Summary
Het produceren van gezonde laboratoriumopgevoerde tegels is essentieel voor het bestuderen van bosluisbiologie en kruis-pathogeen-interacties. Hier tonen wij een simpel protocol voor onvolgroeide tikvoeding die kosteneffectief en minder stressvol is voor muizen.
Abstract
Ixodes scapularis, de vector van de ziekte van Lyme, is een van de meest belangrijke ziekte vectoren in het oosten en het Middenwesten. Deze soort is een drie gastheer teek die een bloedmaaltijd van een gewervelde gastheer voor elke ontwikkelingsfase vereist, en de volwassen vrouwtjes vereisen een bloedmaaltijd voor de voortplanting. Larvale teken hechten aan hun gastheer voor 3-5 dagen voor de voeding en afzetten van de gastheer wanneer deze volledig volgezogen. Deze afhankelijkheid van verschillende hosts en de lange bevestiging tijd voor stuwing compliceert tick opvoeding in het laboratorium setting. Echter, om teek biologie te begrijpen en tick-pathogeen interacties, de productie van gezonde, laboratorium gekweekte teken is van essentieel belang. Hier tonen we een eenvoudige, kosteneffectieve protocol voor onrijpe teek voeden op muizen. We pasten de bestaande protocollen voor verminderde spanning op muizen en verhoogde teek voeden en het voortbestaan met wegwerp kooien zonder gaas bodems contact van teken wi voorkomenHet water besmet met muizen urine en ontlasting.
Introduction
Teken zijn obligate hematophagous ectoparasieten van gewervelde dieren en worden wereldwijd gedistribueerd. In de Verenigde Staten, minstens 11 soorten teken zijn vectoren van ziekteverwekkers van belang voor de volksgezondheid 1. Ixodes scapularis is verantwoordelijk voor de overdracht van verschillende pathogenen zoals de oorzakelijke agentia van de ziekte van Lyme (Borrelia burgdorferi) relapsing fever (B. miyamotoi), humaan granulocytic anaplasmose (Anaplasma phagocytophilum) en babesiose (Babesia spp.). Ondanks het belang van I. scapularis als een ziekte vector, het verzamelen van deze spinachtigen in overvloed in het wild voor studies in het lab is niet altijd haalbaar. Daarom is de productie van gezonde laboratorium gekweekte teken is van essentieel belang om studies op de pof biologie en vink-pathogeen interacties.
De levenscyclus van alle harde teken (familie Ixodidae), met inbegrip van I. scapularis, bestaat uit het ei en drie activE stadia: larven, nimf en volwassenen. Elke actieve fase voedt op een gewervelde gastheer. De complexe interacties die plaatsvinden tussen ticks en hun gastheren gedurende meerdere dagen van aanhechting en voeding, zijn bijna onmogelijk om te repliceren met behulp van kunstmatige voedingsmiddelen, en het zal onwaarschijnlijk genoeg getallen geven voor massaopvang 2 , 3 , 4 . Daarom worden levende muizen en konijnen meestal gebruikt als gastheren voor het volwassenen (larven en nimfen), en volwassen volwassenen van ticks, respectievelijk. Het vereiste van meerdere gastheren voor bloedvoeding tijdens elke ontwikkelingsfase compliceert tikopvang, en is tijd- en kostenintensief 5 , 6 , 7 . De meeste tikopvangprotocollen vereisen het behoud van muizen in een ophanglaag 7 , 8 of in een cilindrische cage zodanige afmetingen dat de dieren niet vrij kunnen bewegen en zich verzorgen 6, 9, 10.
Deze cilindrische kooien later overgebracht naar een schoenendoos kooi met een draadrooster. Gezwollen, vrijstaande teken worden daarna verzameld uit het water eronder. Deze werkwijze resulteert in blootstellen gevoede teken om verontreinigd met urine en feces die schimmelgroei kan verhogen en teken sterfte 9. Bovendien vergroot de mogelijkheid van teken ontsnappen uit de waterbak, maar waardoor stress muizen. Om deze problemen te omzeilen, we hier laten zien larven teek voeden met muizen binnen plastic schoenendoos wegwerpluier kooien. Deze werkwijze maakt het normale gedrag van muizen, toe volgezogen teek herstel en vermindert tick sterfte door vervuiling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol (Number-00682) hieronder geschetst wordt goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Nevada Reno en volgt de richtlijnen van de Universiteit van Nevada, Reno's dierproeven ethische commissie. In het kort werden muizen verdoofd met isofluraan en een neuskegel werd gebruikt voor het handhaven continue isofluraan niveaus gedurende 20 min. Een dierenarts zalf werd gebruikt om uitdroging van de ogen onder narcose voorkomen. Toe pinch werd gebruikt om de verdoving niveau vast te stellen en de ademhaling werd gemeten gedurende de gehele procedure. De muizen werden in individuele kooien gehouden en gecontroleerd tot bewustzijn was herwonnen. De muizen werden slechts eenmaal gebruikt voor teek voeden en werden gedood na de teek herstel. Euthanasie werd uitgevoerd door het Laboratorium voor Diergeneeskunde van personeel personeel. CO 2 en cervicale dislocatie werden toegepast voor euthanasie dieren.
OPMERKING: Werken aan teken vereist het gebruik van een volledige persoonlijke beschermingsmiddelen equipment. Voor het tellen van onvolwassen ticks, draag witte labcoatjes, lange nitrilhandschoenen om de mouwopening van de labcoat te bedekken, afgedekt met rubberen banden, en gesloten-toe schoenen. Voor het mishandelen van muizen met bosjes, gebruik een haarnetje, wegwerpdeksels, lange mouwen handschoenen over de mouwen en voetdeksels. Gebruik witte of lichtgekleurde hoesjes om vrolijke tekenjes te detecteren. Controleer regelmatig handschoenen en mouwen voor teken.
1. Voorbereiding van ruimte voor dierenhuisvesting
- Geef een aparte kamer aan om muizen die met bosluizen zijn besmet te houden. Plaats een kleverige mat of dubbelzijdig tapijtbandje buiten en in de deur om onbedoelde vogelvlucht te voorkomen.
2. Tellen tellen voor muisinfestatie
- Zet dubbelzijdige tape rondom de bovenste randen van een 7 "x 5" x 14 "plastic container en vul het water ongeveer 2 cm.
- Plaats een andere kleine doos of Petri-schotel in het midden van de container en vul het met water tot 1 cm en maak een &# 34; graaf "rond deze container
- Bewaar de injectieflacon met larven of nimfen in de Petri-schotel.
- Gebruik een fijne verfborstel om larven of nimfen uit de injectieflacon te verwijderen en tellen onder de microscoop. Tel 50 larven of 25 nimfen in aparte scintillatieflessen. Bedek de flesjes onmiddellijk met nylon mesh of organdy doek scherm en sluit met rubberen banden.
3. Bevestiging van Muizen Met Onvolwassen Ticks
- Gebruik een witte of lichte werkbank en plak dubbelzijdige tape rond de omtrek van het werkgebied.
- Verdoof de muis met isofluraan. Controleer het niveau van de verdoving door de teenspanning. Zodra u verdoofd hebt, overdragen de muis naar een verwarmingsblok die bedekt is met papieren handdoeken en vastzetten aan een neuskegel voor verdere aanlevering van isofluraan.
- Breng olieoplossing op basis van oliën aan om droogheid te vermijden. Let op het ademhaling patroon van de muis om isofluran niveaus aan te passen (80 - 230 ademhalingen per minuut is normaal., Verminder het isofluraan niveau als breathing is minder dan 80 ademhalingen per minuut vermijden doden van het dier).
- Neem een flesje van 50 larven en nimfen en 25 plaats teken onder de vacht op de kop tussen de oren met een kwast (figuur 1). Houd de muis onder narcose gedurende 20 minuten na de plaatsing om genoeg tijd op teken te hechten geven.
- Beweeg de muis om een standaard plastic schoenendoos wegwerpluier muizenkooi met statische deksels wit beddengoed. Zorg voor speelgoed, water en voedsel ad libitum als per gewone muis zorg.
- Bewaar het muizenkooi binnen een grotere rat of gerbilverblijf gevoerd met dubbelzijdig plakband rond bovenranden. Vul het buitenkooi 3 cm water (figuur 2).
4. Verzamelen Teken van Muizen
- Onrijpe teken los tussen dagen 3 en 6 van het voeden. Controleer de kooien en water gracht voor gezwollen teken elke dag na dag 3.
- Verzamel vrijstaande teken uit de kooi tussen dag 4 en 6. Gebruik een pijnt kwast of zachte tang voor het opnemen gezwollen teken en bewaar in schone scintillatieflesjes afgedekt met nylon mesh doek bevestigd met elastiekjes.
- Verdoven en laat de muis op dag 7 voor alle resterende bijgevoegde teken.
- Controleer het beddengoed, voerbak en waterfles voor overvuld teken op dag 7 muizen Euthanaseren de procedure zoals hierboven beschreven. Autoclaaf de wegwerpbare kooien, beddengoed, waterfles en voedertrog geven ontsnapt niet gevoede teken voorkomen.
5. Opslag van Fed Ticks
- Handhaaf gezwollen teken bij 90% vochtigheid, 20 ° C en een 12:12 licht: donker cyclus in een vochtige en geïsoleerde incubator tot vervellen optreedt. Dit kan ongeveer 12 tot 18 weken duren voor te komen.
- Terwijl de hoge luchtvochtigheid bevordert tick overleving, het maakt ook de teken vatbaar voor schimmel overgroei. Controleer de fed teken onder de microscoop minstens een keer per week voor schimmels. Indien ontdekt, wassen overlevenden in 70% ethanol gedurende 5Min., Spoelen in water, overbrengen naar een filterpapier om te drogen en over te brengen naar nieuwe, schone flesjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wij hebben bestaande tikopvangprotocollen 6 , 10 aangepast voor verbeterde voedingsefficiëntie en verminderde stress op de muishost. Uit de resultaten blijkt dat de standaard schoebox-stijlkooien goed geschikt zijn voor het opslaan van tieten. Het witte beddengoed zorgde voor een goed contrast voor de gemakkelijke verzameling van gevulde ticks. De meeste bosluizen klommen op de muren van de containers na het voeden en waren gemakkelijk te verzamelen. Daarnaast voorkomt het strakke pasgemaakte deksel van de weggooibare kunststof dozen (routinematig gebruikt voor muizenbehuizing bij UNR) tik ontsnappen uit de doos. Daarnaast hebben we geen muizen gescheurd voor bosbesmetting ( Figuur 1 ). Deze wijzigingen in gepubliceerde protocollen resulteren in significante tick attachment, engorgement en overleving.
Dit protocol is kosteneffectief omdat er geen speciale muishokjes nodig zijn buiten diegene die algelezen zijny gebruikt. Het is ook minder arbeidsintensief omdat we niet te gezwollen teken verzamelen elke dag. We verzamelden teken tussen dag 4 en 6 na besmettingen. De meeste teken losgemaakt door dag 4 en een paar overgebleven die losgemaakt door dag 5. Op dag 7 alle muizen waren vrij van teken. We waren in staat om een gemiddelde van 67% (range 52-92%) terug te krijgen gezwollen larvale teken (tabel 1). Alle muizen waren gezond en hadden geen tekenen van ongemak vertonen.
Figuur 1: Voedende Ixodes scapularis larven op muizen. Muizen werden individueel besmet met 50 larvale tikken. De volgezogen teek afgezet met de muis tussen dag 4 - 6. De kooien werden gecontroleerd op eventuele resterende teken op dag 7 en daarna weggegooid. A: muizen geïnfecteerd met niet gevoede larvale teken. B: Een teek larvale bevestiging aan het oor van een muis. C: EenGegraveerde larval tik bevestigd aan het oor van een muis, 3 dagen na besmetting. D: Unfed en volledig ingewikkelde tik larven.
Figuur 2: Muiscage Opgericht voor Tick Infestation. Twee wegwerpmuiskooien werden in een gerikskooi gehouden. Ongeveer 3 cm. Water werd aan de gerbil kooi toegevoegd om een gracht te maken. Dubbelzijdig kleverig tapijtband werd aangebracht rond de bovenranden van de gerbilkooi om te voorkomen dat de vogel ontsnapt.
| Dier (muis) | Totaal aantal larven opgetekend | Percentage larven ticks hersteld |
| 1 | 34 | 68% |
| 2 | 32 | 64% |
| 3 | 38 | 76% |
| 4 | 28 | 56% |
| 5 | 39 | 78% |
| 6 | 26 | 52% |
| 7 | 46 | 92% |
| 8 | 29 | 58% |
| 9 | 29 | 58% |
| 10 | 33 | 66% |
| GEMIDDELDE | 66,8% |
Tabel 1: Aantal Engorged Ixodes Scapularis Larven Recovered na Laboratorium Bevestiging op verdovende Muis Hosts. Elke muis werd besmet met 50 larven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritieke stappen binnen het protocol
Het is belangrijk om meerdere niveaus van veiligheidsmaatregelen te hebben bij het opslaan van bosjes om ongevallen te voorkomen. Gebruik van kleefband en een watergracht zijn cruciaal om de veiligheid te waarborgen. Het is belangrijk om de verdoofde muis op een verwarmingsblok vast te houden om de lichaamstemperatuur constant te houden. We hebben ook geconstateerd dat het scheren van de muis geen extra voordelen biedt voor het bijvullen van een vinkje. Een individuele muis kan gedurende één week in dezelfde kooi in een aangewezen "tick room" worden gehouden, waardoor het contact van bosluizen met personeel verder beperkt wordt.
Wijzigingen en probleemoplossing
De productie van kwalitatief hoogwaardige, laboratorium-genereerde bosluizen is nodig voor studies over bosveldbiologie en kruis-pathogeen-interacties. Vorige voedingsprotocollen gebruikten hangende draadvloer 8 of cilindrische kooien om de muizen immobiel 6 , 1 te houden0 die extra kosten en stress op het dier veroorzaken. Bovendien laat de opgehangen draadkooi toe dat de gezaagde bosjes door de draad vallen in het water dat is besmet met urine en ontlasting van de muis, waardoor het risico op vormgroei wordt verhoogd.
Beperkingen van de techniek
Zoals blijkt uit de gegevens, hebben we met succes 65% (tot 92%) van de bosluizen gerealiseerd. We vonden soms bosjes in watergracht buiten de muiskooi, maar niemand ontsnapte. De kleefband op de buitenwanden van de tweede houder verhinderde dat de bosluizen ontvluchten.
Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / alternatieve methoden
Ons protocol voor het gebruik van schoenendoosjes met wegwerpmuizen maakt het vrije verkeer mogelijk en laat zien dat muizen niet moeten worden ingehaald om tik te voeden. De meeste gevulde ticks werden gemakkelijk gezien en verzameld uit de transparante koemuren en eventuele resterende ticks zijn gemakkelijkgedetecteerd onder beddengoed aan het einde van de toevoercyclus. Dit protocol niet aangepaste muizenkooi nodig, dus is kosteneffectief.
Literatuur suggereert dat minder dan 50% van teken hechten aan muis en niet alle aangesloten teken voeden voltooid. Op een gemiddelde, we verzameld ~ 60% gezwollen larvale teken. We vonden geen ontkomen unfed of fed teken. Af en toe hebben we een of twee gezwollen larvale teken in water gracht, maar geen enkele op het plakband. Onze resultaten suggereren dat niet alle teken hechten aan de gastheer en kunnen sterven zonder voeden. Unfed, dode teken waren moeilijk te vinden in het zwerfafval. Af en toe hebben we ook bloed vlekken op de witte beddengoed die suggereert dat ofwel de muis van de volgezogen teek na een val uit zijn gedood of gekrast uit. Onze gegevens en de dagelijkse observatie van de kooien suggereren dat gezwollen teken verplaatst u op de muren kooi en de bovenkant van de kooi of verbergen onder het beddengoed buiten het bereik van de muis. Daarom hebben de bijgevoegde kooi niet eenY negatieve invloed op de tik overleving.
Toekomstige Toepassingen of Aanwijzingen na het Bemeesteren van deze Techniek
Ons protocol biedt een vereenvoudigd alternatief voor massaproductie van bosluizen zonder extra kosten te dragen of de veiligheid van het personeel dat de dieren behandelt te verminderen. Toekomstige experimenten zullen zich richten op het verbeteren van methoden voor het voeden van volwassen I. scapularis .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puralube vet ointment | Amazon | Available from any Pet store or online store | |
| Disposable mouse cage | Innovive, San Diego, CA | MV 2 | Set of bottom and lid |
| White Alpha dri bedding | Lab Supply, Fort Worth, TX | ALPHA-Dri™ |
References
- Gleim, E. R., et al. Factors associated with tick bites and pathogen prevalence in ticks parasitizing humans in Georgia, USA. Parasites & Vectors. 9 (125), Available from: http://doi.org/10.1186/s13071-016-1408-6 1-13 (2016).
- Krober, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).
- Kuhnert, F. Feeding of Hard Ticks In Vitro: New Perspectives for Rearing and for the Identification of Systemic Acaricides. ALTEX. 13 (2), 76-87 (1996).
- Voigt, W. P., et al. In vitro feeding of instars of the ixodid tick Amblyomma variegaturn on skin membranes and its application to the transmission of Theileria mutans and Cowdria ruminantium. Parasitol. 107, 257-263 (1993).
- Gregson, J. D. Ticks. Insect Colonization and Mass Production. Smith, C. N. , Academic Press. New York. 49-72 (1966).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. 2, Oxford University Press. New York. (1993).
- Bouchard, K. R., Wikel, S. K. Care, maintenance, and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. Biology of Disease Vectors. Marquaedt, W. C. , Elsevier. New York. 705-711 (2005).
- Schumaker, T. S., Barros, D. M. Life cycle of Ornithodoros (Alectorobius) talaje. (Acari:Argasidae) in laboratory. J Med Entomol. 32, 249-254 (1995).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi (Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 35, 177-179 (1998).
- James, A. M., Oliver, J. H. Jr Feeding and host preference of immature Ixodes dammini,I.scapularis,and I.pacificus.(Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 27, 324-330 (1990).
