Utilisation Agarose linéaire Canaux pour étudier<em> Drosophila</em> Larvaire Ramper Comportement
Summary
La larve de drosophile est un système modèle puissant pour étudier le contrôle neuronal du comportement. Cette publication décrit l'utilisation de canaux d'agarose linéaires pour obtenir des combats soutenus de rampants et méthodes linéaires pour quantifier la dynamique des structures larvaires pendant un comportement répétitif ramper.
Abstract
Drosophila crawling larvaire est en train de devenir un modèle puissant pour étudier le contrôle neuronal du comportement sensorimotrice. Cependant, le comportement de rampement larvaire sur des surfaces ouvertes à plat est complexe, y compris: une pause, se tournant et serpentant. Cette complexité dans le répertoire de mouvement empêche une analyse détaillée des événements qui se produisent pendant un cycle crawl enjambée unique. Pour surmonter cet obstacle, les canaux d'agarose linéaires ont été faites qui limitent le comportement des larves à droite, soutenue, crawling rythmique. En principe, parce que les canaux d' agarose et le corps des larves de drosophile sont tous deux optiquement clair, le mouvement des structures larvaires marquées par des sondes fluorescentes génétiquement encodés peut être contrôlée intacte, les larves librement en mouvement. Dans le passé, les larves ont été placées dans des canaux linéaires et rampants au niveau de l' organisme entier, un segment, et les muscles ont été analysés 1. Dans le futur, les larves rampant dans les canaux peut être utilisé pour l'imagerie du calcium pour surveiller la neurol'activité finale. De plus, ces méthodes peuvent être utilisées avec des larves d'un génotype et avec un canal de chercheur conçu. Ainsi , le protocole présenté ci – dessous est largement applicable pour les études utilisant la larve de drosophile comme modèle pour comprendre le contrôle moteur.
Introduction
L'objectif global de cette méthode est d'étudier la drosophile crawling larvaire en détail. Des expériences sur la locomotion ont joué un rôle important dans le développement et tester des théories sur le contrôle moteur 2. Traditionnellement locomotion a été étudiée chez les animaux aquatiques (par exemple, sangsue, lamproie, têtard) 3. La nature répétitive de la locomotion chez ces animaux a permis l'étude de rythmogenèse, pour l'analyse des événements biophysiques locomotion de conduite, et pour la surveillance des modes de tir de neurones qui accompagnent la locomotion.
L'utilisation de larves de drosophile pour les études de locomotion présente une combinaison unique d'avantages par rapport à d' autres systèmes modèles: génétique faciles, le développement bien caractérisé, un corps qui est optiquement clair au premier et deuxième stades, et un électron de transmission en cours de reconstruction microscopique de l'ensemble système nerveux 4-6. Cependant, la drosophile larvaire locomouvement sur des surfaces ouvertes à plat est un peu complexe , y compris les pauses, tourne, et sinueuse rampe 7. Cette publication présente une méthode pour utiliser des canaux d'agarose linéaires pour guider Drosophila comportement locomoteur des larves de telle sorte que les larves effectuer soutenue, le comportement de rampement droite, rythmique.
Étudier le comportement des larves de Drosophila dans les canaux d' agarose, au lieu de comportement sur des surfaces plates ouvertes, présente plusieurs avantages. Premièrement, elle permet aux chercheurs de choisir spécifiquement ramper le comportement des nombreux mouvements qui font partie du répertoire comportemental larvaire. D'autre part, en réglant la largeur du canal par rapport à la taille du corps de la larve, la vitesse peut être ajustée en rampant. En troisième lieu, les canaux permettent la larve d'être vu à partir dorsale, ventrale ou latéral en fonction de la chenille est chargé et orienté à l'intérieur du canal. Cette polyvalence d'orientation larvaire permet pour chaque structure d'intérêt pour être continuellement visible pendant l'exploration. Quatrième,les canaux sont aptes à être utilisé avec une grande variété de microscopes et d'objectifs. Par exemple, les chaînes linéaires peuvent être utilisés pour l' imagerie à basse résolution sur stéréoscopes champ clair et / ou pour imagerie à haute résolution sur le filage-disque microscopes confocaux 1. Cinquièmement, cette méthode peut être utilisée en combinaison avec des manipulations neuronales optogénétiques / thermogénique dans tout contexte génétique. Enfin, parce que le corps de la larve (au premier et deuxième stades) et les canaux d'agarose sont optiquement clair, les canaux peuvent être utilisés lors de l'étude des mouvements dynamiques, ou des changements dans l'intensité de fluorescence des structures larvaires marquées par des sondes fluorescentes génétiquement encodés.
La méthode décrite est appropriée pour des études cinématiques détaillées de première et de deuxième stade Drosophila comportement des larves. Cette publication analyse les changements dynamiques dans l'intensité de fluorescence du système nerveux central au cours des larves rampant vers l'avant pour démontrer l'utilisation de canaux et comme un précurseur de neuimagerie calcique ronal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un dispositif microfluidique a été construit pour faire des canaux d'agarose linéaires qui peuvent accueillir des larves de drosophile (Figure 1). Lorsque les larves de drosophile sont placés dans ces canaux d' agarose linéaires leur répertoire comportemental est limité à l' exploration, ce qui permet une observation détaillée de la dynamique des structures larvaires au cours du cycle d'exploration.
Un enregistrement réussi se pro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.
Materials
| 6 oz square Drosophila bottle | Scimart | DR-103 | |
| agar | sigma | A1296 | |
| sucrose | sigma | S9378 | |
| apple juice | not from concentrate | ||
| Tegosept | Fisher | T2300 | methyl-p-hydroxybenzoate |
| 35 x 10 mm round petri dish | Fisher | 351008 | |
| baker's yeast | |||
| PDMS casting mold | FlowJem | can be requested from authors | |
| isopropyl alcohol | Fisher | A417-1 | |
| laboratory wipes | Fisher | 06-666-11 | |
| canned air | Fisher | 18-431 | |
| 10 cm petri dish | BioPioneer | GS82-1473-001 | |
| agarose | Fisher | 50-444-176 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| forceps | FST | 11241-40 | |
| 22 x 40 cover glass, #1.5 | Fisher | 50-365-605 | |
| Fiji (version 1.51d) | NIH | fiji.sc | |
| Excel 2016 | Microsoft | www.microsoftstore.com | |
| MATLAB R2016 | Mathworks | www.mathworks.com |
Referências
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