عن طريق القنوات الخطي الاغاروز لدراسة<em> ذبابة الفاكهة</em> اليرقات الزحف السلوك
Summary
يرقة ذبابة الفاكهة هو نظام نموذج قوي لدراسة التحكم العصبي في السلوك. يصف هذا المنشور استخدام القنوات الاغاروز خطية للحصول نوبات متواصلة من الزحف والأساليب الخطية لقياس ديناميكية هياكل اليرقات خلال سلوك الزحف المتكرر.
Abstract
ذبابة الفاكهة الزحف اليرقات يبرز بوصفه نموذجا قويا لدراسة التحكم العصبي في السلوك الحسي. ومع ذلك، سلوك الزحف اليرقات على أسطح مستوية معقدة، بما في ذلك: التوقف، وتحول، والتعرجات. هذا التعقيد في جعبته من حركة يعوق تحليل مفصل للأحداث التي تحدث خلال دورة الزحف خطوة واحدة. للتغلب على هذه العقبة، أدلى قنوات الأغاروس الخطية التي تقيد سلوك اليرقات على التوالي، مستمرة، الزحف الإيقاعي. من حيث المبدأ، لأن قنوات الأغاروس والجسم اليرقات ذبابة الفاكهة على حد سواء واضحة بصريا، يمكن رصد حركة هياكل اليرقات وصفت من قبل تحقيقات الفلورسنت المشفرة وراثيا في حالها، التي تتحرك بحرية اليرقات. في الماضي، وضعت اليرقات في القنوات الخطية والزحف على مستوى الحي كله، الجزء، وتم تحليل العضلات 1. في المستقبل، اليرقات الزحف في قنوات يمكن أن تستخدم في التصوير الكالسيوم لمراقبة العصبيةالنشاط نال. وعلاوة على ذلك، وهذه الأساليب يمكن استخدامها مع يرقات أي الوراثي ومع أي قناة مصممة الباحث. وهكذا بروتوكول الواردة أدناه لا ينطبق على نطاق واسع للدراسات باستخدام يرقة ذبابة الفاكهة نموذجا لفهم التحكم في المحركات.
Introduction
ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو دراسة ذبابة الفاكهة الزحف اليرقات في التفاصيل. وقد لعبت التجارب على الحركة دورا هاما في تطوير واختبار النظريات حول التحكم في المحركات 2. تقليديا وقد تمت دراسة الحركة في الحيوانات المائية (على سبيل المثال، علقة، امبرى، الشرغوف) 3. وقد سمح للطبيعة المتكررة للتنقل في هذه الحيوانات لدراسة rhythmogenesis، لتحليل الأحداث الفيزيائية الحيوية تحرك القيادة، ورصد أنماط اطلاق العصبية التي ترافق الحركة.
استخدام يرقات ذبابة الفاكهة لدراسات الحركة يقدم مزيجا فريدا من المزايا أكثر من النظم نموذج الأخرى: علم الوراثة السطحية والتنمية تتميز جيدا، والهيئة التي هي واضحة بصريا في الأطوار الأولى والثانية، والمستمر انتقال الإلكترون إعادة الإعمار المجهري كامل الجهاز العصبي 4-6. ومع ذلك، ذبابة الفاكهة اليرقات مقامالحركة على أسطح مستوية معقدة إلى حد ما بما في ذلك توقف، تتحول، والتعرجات يزحف 7. يقدم هذا الكتاب وسيلة لاستخدام قنوات الاغاروز الخطية لتوجيه ذبابة الفاكهة السلوك الحركي اليرقات مثل أن اليرقات يقمن مستمرة، على التوالي، والسلوك الزحف الإيقاعي.
دراسة ذبابة الفاكهة سلوك اليرقات في قنوات الأغاروس، بدلا من السلوك على أسطح مستوية، لديها العديد من المزايا. أولا، فإنه يسمح للباحثين لتحديد على وجه التحديد الزحف السلوك من العديد من الحركات التي هي جزء من الذخيرة السلوكية اليرقات. ثانيا، عن طريق ضبط عرض القناة مقابل حجم الجسم اليرقات، سرعة الزحف يمكن تعديلها. ثالثا، تسمح القنوات لليرقة ليتم عرضه من ظهري، بطني، أو الجانب الوحشي اعتمادا على كيفية تحميل يرقة وتوجها داخل القناة. هذا براعة في التوجه اليرقات يسمح لأي هيكل تهم تكون مرئية بشكل مستمر خلال الزحف. رابعا،قنوات قابلة للاستخدام مع مجموعة واسعة من المجاهر والأهداف. على سبيل المثال، وقنوات خطية يمكن استخدامها لمنخفضة الدقة التصوير على المجسامات مشرق الميدان و / أو عالية الدقة التصوير على القرص الغزل المجاهر مبائر 1. خامسا، هذه الطريقة يمكن استخدامها في تركيبة مع / التلاعب العصبية توليد الحرارة علم البصريات الوراثي في أي خلفية وراثية. وأخيرا، لأن كلا من الجسم اليرقات (في الطور الأول والثاني) وقنوات الأغاروس واضحة بصريا، وقنوات يمكن استخدامها عند دراسة الحركات الديناميكية، أو التغيرات في كثافة الفلورسنت هياكل اليرقات وصفت من قبل تحقيقات الفلورسنت المشفرة وراثيا.
وصف الأسلوب المناسب للدراسات حركية مفصلة من الأول والثاني الطور ذبابة الفاكهة سلوك اليرقات. هذا المنشور يحلل التغيرات الديناميكية في كثافة الفلورسنت من الجهاز العصبي المركزي خلال الزحف اليرقات إلى الأمام للتدليل على استخدام القنوات وتمهيدا لنويالتصوير الكالسيوم رونالد.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم بناء جهاز ميكروفلويديك لجعل قنوات الاغاروز الخطية التي يمكن أن تستوعب يرقات ذبابة الفاكهة (الشكل 1). عندما توضع يرقات ذبابة الفاكهة في هذه القنوات الأغاروس الخطية ذخيرتهم السلوكي يقتصر على الزحف، والذي يسمح للمراقبة تفصيلية لديناميات هياكل الي…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.
Materials
| 6 oz square Drosophila bottle | Scimart | DR-103 | |
| agar | sigma | A1296 | |
| sucrose | sigma | S9378 | |
| apple juice | not from concentrate | ||
| Tegosept | Fisher | T2300 | methyl-p-hydroxybenzoate |
| 35 x 10 mm round petri dish | Fisher | 351008 | |
| baker's yeast | |||
| PDMS casting mold | FlowJem | can be requested from authors | |
| isopropyl alcohol | Fisher | A417-1 | |
| laboratory wipes | Fisher | 06-666-11 | |
| canned air | Fisher | 18-431 | |
| 10 cm petri dish | BioPioneer | GS82-1473-001 | |
| agarose | Fisher | 50-444-176 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| forceps | FST | 11241-40 | |
| 22 x 40 cover glass, #1.5 | Fisher | 50-365-605 | |
| Fiji (version 1.51d) | NIH | fiji.sc | |
| Excel 2016 | Microsoft | www.microsoftstore.com | |
| MATLAB R2016 | Mathworks | www.mathworks.com |
Referências
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Marder, E., Calabrese, R. L. Principles of rhythmic motor pattern generation. Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).
- Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems. Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).
- Ohyama, T., et al. A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila. Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude. Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).
- Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae. Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).
- Graf, S. A., Sokolowski, M. B. Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation. J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Rebay, I., Rubin, G. M. Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway. Cell. 81 (6), 857-866 (1995).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Tufte, E. R. . The visual display of quantitative information. , (2004).
