Использование линейных агарозном каналов для изучения<em> Drosophila</em> Личиночная Ползучая Поведение
Summary
Личинка дрозофилы это мощная модель системы для изучения нейронной контроля поведения. В этой публикации описано использование линейных каналов агарозном индуцировать устойчивые приступами линейного сканирования и методов количественной оценки динамики личиночных структур при многократном ползущего поведения.
Abstract
Дрозофилы личиночной ползать развивается как мощная модель для изучения нейронной контроля поведения сенсомоторной. Тем не менее, личиночной поведение ползать на плоских открытых поверхностях является сложным, в том числе: остановка, поворот, и извилистые. Эта сложность в репертуар движения затрудняет детальный анализ событий, происходящих в течение одного цикла ползать шага. Чтобы преодолеть это препятствие, линейные агарозы каналы были сделаны, что ограничит личиночной поведение к прямой, устойчивой, ритмичной ползания. В принципе, так как агароза каналы и личиночной тела дрозофилы являются оптически прозрачными, движение личиночных структур , помеченных генетически кодируемых флуоресцентных зондов можно наблюдать в интактном, свободно движущихся личинок. В прошлом, личинки были помещены в линейных каналов и сканирование на уровне всего организма, сегмента, и мышцы были проанализированы 1. В дальнейшем личинки ползет в каналах могут быть использованы для визуализации кальция для мониторинга нейроNAL деятельность. Кроме того, эти методы могут быть использованы с личинками любого генотипа и с любым исследователем спроектированный канала. Таким образом, протокол представлен ниже широко применяется для исследований с использованием личинку дрозофилы в качестве модели , чтобы понять управление двигателем.
Introduction
Общая цель этого метода состоит в изучении дрозофилы личиночной ползать в деталях. Эксперименты по передвижению сыграли важную роль в разработке и тестировании теории управления двигателем на 2. Традиционно локомоция изучен у водных животных (например, пиявки, миноги, головастика) 3. Повторяющийся характер локомоции у этих животных позволило для изучения ритмогенеза, для анализа биофизических событий вождения передвижения, а также для мониторинга нейропаттерны стрельбы, которые сопровождают локомоции.
Использование личинок Drosophila для изучения локомоции представляет собой уникальное сочетание преимуществ по сравнению с другими модельных систем: легковесных генетики, хорошо охарактеризованного развития, тело , которое является оптически прозрачным в первом и втором возрастах, и продолжающийся электронной передачи микроскопическом реконструкции всего нервной системы 4-6. Тем не менее, дрозофилы личиночной локоДвижение на плоских открытых поверхностях является довольно сложным в том числе паузами, повороты и извилистые ползает 7. Данная публикация представляет собой метод использовать линейные каналы агарозном для руководства дрозофилы личиночной поведение двигательную таким образом, что личинки выполняют устойчивый, прямой, ритмичное поведение сканирования.
Изучение дрозофилы личиночной поведение в агарозном каналах, а не поведения на плоских открытых поверхностях, имеет несколько преимуществ. Во-первых, это позволяет исследователям специально выбрать ползет поведение из многих движений, которые являются частью личиночной поведенческого репертуара. Во-вторых, путем регулировки ширины канала по сравнению с личиночной размером тела, ползать скорость можно регулировать. В-третьих, каналы позволяют личинка следует рассматривать с дорсальной, вентральной или боковой стороне в зависимости от того, как будет загружен и ориентирован в пределах канала личинка. Такая универсальность в личиночной ориентации позволяет любую структуру, интерес постоянно быть видны во время сканирования. В-четвертых,каналы поддаются для использования с широким разнообразием микроскопов и задач. Например, линейные каналы могут быть использованы для низкого разрешения изображения на ярко-полевых стереоскопов и / или для изображений с высоким разрешением на прядильно-диск конфокальной микроскопов 1. В-пятых, этот метод может быть использован в комбинации с оптогенетика / thermogenetic нейрональных манипуляций в любой генетический фон. И, наконец, потому что и тело личинки (на первом и втором возрастах), а также агарозу каналы оптически прозрачны, каналы могут быть использованы при изучении динамических движений или изменения в интенсивности флуоресценции личиночных структур, помеченных генетически кодируемых флуоресцентных зондов.
Описанный метод подходит для детальных исследований кинематических первого и второго возрастной стадии дрозофилы личиночной поведения. В данной публикации анализируются динамические изменения в интенсивности флуоресценции ЦНС при лобовом личиночной ползать, чтобы продемонстрировать использование каналов и в качестве предшественника NeuRonal визуализации кальция.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микрожидком устройство было построено , чтобы сделать линейные агарозном каналы , которые могут вместить личинок дрозофилы (Рисунок 1). Когда личинки дрозофилы помещены в этих линейных агарозных каналов их поведенческая репертуар ограничен ползет, что позволяет для …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.
Materials
| 6 oz square Drosophila bottle | Scimart | DR-103 | |
| agar | sigma | A1296 | |
| sucrose | sigma | S9378 | |
| apple juice | not from concentrate | ||
| Tegosept | Fisher | T2300 | methyl-p-hydroxybenzoate |
| 35 x 10 mm round petri dish | Fisher | 351008 | |
| baker's yeast | |||
| PDMS casting mold | FlowJem | can be requested from authors | |
| isopropyl alcohol | Fisher | A417-1 | |
| laboratory wipes | Fisher | 06-666-11 | |
| canned air | Fisher | 18-431 | |
| 10 cm petri dish | BioPioneer | GS82-1473-001 | |
| agarose | Fisher | 50-444-176 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| forceps | FST | 11241-40 | |
| 22 x 40 cover glass, #1.5 | Fisher | 50-365-605 | |
| Fiji (version 1.51d) | NIH | fiji.sc | |
| Excel 2016 | Microsoft | www.microsoftstore.com | |
| MATLAB R2016 | Mathworks | www.mathworks.com |
Referências
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Marder, E., Calabrese, R. L. Principles of rhythmic motor pattern generation. Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).
- Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems. Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).
- Ohyama, T., et al. A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila. Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude. Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).
- Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae. Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).
- Graf, S. A., Sokolowski, M. B. Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation. J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Rebay, I., Rubin, G. M. Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway. Cell. 81 (6), 857-866 (1995).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Tufte, E. R. . The visual display of quantitative information. , (2004).
