de fluorescência com uma ampliação de 20X, permitindo a visualização de cerca de 1,000 epidermecélulas ao mesmo tempo. Rolar em todo o segmento e procurar números de proliferação de mitose (metáfase, anáfase, telófase e citocinese), mas evitar a divisão celular formativa dos estômatos em desenvolvimento (Figura 1viii) 9. Definir onde a figura mitótico mais distal está localizado.
  9. Determinar o comprimento do meristema através da medição da distância entre a base da folha e a figura mitótico mais distai epidérmica. Use um software de análise de imagens (por exemplo, ImageJ) para medir o comprimento total do quadro da imagem.
    1. Contar o número de quadros que cobrem o comprimento total meristema (a partir da base da folha a figura mitótico mais distal) e multiplicando este número pelo comprimento de um quadro para obter o comprimento meristema completo (Figura 1ix).

4. celular Comprimento Perfil

  1. Leve o segmento que é armazenado em ácido lático (passo 2.5) e colocá-lo cuidadosamente no banco. Corte a sagacidade segmentosha bisturi em 10 segmentos de aproximadamente 1 cm de cada (Figura 1x).
  2. Montar os segmentos de folhas sucessivas sobre uma lâmina de microscópio em uma pequena gota de ácido láctico. Certifique-se para enfrentar de forma consistente ou o adaxial ou abaxial para cima. Em princípio, não existe uma preferência para um lado particular.
  3. Usar um microscópio equipado com contraste de interferência diferencial (DIC) a óptica, para analisar os segmentos, a partir da base da folha. Medida com um software de análise de imagem do comprimento de pelo menos 20 células epidérmicas replicar em ficheiros directamente adjacentes aos ficheiros estomática, a fim de seleccionar de forma consistente o mesmo tipo de célula.
    1. Faça isso em posições igualmente espaçadas ao longo de cada um dos segmentos (4 posições por bastam segmento), e certifique-se de anotar a posição correspondente para cada medição em toda a folha (Figura 1xi).
  4. Determinar o comprimento médio de célula a cada mm ao longo do eixo da folha usando um local de polinomial suavização pROCEDIMENTO, implementado em um R-script (Figura 1xii; Documento Suplementar 1).
    NOTA: O R-script fornece uma série de dados com o aumento da suavização. A quantidade de suavização necessário é um pouco arbitrária e, idealmente, deve apenas remover o ruído local, mas não afeta a curva geral. Certifique-se de usar a mesma quantidade de suavização para todas as amostras dentro de um experimento.
  5. Calcular a média dos comprimento de célula em cada posição de entre plantas e calcular o erro padrão para criar um perfil de comprimento de célula ao longo do eixo da folha.

5. Cálculos de cinemáticas parâmetros (veja Documento Suplementar 2)

  1. Calcular a LER tomando a mudança no comprimento da folha entre os dois pontos de tempo sucessivos (por exemplo, 24 horas, tal como no passo 1.3) e dividindo-a pelo intervalo de tempo.
  2. Calcular o comprimento da zona de crescimento (G GZ) correspondente à posição distai a partir da base em que as células atingem a 95% do seu ce maduracomprimento LL do perfil de comprimento celular smoothened.
    1. Aqui, para cada posição sobre o perfil smoothened comprimento célula 95% da média de todos os comprimentos de células seguintes que a posição (Figura 2).
    2. Comparar os comprimentos de células smoothened (passo 4.4) com o comprimento de células 95%, calculado em cada posição. A partir da base da folha, a zona de crescimento termina na posição onde o comprimento real da célula é igual a 95% dos seguintes comprimentos de células (Figura 2; ver Dados Suplementar 2).

Figura 2
Figura 2:. Determinar o final da zona de crescimento do meristema: na posição indicada com um asterisco vermelho, o tamanho real da célula é mais pequeno do que 95% (linha pontilhada vermelho) do tamanho de célula médio de todas as células que se segue nesta posição (sólido vermelho linha). A extremidade da zona de crescimento (G GZ; indicada com abestrela lue) está localizado em que 95% (linha pontilhada azul) do tamanho de célula médio de todas as células que se segue nesta posição (linha azul sólido) é igual ao tamanho real da célula. Divisão zona (D), zona de alongamento (E), e zona madura (M). As setas tracejadas indicam a convergência entre a dimensão local e 95% do tamanho médio sobre a porção distal da folha quando se deslocam a partir das posições basal até a ponta da folha. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Calcular o comprimento da zona de alongamento (L EL) como a diferença entre o comprimento da zona de crescimento (G GZ) e o tamanho do meristema (L mer; determinado no passo 3).
  2. Calcular o comprimento da célula madura (l MAT) como o comprimento médio de célula na zona madura.
  3. Divida a LER por l tapete para obter otaxa de produção de células (P).
  4. Calcular o número de células na zona de alongamento (N EL) como a diferença entre o N e N GZ mer. O número de células do meristema (mer N) é igual ao número total de células localizadas nos intervalos correspondentes ao meristema. O número de células na zona de crescimento (GZ N) é igual ao número cumulativo de células localizadas nos intervalos correspondentes à zona de crescimento.
  5. Calcula-se a taxa de divisão celular média (D) como mer P / N. A duração do ciclo celular (t c) é igual a ln (2) / D.
  6. Calcular o tempo na zona de alongamento (t el) dividindo N el por P. O tempo na zona de divisão igual a 2 log (N mer) * T c. O comprimento de células que saem do meristema (l div)é igual ao comprimento da célula a partir do perfil de comprimento smoothened celular no final do meristema.
  7. Calcular a taxa média de expansão celular (R el) usando seguinte fórmula: ln (l mat) -ln (l div)] / T el.

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Representative Results

Aqui, mostramos uma comparação entre as plantas bem irrigadas (controle, o conteúdo de água no solo de 54%, (SWC)) e plantas submetidas a condições de seca de stress (seca, 34% SWC) em termos de crescimento da folha. Todas as plantas foram cultivadas numa câmara de crescimento, sob condições controladas (16 h dia / noite de 8 h, 25 ° C / 18 ° C dia / noite, 300-400 μEm -2 seg -1 radiação fotossinteticamente activa (PAR). As condições de seca foram estabelecidos pela água retendo até o SWC correto foi alcançado e, em seguida, ainda mantida. Em um estudo preliminar, foi definido que o quinto folha é a primeira a emergir e desenvolver-se sob essa condição stress. por isso, foi escolhida como a folha de interesse. o comprimento da folha final (LL) das plantas sob estresse foi de 40% menor do que o das plantas bem irrigadas, o que era devido a uma LER inferior (Tabela 3). para entender a base celular da learesposta de crescimento f, foi realizada uma análise cinemática. Em geral, a taxa de alongamento de folhas é uma função da produção de células no meristema e tamanho da célula madura determinada na zona de alongamento (Figura 3). Por conseguinte, o encurtamento da folha deve ser devido a efeitos sobre um ou ambos estes parâmetros. Os nossos resultados mostram que, enquanto o comprimento da célula madura (l mat) não foi afectado, a taxa de produção de células (P) foi reduzida em 71% (Tabela 3). L esteira depende do comprimento das células que saem do meristema (l div) , o tempo, estas células passam na zona de alongamento (t el), e a taxa de expansão celular relativa (R el). Não foi observado efeito de l div, enquanto R el foi reduzida em 67% nas condições de seca. Este efeito foi compensado pela quase triplicação do T el, o que resultou no mesmo l mat </ Sub> como nas condições de controle. A diminuição da taxa de produção de células foi, por sua vez, provocada tanto por uma taxa inferior de célula médio divisão (D) e um número menor de células no meristema (mer N). Duração do meristema (L mer) foi reduzida em contraste com o comprimento da zona de crescimento (G GZ), que não foi significativamente afectada. Em conclusão, estes resultados mostram que, neste caso, o número de células, o tamanho da célula ao contrário, tinha um papel importante na determinação do tamanho da folha.

parâmetros cinemáticos C D % CD mudança p-valor
LL 727 ± 15 436 ± 23 -40 0.000
LER (mm / h) 2,8 ± 0,1 0,8 ± 0,0 -73 0.000
l mat (mm) 140 ± 3 130 ± 6 -7 NS
P (células / h) 20 ± 1 6 ± 0 -71 0.000
D (células · · célula -1 -1 h) 0,028 ± 0,003 0,010 ± 0,001 -63 0.000
T c (hr) 26 ± 3 71 ± 7 173 0.000
Div T (h) 249 ± 27 656 ± 71 164 0.000
L mer (mm) 15 ± 1 11 ± 1 -25 0,010
N mer 740 ± 31 590 + 20 -20 0.000
R el (uM · uM -1 hr) 0,043 ± 0,002 0,014 ± 0,001 -67 0.000
div L (mm) 24 ± 2 23 ± 2 -4 NS
T el (hr) 42 ± 2 125 ± 11 199 0.000
N el 844 ± 54 735 ± 65 -13 NS
L g z (mm) 68 ± 1 61 ± 5 -11 NS
N g z 1584 ± 33 1326 ± 66 -16 0,010

Tabela 3. A análise cinemática sobre a divisão celular e expansão celular durante o crescimento em estado estacionário da quinta folha de. plantas bem irrigados e plantas submetidas a tensão seca Os dados são médias ± EP (n = 5, para LL: n = 10). teste t de Student foi utilizado como uma análise estatística. Parâmetros: comprimento foliar (LL), taxa de alongamento foliar (LER), comprimento célula madura (l mat), a taxa de produção de células (P), a taxa de divisão celular (D), a duração do ciclo celular (T c), tempo na zona de divisão ( T div), comprimento do meristema (L mer), número de células do meristema (mer N), a taxa de alongamento relativo de células (R el), o comprimento das células que saem do meristema (l div), tempo na zona de alongamento (T el), o número de células na zona de alongamento (N el), o comprimento da zona de crescimento (G GZ), número de células na zona de crescimento (N GZ), condições bem irrigados (C), o stress de seca ( D), uma d não significativo (NS).

Figura 3
Figura 3:. Relação entre os parâmetros cinemáticos O comprimento final da folha (LL) depende da taxa de alongamento de folhas (LER), que por sua vez depende da produção de células (P) e o comprimento da célula madura (l MAT). O número de células do meristema (mer N) e a taxa de divisão celular (D) em conjunto determinar P, com uma duração do ciclo celular (t c) como o inverso da D. Tempo na zona de alongamento (t el), o comprimento de células que saem do meristema (l div), e a taxa de expansão celular relativa (R el) determinar o comprimento da célula madura (l MAT). O número de células na zona de alongamento (N el)..jove.com / files / ftp_upload / 54887 / 54887fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Além de sua aplicação como uma análise detalhada do crescimento de órgãos, análise cinemática fornece um mapa do crescimento da folha de localização zona e permite a amostragem com uma resolução subzonal para molecular e análises bioquímicas 4,10,11. Como um exemplo, a Figura 4A mostra a quantificação de malondialdeído (MDA) ao longo da zona de crescimento da folha do milho em plantas submetidas às mesmas condições como acima. MDA é um metabólito secundário formado durante a peroxidação lipídica por ROS e reflete os níveis de dano oxidativo 12. MDA foi medido em cada centímetro da folha, a partir da sua base, o que permitiu a análise de alterações de concentração ao longo do gradiente de crescimento 11. Como o tratamento seca causou 40% de encurtamento da folha, o comprimento das zonas de desenvolvimento (mericaule, zona de alongamento e zona madura) nas plantas de controlo não corresponde ao comprimento das mesmas zonas na seca estressados plantas (Figura 4B). Como pode ser visto na Figura 4B, o meristema nas plantas de controlo foi de cerca de 1,5 cm de comprimento, e na zona de alongamento calibrado de 1,5 a 6,8 cm da base da folha. Nas plantas estressadas, o meristema foi localizada de 0 a 1,1 cm, e a zona de alongamento de 1,1 a 6,1 cm. Os níveis de MDA e de toda a zona de crescimento foram aumentados em plantas sob estresse em relação ao tratamento controle. Com a ajuda da análise cinemática, podemos concluir que o conteúdo MDA foi particularmente aumentada na zona madura para ambos os tratamentos de controlo e de seca. Sem saber o tamanho das zonas de desenvolvimento, podemos concluir que, sob estresse hídrico, os conteúdos do MDA aumentos em um estágio anterior de desenvolvimento do que nas plantas de controlo, o que seria errado, pois não leva em consideração o deslocamento das zonas devido a tele encurtamento folha. Portanto, realizando análise cinemática antes das medições bioquímicas era de importância crucial, a fim de interpretar os dados corretamente.

Figura 4
Figura 4: Exemplo de medidas bioquímicas de alta resolução e amostragem para análise focada malonalde�o concentrações (A) (MDA) medidos ao longo da zona de crescimento da folha de milho (dividida em dez segmentos) de plantas cultivadas condição na bem regada e plantas submetidas à seca. tratamento 10. Os dados são médias ± EP (n = 5). ANOVA two-way foi usada como uma análise estatística, e os valores de p são apresentados a seguir ao painel de gráfico (factores: seca (d) e do segmento (s)); FW: peso fresco. (B) Visualização das diferentes zonas de crescimento no controle e plantas sob estresse. Divisão zona (D), zona de alongamento (E) ezona madura (M). As células são ampliada 125 vezes. (C) perfil celular de comprimento de controle e plantas tratadas pela seca. Os dados são médias ± EP (n = 5). (D) As diferenças na amostragem focado em ambas as plantas tratadas pela seca controle e. As caixas azuis indicam a posição de amostragem para comparar o mesmo estágio de desenvolvimento em ambos os tratamentos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para além de proporcionar a possibilidade de comparar as mesmas zonas de desenvolvimento em estudos de alta resolução, a análise cinemática também poderia ser utilizada como uma base para análises mais focadas, em que só são tomadas amostras de zonas específicas que contêm células no mesmo estágio de desenvolvimento. Foram comparados os perfis de comprimento celular, fornecidos pela suavização das medidas de comprimento de células microscópicas, nos primeiros dez centimeters da base da folha de controle e plantas sob estresse. Figura 4C mostra que, usando o perfil de comprimento celular, poderíamos determinar o comprimento das zonas de desenvolvimento e também pode acompanhar a dinâmica das taxas de crescimento, tanto em plantas sob estresse e controle de. Isto permitiu que a amostragem específico de células em proliferação no meristema (antes do aumento acentuado), células de expansão na zona de alongamento (no meio do aumento acentuado) e células maduras jovens na zona madura (o início do planalto). Os nossos resultados mostram que, devido ao encurtamento da folha, em resposta à seca, estas zonas não correspondem, no controlo e nas plantas estressadas. A fim de provar a proliferar, expandindo e células maduras jovens em plantas de controlo, precisávamos primeiro, quinto e nono centímetro da base da folha, respectivamente. No entanto, nas plantas estressadas, estes segmentos, que correspondem ao primeiro, quarto e oitavo centímetros, respectivamente. Este tipo de mais focadoamostragem provou ser útil no caso de estudos mais trabalhosas, dispendiosas ou demoradas, tais como RNA-sequenciação, proteômica, metabolômica, etc.

Documento Suplementar. 1: R-script para o procedimento de alisamento polinomial favor clique direito para baixar esse arquivo.

Documento Suplementar. 2: Cálculos de parâmetros cinemáticos favor clique direito para baixar esse arquivo.

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Discussion

Uma análise cinemática em folhas de milho integral permite a determinação da base celular de crescimento da folha e permite a concepção de estratégias de amostragem eficientes. Embora o protocolo é relativamente simples, alguma cautela é recomendado nas seguintes passos críticos: (1) É importante destacar as, folhas mais jovens fechados (passo 2.3), sem danificar o meristema, uma vez que a determinação comprimento meristema (passo 3) requer a completa meristema de estar presente. Alguma prática de antemão pode ser necessário. (2) Determinação do comprimento meristemático baseia-se na interpretação de figuras mitóticas. Portanto, aconselhamos que, dentro de um experimento, a mesma pessoa realiza essas medidas para reduzir a variância devido ao executor. (3) Mesmo que apenas 10 centímetros é usado para as medições do comprimento real da célula, é importante incluir onze centímetros quando da retirada do segmento de medida de comprimento da célula (passo 2.5), porque a extremidade do segmento não fazt sempre submergir inteiramente em etanol e / ou ácido láctico. Portanto, este centímetros adicional garante compensação dos primeiros dez centímetros da zona de crescimento. (4) No final, é útil para inspecionar o resultado de todos os parâmetros cinemáticos para confirmar se eles estão corretos. Na Tabela 3, por exemplo, a taxa de produção de células (P) das plantas sob estresse foi diminuída em 71%, ou, em outras palavras, é seca P 0,29 de controlo P. Uma vez que a produção de células depende da taxa de divisão celular média (D; -63%) e o número de células no meristema (N mer; -20%; Figura 3), o que se segue pode ser utilizado para validar a saída: P (0,29) ≈ N mer (0,8) x D (0,37). O mesmo pode ser aplicado para mat LER = P x I.

Dependendo das instalações disponíveis, o protocolo pode ser modificado em alguns passos. (1) Um mais umdvanced alternativa para as medições de comprimento da folha manuais diárias (passo 1.3) baseia-se na velocidade de deslocamento de transdutores lineares (LVDT) 13. A sua vantagem é que ele permite medições com uma resolução de tempo muito maior, variando de minutos a segundos. (2) É crucial para incluir a zona de crescimento completo durante a amostragem. No entanto, as condições ambientais, genótipo, espécies, e o estágio de desenvolvimento examinado pode alterar o comprimento da zona de crescimento. Por isso, é útil para fazer uma primeira estimativa do comprimento da zona de crescimento em resposta ao seu tratamento experimento. Este protocolo baseia-se na linha pura B73 cultivadas a 25 ° C / 18 ° C (dia / noite) a 300-400 μEm -2 s -1 (fotossintético Activo Radiação - PAR). (3) A fim de visualizar as figuras mitóticas (passo 3.8) sem a utilização de fluorescência, uma mancha Fuelgen pode ser aplicado 14. (4) O alisamento dos dados pode também ser feito em Microsoft Excel, em vez de R usando uma qua cinco pontosdratic encaixe com a função "PROJ.LIN" 15.

Uma limitação importante desta técnica é que toda a zona de crescimento tem de ser colhidas durante o crescimento de estado estacionário. A fim de garantir um crescimento em estado estacionário, as plantas devem, idealmente, ser cultivadas sob condições controladas de crescimento, porque as flutuações na intensidade da luz, temperatura ou umidade afetam a taxa de alongamento foliar 16. Por esta razão, a análise cinemática é menos adequado para as plantas cultivadas em condições de campo. Outra desvantagem é que as folhas devem ser emergido, o que faz com que seja impossível para examinar as folhas que ainda estão fechados por folhas mais velhas. Finalmente, o protocolo é adequado para espécies monocotiledóneas com zonas de crescimento grandes que abrangem, pelo menos, alguns centímetros. Uma análise cinemática em monocotiledóneas menores (por exemplo, Poa, arroz), no entanto, é viável, mas precisa de algumas modificações na preparação da amostra 17,18.

Outro usa com freqüênciad abordagem para analisar fenótipos de crescimento diferenciais é a análise de crescimento clássica. Esta análise quantifica taxas de crescimento relativo planta inteira e determina a alocação subjacente de fotossintética de carbono derivado em uma nova área fotossintética e em outras partes da planta 19. A análise cinemática, no entanto, permite uma compreensão mais detalhada dos processos celulares subjacentes que são acoplados a fenótipos de crescimento com base na quantificação de divisão celular e de expansão. Além disso, a possibilidade de determinar o comprimento de cada zona de crescimento permite a correlação das medições moleculares ao longo do eixo da folha para o estágio de desenvolvimento específico que é afectado pelo tratamento em estudo. Isto é crítico para a interpretação dos dados. Quando limitada no tempo ou orçamento ou quando interessado em fases específicas do desenvolvimento, o resultado desta análise permite a amostragem definidos, reduzindo o número de amostras necessárias para análise. Em conclusão, a análise cinemática permitiré a determinação de parâmetros celulares subjacentes respostas ao estresse e variação genética em crescimento da folha e pode ligá-los para montante processos regulatórios (Tabela 2).

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da Universidade de Antuérpia para VA; uma bolsa de doutoramento do Flamengo Science Foundation (FWO, 11ZI916N) para KS; subvenções de projectos do FWO (G0D0514N); uma bolsa de investigação actividades de investigação concertada (GOA), "A Biologia de Sistemas Abordagem de Folha Morfogênese" do conselho da Universidade de Antuérpia pesquisa; eo Interuniversitário de atração poloneses (IUAP VII / 29, MARS), "Milho e Arabidopsis raízes e parte aérea" do Escritório Belga Federal de Ciência Política (BELSPO) para GTSB Han Asard, Bulelani L. Sizani e Hamada AbdElgawad contribuíram para o vídeo .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pots Any Any We use pots with the following measures, but can be different depending on the treatment/study: bottom diameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.
Planting substrate Any Any We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.
Ruler Any Any An extension ruler that covers at least 1.5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.
Seeds Any NA Seeds can be ordered from a breeder.
Scalpel Any Any The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. 
15 mL falcon tubes Any Any The 15 mL falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.
Eppendorf tubes Any Any The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.
Gloves Any Any Latex gloves, which protect against corrosive reagents.
Acetic acid Any Any CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3
Absolute ethanol Any Any CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion
Lactic acid >98% Any Any CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1
Sodium chloride (NaCl) Any Any
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Any Any CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity – Single exposure, category 3
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl) Any Any This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Any Any Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.
Ice Any NA The DAPI solution has to be kept on ice.
Fluorescent microscope AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.
Microscopic slide Any Any
Cover glass Any Any
Tweezers Any Any Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. 
Image-analysis software Axiovision (Release 4.8) from Zeiss NA The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.
Microscope equipped with DIC AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.
R statistical analysis software R Foundation for Statistical Computing NA Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/
R script NA NA We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.  Kernel Smoothing: Chapman & Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquiry with the corresponding author.

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Análise cinemática da Divisão Celular e Expansão: Quantificar a base celular de crescimento e de amostragem de desenvolvimento zonas em<em&gt; Zea mays</em&gt; Folhas
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