Фракционирование мозговых мембран:<em> Ex Vivo</em> Подход к оценке локализации сусинаптических белков
Summary
Здесь мы представляем протокол фракционирования мозговых мембран, который представляет собой надежную процедуру для выделения белков, принадлежащих к различным синаптическим компартментам.
Abstract
Оценка состава и функции синаптического белка представляет собой важную проблему в неврологии. Однако оценить нейропередачу, которая происходит в синапсах, непросто, поскольку она сильно регулируется динамическими белок-белковыми взаимодействиями и событиями фосфорилирования. Соответственно, когда какой-либо метод используется для исследования синаптической передачи, основная цель заключается в сохранении этих переходных физиологических изменений. Здесь мы представляем протокол фракционирования мозговых мембран, который представляет собой надежную процедуру для выделения белков, принадлежащих к различным синаптическим компартментам. Другими словами, протокол описывает биохимическую методологию для осуществления обогащения белков из пресинаптических, постсинаптических и экстрасинаптических компартментов. Во-первых, синаптосомы или синаптические терминалы получают из нейронов, которые содержат все синаптические компартменты с помощью прерывистого градиента сахарозы. Следует отметить, что качество этого исходного препарата синаптической мембраны critical. Впоследствии выделение различных субсинаптических компартментов достигается при легкой солюбилизации с использованием слабых детергентов при дифференциальных условиях рН. Это позволяет разделять градиент и изопикнические центрифуги. Наконец, обогащение белка в различных субсинаптических компартментах ( т. Е. До-, пост- и экстрасинаптические фракции мембран) проверяется с помощью иммуноблот-анализа с использованием хорошо охарактеризованных синаптических маркеров белка ( т.е. SNAP-25, PSD-95 и синаптофизина, Соответственно), что дает возможность прямой оценки синаптического распределения любого конкретного нейронального белка.
Introduction
Синаптическая передача основывается на физической целостности синапса, концепции, которая была предусмотрена еще в 1897 году Фостером и Шеррингтоном 1 . Таким образом, понимание распределения ключевых компонентов нейротрансмиссии ( например, ионных каналов, рецепторов и т . Д.) Необходимо для выяснения синаптической функции как в нормальных, так и в патологических состояниях. Электронная микроскопия (ЭМ) внесла огромный вклад в современное ультраструктурное представление синапсов прототипической центральной нервной системы (ЦНС). Таким образом, ЭМ точно установила разницу между до- и постсинаптической плотностью, разделенными расщелиной на довольно равномерном расстоянии (~ 25 нм) 2 . Интересно, что постсинаптический аппарат имеет относительно непрерывное, электронно-плотное утолщение под его плазматической мембраной, так называемую постсинаптическую плотность, или PSD 2 . Напротив, в пресинаптическом аппарате заметнаE разрывная цитоматричная сеть расположена непосредственно под плазматической мембраной, которая необходима для выравнивания и стыковки синаптических везикул с активной зоной плазматической мембраны 3 . Следовательно, ЭМ представляет собой золотой экспериментальный подход к исследованию распределения белков в структурно сохраненных синапсах CNS. Однако информация, предоставленная электронными микрофотографиями, является статичной. Действительно, накапливающиеся свидетельства показывают, что синапсы in vivo чрезвычайно динамичны, и поэтому испытывают серьезные структурные изменения при длительной синаптической передаче. Кроме того, морфология и состав синапсов могут изменяться в разных областях ЦНС, а также при развитии, созревании, старении и развитии невропатологических состояний. В целом протокол, посвященный изоляции белков, принадлежащих к разным синаптическим компартментам в физиологических условиях, представляет собой ценный инструмент для более полного исследования синаптического функционирования.
<p class = "jove_content"> Здесь мы описываем этот тип дополнительного экспериментального подхода, который позволяет получить препаративное биохимическое обогащение различных отделений синаптических мембран, а именно, экстра-, пре- и постсинаптические мембранные домены. Этот способ мембранного фракционирования, впервые описанный Philips и др . (2001) 4 , основан на сдвиге рН, который ослабляет адгезивные взаимодействия, происходящие в пред- и постсинаптической аппаратуре. Во-первых, используя мягкие моющие средства при рН 6,0, можно обнаружить адгезионный переход, который удерживает пред- и постсинаптический аппарат, и который поддерживается из области экстрасинаптической мембраны, которая солюбилизирована и, таким образом, может быть извлечена из синаптических контактов. Впоследствии повышение рН от 6,0 до 8,0 в присутствии слабых детергентов ослабляет прочность адгезивного соединения, которое удерживает пресинаптически активную зону плотно связанной с постсинаптической плотностью. Следовательно, пресинаптическое отделение настолькоЛибилизируется и может быть отделена от постсинаптической плотности, которая в основном сохраняется, поскольку концентрация используемого детергента не способствует его солюбилизации 4 . Интересно, что эффективность фракционирования, в конечном итоге выше 90%, может быть подтверждена различными субсинаптическими маркерами: i ) синаптосомальный белок 25 (SNAP-25) из пресинаптической активной зоны; Ii) синаптофизин из экстрасинаптической фракции ( т.е. вне активной зоны и включая микросомы); И iii ) постсинаптический белок плотности 95 (PSD-95), из постсинаптической плотности. Примечательно, что этот метод фракционирования головного мозга успешно использовался. Соответственно, было возможно точно определить субсинаптическую локализацию различных рецепторов, таких как рецепторы альфа-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (АМРА) 5 , рецептор аденозина A 1 (A 1 R) 6 ,Аденозиновый рецептор А 2А (A 2 A R) 7 , рецепторы Р2 аденозинтрифосфата (АТФ) 8 , субъединицы 9 никотинового ацетилхолина и рецептор, ассоциированный с болезнью Паркинсона GPR37 10 . Однако ряд ограничений может помешать правильной оценке синаптического распределения конкретного нейронального белка. Таким образом, в этой процедуре мы не только полностью описываем весь протокол, но также выделяем некоторые критические моменты, которые необходимо учитывать, например, достаточно большое количество ткани, низкий выход белка и обязательное требование проверки эффективности Каждое разделение перед выполнением определенного эксперимента.Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Министерством экономики и конкурентоспособности / Институтом Салуда Карлоса III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 и PIE14 / 00034), Институтом Каталонии Рекурсии и Эстудис Avançats (ICREA Academia-2010 ), И Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie (SBO-140028) для FC. Кроме того, X. M, VF-D. И FC принадлежат к аккредитованной исследовательской группе «Нейрофармакология и боль» (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) , Работа была также поддержана «Программой Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras» от CAPES (Бразилия) до ФК
Materials
| Sucrose | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,211,211 | |
| CaCl2 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 2,112,211,210 | |
| MgCl2·6H2O | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,313,961,210 | |
| Protease inhibitor cocktail Set III | Millipore, Darmstadt, Germany | 535140 | |
| Trizma Base | Sigma, St. Louis, MO, USA | T1503 | |
| Tris-HCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,236,541,209 | |
| Triton X-100 | Sigma, St. Louis, MO, USA | X100 | |
| SDS | Sigma, St. Louis, MO, USA | L3771 | |
| Glycerol | Sigma, St. Louis, MO, USA | G5516 | |
| Bromophenol Blue | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,311,651,604 | |
| Dithiothreitol | Sigma, St. Louis, MO, USA | D0632 | |
| Tween 20 | Sigma, St. Louis, MO, USA | P2287 | |
| Non fat dry milk | |||
| NaCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,216,591,211 | |
| KCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,314,941,210 | |
| KH2PO4 | Merck | 4873 | |
| Na2HPO4 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,781,211 | |
| Basic 20 pH | Crison, Alella, Spain | ||
| Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer | VWR, Radnor, PA, USA. | ||
| Ultra-Clear Tubes (14x89mm) | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | 344059 | Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | UFC901008 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf, Hamburgo, Germany | ||
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | ||
| Sonifier 250 | Branson, Danbury, Connecticut | ||
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain | ||
| Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm | VWR, Radnor, PA, USA | 612-1702 | |
| Compact Balance EK-610 | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA | ||
| SuperSignal west pico chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | ||
| GR 200 Precision Balance | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Anti-GPR37 | Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory. | Primary antibodies used at a final concentration of 0.250ug/ml | |
| Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin | Abcam, Cambridge, United Kingdom | Primary antibodies diluted 1:10000 | |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:10000 | |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:30000 |
Referências
- Foster, M., Sherrington, C. S. Part III: The Central Nervous System. A Text Book of Physiology. , (1897).
- Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. . The fine structure of the nervous system. , (1991).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).
- Phillips, G. R., et al. The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution. Neuron. 32, 63-77 (2001).
- Pinheiro, P. S., et al. Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus. Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).
- Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus. Brain Res. 987, 49-58 (2003).
- Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat. Neurociência. 132, 893-903 (2005).
- Rodrigues, R. J. Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat. J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).
- Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum. Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).
- Lopes, J. P., et al. The role of parkinson’s disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system. J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR J. 38, 41-48 (1997).
- Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications. Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).
- Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).
- Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization. EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).
- Rezgaoui, M., et al. The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37. J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).
- Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. The Parkinson’s disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain. J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).
- Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).
- Takahashi, R., Imai, Y. Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson’s disease. J. Neurol. 250, 9 (2003).
