用线性琼脂糖渠道研究<em>果蝇</em>幼虫爬行行为
Summary
果蝇幼虫是研究行为的神经控制功能强大的模型系统。该出版物描述了使用线性琼脂糖通道引发线性爬行和方法的持续发作期间重复爬行行为量化幼虫结构的动力学。
Abstract
的果蝇幼虫爬行正在成为一个强大的模型来研究感觉神经行为的控制。然而，在平开面幼虫爬行行为是复杂的，其中包括：暂停，车削和蜿蜒。这种复杂性在运动的剧目阻碍单个抓取步幅循环期间发生的事件的详细分析。为了克服这一障碍，线性琼脂糖渠道所做的限制幼虫的行为直，持续，有节奏地爬行。原则上，由于琼脂糖频道和果蝇幼虫体都是光学透明的，由遗传编码荧光探针标记的幼虫结构的运动可以在完整的，可自由移动的幼虫监测。在过去，幼虫放置在直线通道，并在整个生物体，段的水平爬行和肌肉进行分析1。在未来，幼虫在通道抓取可用于钙成像以监测神经最终活动。此外，这些方法可与任何基因型的幼虫，并与任何研究者设计的信道可以使用。因此，下面提出的协议是广泛适用于使用果蝇幼虫为模型，以了解电机控制的研究。
Introduction
这种方法的总体目标是详细研究果蝇幼虫爬行。在运动实验已经起到了开发和电机控制2测试理论具有重要作用。传统的运动进行了研究水生动物（ 如水蛭，七鳃鳗，蝌蚪）3。运动，在这些动物中的重复性质已经允许节律的研究中，生物物理事件驱动运动的分析，以及用于监测伴随运动神经放电模式。
对于运动的研究使用果蝇幼虫的呈现比其他模型系统的优点的独特组合：轻便遗传学，良好表征的发展，一个机构，是在第一和第二龄光学透明，并且整个的持续透射电镜重建神经系统4-6。然而， 的果蝇幼虫机车在平开运动的表面是有些复杂，包括暂停，打开和蜿蜒爬行7。本刊物使用线性琼脂糖渠道，引导的果蝇幼虫自发行为，幼虫进行持续的，直的，有节奏的爬行行为的方法。
研究果蝇幼虫行为在琼脂糖频道，而不是在平面开口面的行为，具有几个优点。首先，它可以让研究人员专门选择从众多运动是幼虫行为艺术的一部分爬行行为。第二，通过调节通道与幼虫体尺寸的宽度，爬行速度可以调整。三，渠道允许从背，腹，或侧面取决于幼虫如何加载和通道内面向查看的幼虫。这种多功能性幼虫方向允许任何利益结构要爬行过程中不断地可见。第四，信道是适合于与各种显微镜和目标的用途。例如，线性通道可用于在明场立体镜和/或用于旋转盘共焦显微镜1高分辨率成像低分辨率影像。第五，这种方法可以结合使用以任何遗传背景光遗传学/ thermogenetic神经元的操作。最后，因为无论是幼虫体（在第一和第二龄）和琼脂糖渠道光学透明，渠道可以学习动态运动，或由基因编码的荧光探针标记幼虫结构的荧光强度变化时使用。
所描述的方法适用于第一和第二龄果蝇幼虫行为详细运动学研究。该出版物分析向前爬行幼虫过程中CNS的荧光强度的动态变化来演示使用渠道，并为先导，以NEURonal公司钙成像。
Protocol
Representative Results
Discussion
一种微流体装置建成，使线性琼脂糖渠道，可容纳果蝇幼虫（ 图1）。当果蝇幼虫被放置在这些线性琼脂糖渠道其行为库限于爬行，其允许在抓取周期幼虫结构的动力学的详细观察。
当幼虫进行一系列有节奏的步伐（ 图3）进行了一次成功的记录。如果这没有发生，检查喜欢在通道中的气泡障碍，并检查幼虫的身体健康。一个成功的记录…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.
Materials
| 6 oz square Drosophila bottle | Scimart | DR-103 | |
| agar | sigma | A1296 | |
| sucrose | sigma | S9378 | |
| apple juice | not from concentrate | ||
| Tegosept | Fisher | T2300 | methyl-p-hydroxybenzoate |
| 35 x 10 mm round petri dish | Fisher | 351008 | |
| baker's yeast | |||
| PDMS casting mold | FlowJem | can be requested from authors | |
| isopropyl alcohol | Fisher | A417-1 | |
| laboratory wipes | Fisher | 06-666-11 | |
| canned air | Fisher | 18-431 | |
| 10 cm petri dish | BioPioneer | GS82-1473-001 | |
| agarose | Fisher | 50-444-176 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| forceps | FST | 11241-40 | |
| 22 x 40 cover glass, #1.5 | Fisher | 50-365-605 | |
| Fiji (version 1.51d) | NIH | fiji.sc | |
| Excel 2016 | Microsoft | www.microsoftstore.com | |
| MATLAB R2016 | Mathworks | www.mathworks.com |
Referências
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Marder, E., Calabrese, R. L. Principles of rhythmic motor pattern generation. Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).
- Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems. Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).
- Ohyama, T., et al. A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila. Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude. Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).
- Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae. Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).
- Graf, S. A., Sokolowski, M. B. Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation. J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Rebay, I., Rubin, G. M. Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway. Cell. 81 (6), 857-866 (1995).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Tufte, E. R. . The visual display of quantitative information. , (2004).
