Linear Agarose Kanäle zu studieren<em> Drosophila</em> Larval Krabbeln Verhalten
Summary
Die Drosophila Larve ist ein leistungsfähiges Modellsystem neuronale Kontrolle des Verhaltens zu untersuchen. Diese Veröffentlichung beschreibt die Verwendung von linearen Agarose-Kanäle nachhaltig Anfälle von linearen Crawling und Methoden zu entlocken, die Dynamik der Larven Strukturen bei wiederholten kriechenden Verhalten zu quantifizieren.
Abstract
Drosophila Larven Crawling zeichnet sich als ein leistungsfähiges Modell neuronalen Kontrolle von sensomotorischen Verhalten zu studieren. Allerdings Larven Crawling Verhalten auf flachen offenen Flächen ist komplex, einschließlich: Pausieren, Drehen und mäandernden. Diese Komplexität im Repertoire der Bewegung behindert detaillierte Analyse der Ereignisse während eines einzelnen Crawl Schrittzyklus auftreten. Um dieses Hindernis zu überwinden, lineare Agarose-Kanäle wurden gemacht, das Larven Verhalten gerade, nachhaltig, rhythmische Crawling beschränken. Grundsätzlich weil Agarose – Kanäle und die Drosophila Larvenkörper sind beide optisch klare, die Bewegung der Larven Strukturen durch genetisch kodierten fluoreszierenden Sonden markiert kann in intakten, sich frei bewegenden Larven beobachtet werden. In der Vergangenheit wurden Larven in linearen Kanälen und kriechenden auf der Ebene des gesamten Organismus, Segment- und Muskel wurden 1 analysiert platziert. In Zukunft Larven in den Kanälen kriechen können für Kalzium-Imaging verwendet werden neuro zu überwachennal Aktivität. Darüber hinaus können diese Verfahren mit Larven von jedem Genotyp werden verwendet und mit jedem Forscher gestalteten Kanal. Damit das Protokoll unten dargestellt ist breit anwendbar für Studien , die die Drosophila Larve als Modell Motorsteuerung zu verstehen , verwenden.
Introduction
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist , Drosophila Larve Crawling im Detail zu studieren. Versuche zur Fortbewegung haben eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Erprobung von Theorien über die Motorsteuerung 2 gewonnen. Traditionell Fortbewegung wurde in Wassertiere (zB Blutegel, Neunauge, Kaulquappe) 3 untersucht. Die repetitive Charakter der Fortbewegung bei diesen Tieren wurde für die Analyse der biophysikalischen Ereignisse Lokomotion Fahren für die Untersuchung von Rhythmogenese, erlaubt, und für die neuronalen Feuerungsmuster Überwachung, die Fortbewegung begleiten.
Die Verwendung von Drosophila – Larven für Studien der Fortbewegung stellt eine einzigartige Kombination von Vorteilen gegenüber anderen Modellsystemen: facile Genetik, gut charakterisierte Entwicklung, einem Körper, der auf den ersten und zweiten instars optisch klar ist, und einer laufenden Übertragung elektronenmikroskopische Rekonstruktion des gesamten Nervensystem 4-6. Allerdings Drosophila Larve LokBewegung auf flachen offenen Flächen ist etwas komplex einschließlich Pausen, dreht sich, und mäandernden kriecht 7. Diese Veröffentlichung stellt eine Methode lineare Agarose – Kanäle zu verwenden Drosophila Larven Bewegungsverhalten , so dass Larven zu führen perform nachhaltig, gerade, rhythmische Crawling Verhalten.
Studium Drosophila Larven Verhalten in Agarose – Kanäle statt Verhalten auf flachen Oberflächen offen, hat mehrere Vorteile. Erstens ermöglicht es Forschern speziell auszuwählen Verhalten von den vielen Bewegungen kriechen, die Teil des Larven- Verhaltensrepertoire sind. Zweitens durch die Breite des Kanals gegenüber dem Larven- Körpergröße anpassen, können Kriechgang eingestellt werden. Drittens Kanäle ermöglichen die Larve aus dorsalen, ventralen oder lateralen Seite je nach betrachtet werden, wie die Larve geladen und innerhalb des Kanals ausgerichtet ist. Diese Vielseitigkeit in Larven Orientierung ermöglicht eine beliebige Struktur von Interesse während kriechen ständig sichtbar sein. Vierte,Kanäle sind für den Einsatz mit einer Vielzahl von Mikroskopen und Ziele zugänglich. Zum Beispiel können lineare Kanäle für niedrigaufgelöste Bildgebung auf Hellfeld Stereoskope und / oder für die hochauflösende Bildgebung auf Spinnscheiben – konfokale Mikroskope 1 verwendet werden. Fünftens kann dieses Verfahren mit optogenetische / thermogene neuronal Manipulationen in jedem genetischen Hintergrund in Kombination verwendet werden. Schließlich, da sowohl der Larvenkörper (in erster und zweiter instars) und Agarose-Kanäle optisch klar sind, können Kanäle verwendet werden, wenn die dynamischen Bewegungen oder Veränderungen in der Fluoreszenzintensität von Larven Strukturen von genetisch kodierten fluoreszierenden Sonden markiert studieren.
Das beschriebene Verfahren eignet sich für detaillierte kinematische Studien der ersten und zweiten Instar Drosophila Larven Verhalten. Diese Veröffentlichung analysiert die dynamischen Veränderungen in der Fluoreszenzintensität des ZNS bei Vorwärtslarven Crawling die Verwendung von Kanälen zu veranschaulichen und als Vorläufer neuronal Kalzium-Imaging.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es wurde eine Mikrofluidik – Vorrichtung , um lineare Agarose Kanäle gebaut , die Drosophila – Larven (Abbildung 1) aufnehmen kann. Bei Drosophila – Larven in dieser linearen Agarose – Kanäle , um ihre Verhaltensrepertoire platziert wird kriechen begrenzt, die für eine detaillierte Beobachtung der Dynamik der Larven Strukturen über den Crawl – Zyklus erlaubt.
Eine erfolgreiche Aufnahme tritt auf, wenn eine Larve eine Reihe von rhythmischen Schritten <st…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.
Materials
| 6 oz square Drosophila bottle | Scimart | DR-103 | |
| agar | sigma | A1296 | |
| sucrose | sigma | S9378 | |
| apple juice | not from concentrate | ||
| Tegosept | Fisher | T2300 | methyl-p-hydroxybenzoate |
| 35 x 10 mm round petri dish | Fisher | 351008 | |
| baker's yeast | |||
| PDMS casting mold | FlowJem | can be requested from authors | |
| isopropyl alcohol | Fisher | A417-1 | |
| laboratory wipes | Fisher | 06-666-11 | |
| canned air | Fisher | 18-431 | |
| 10 cm petri dish | BioPioneer | GS82-1473-001 | |
| agarose | Fisher | 50-444-176 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| forceps | FST | 11241-40 | |
| 22 x 40 cover glass, #1.5 | Fisher | 50-365-605 | |
| Fiji (version 1.51d) | NIH | fiji.sc | |
| Excel 2016 | Microsoft | www.microsoftstore.com | |
| MATLAB R2016 | Mathworks | www.mathworks.com |
Referências
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