脳膜分画：<em> Ex Vivo</em> Subsynaptic Protein Localizationを評価するアプローチ
Summary
ここでは、異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離するための堅牢な手順を表す脳膜分画プロトコルを提示します。
Abstract
シナプスタンパク質の組成および機能を評価することは、神経科学において重要な課題である。しかし、シナプス内で起こる神経伝達を動的タンパク質 – タンパク質相互作用およびリン酸化事象によって高度に制御されるので評価することは容易ではない。したがって、シナプス伝達を研究するためにいずれかの方法が使用される場合、主要な目標は、これらの一時的な生理学的修飾を保存することである。ここでは、異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離するための堅牢な手順を表す脳膜分画プロトコルを提示します。換言すれば、プロトコールは、シナプス前、シナプス後およびシナプス外区画からタンパク質濃縮を行うための生化学的方法論を記載している。第1に、シナプトソームまたはシナプス末端は、不連続なスクロース勾配を用いてすべてのシナプスコンパートメントを含むニューロンから得られる。注目すべきは、この初期シナプス膜調製物の品質はc儀式的。続いて、異なるpH条件下で穏やかな界面活性剤を用いて軽度の可溶化を行うことにより、種々の副シナプスコンパートメントの単離が達成される。これにより、勾配遠心分離および等密度遠心分離による分離が可能になる。最後に、様々なシナプスタンパク質マーカー（ すなわち、 SNAP-25、PSD-95、およびシナプトフィジン）を用いたイムノブロット分析により、異なるシナプス後区画（ すなわち、シナプス前およびシナプス後の膜画分）任意の特定のニューロンタンパク質のシナプス分布の直接評価を可能にする。
Introduction
シナプス伝達はシナプスの物理的完全性に依存しており、これはフォスターとシェリントンによって1897年に早期に構想された概念である。したがって、重要な神経伝達成分（ 例えば、イオンチャネル、受容体など ）の分布を理解することは、正常状態および病理学的状態の両方におけるシナプス機能を解明するために不可欠である。電子顕微鏡（EM）は、プロトタイプの中枢神経系（CNS）シナプスの現在の超微細構造の概念に非常に貢献している。そのようなやり方で、EMは、プレ・シナプス密度とシナプス後密度との間の差異を細かく確立しており、これはかなり均一な距離（約25nm）の裂け目で分けられている。興味深いことに、シナプス後の装置は、その原形質膜の下に比較的連続した電子密度の高い肥厚、いわゆるシナプス後密度、すなわちPSD2を示す 。逆に、シナプス前の装置では、不連続細胞マトリックスネットワークは原形質膜のすぐ下に配置され、シナプス小胞の細胞膜活性ゾーン3への整列およびドッキングに必須である。したがって、EMは、構造的に保存されたCNSシナプス内のタンパク質の分布を調査するための黄金実験アプローチを構成する。しかしながら、電子顕微鏡写真によって提供される情報は静的である。事実、蓄積する証拠は、in vivoシナプスが非常に動的であることを示し、したがって、持続的なシナプス伝達に劇的な構造変化を経験する。さらに、シナプスの形態および組成は、様々なCNS領域の全体にわたって、ならびに発達、成熟、老化および神経病理学的状態の発生によって変化し得る。全体として、生理学的条件における異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離することに焦点を当てたプロトコルは、シナプス機能のより包括的な研究のための貴重なツールである。
<p cここでは、異なるシナプス膜コンパートメント、すなわち余剰、プレシナプスおよびプレシナプス膜ドメインの分取的な生化学的濃縮を可能にするこの種の相補的実験アプローチについて説明する。 Philips らによって最初に記載されたこの膜分画法は、 （2001） 4は、シナプス前およびシナプス後の装置内で生じる接着相互作用を弱めるpHシフトに基づいている。第1に、pH6.0の中性洗剤を用いることにより、シナプス前および後シナプスの装置を保持し、可溶化されてシナプス接触から抽出されるシナプス外膜ドメインから維持される付着接合を識別することが可能である。続いて、中性洗剤の存在下でpHを6.0から8.0に上げると接着結合の強度が弱まり、シナプス前活性領域がシナプス密度に強く結合した状態に保たれる。したがって、シナプス前区画は、潤滑され、シナプス密度から分離することができ、これは使用される界面活性剤の濃度がその可溶化を促進しないためにほとんど保存される4 。興味深いことに、最終的に90％より高い分画効率は、異なるシナプス後マーカーによって確認することができる： i ）シナプス前活性ゾーンからのシナプトソーム関連タンパク質25（SNAP-25）; ii ）シナプス間隙画分（ すなわち、活性領域の外側およびミクロソームを含む）からのシナプトフィジン。およびiii ）シナプス密度からのシナプス後密度タンパク質95（PSD-95）。特に、この脳膜分画法はうまく使用されています。したがって、α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸（AMPA）受容体5 、アデノシンA 1受容体（A 1 R） 6 （AMPA）受容体などの様々な受容体の副シナプスの局在を正確に決定することが可能であった。 、アデノシンA 2A受容体（A 2A R） 7 、アデノシン三リン酸（ATP）P2受容体8 、ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニット9 、およびパーキンソン病関連受容体GPR37 10 。しかしながら、多くの制限が、特定のニューロンタンパク質のシナプス分布の適切な評価を妨げる可能性がある。したがって、この手順では、プロトコール全体を完全に記述するだけでなく、必要とされる組織の量が多量であること、タンパク質の収量が低いこと、およびタンパク質の効率を検証するための必須要件など、明確な実験を行う前にそれぞれの分離。Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、サンパウロ・カルロス3世大臣（SAF2014-55700-P、PCIN-2013-019-C03-03およびPIE14 / 00034）、カタリナ・デ・レクレッサー・エスティス・アバナッツ（ICREA Academia-2010）また、X. M、VF-D。、およびFCは、「神経薬理学および疼痛」認定研究グループ（Catalunya Generaletat de Catalunya、2014 SGR 1251）に属しています。 。この作品はまた、CAPES（ブラジル）からFCへの "Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciênciasem Fronteiras"
Materials
| Sucrose | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,211,211 | |
| CaCl2 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 2,112,211,210 | |
| MgCl2·6H2O | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,313,961,210 | |
| Protease inhibitor cocktail Set III | Millipore, Darmstadt, Germany | 535140 | |
| Trizma Base | Sigma, St. Louis, MO, USA | T1503 | |
| Tris-HCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,236,541,209 | |
| Triton X-100 | Sigma, St. Louis, MO, USA | X100 | |
| SDS | Sigma, St. Louis, MO, USA | L3771 | |
| Glycerol | Sigma, St. Louis, MO, USA | G5516 | |
| Bromophenol Blue | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,311,651,604 | |
| Dithiothreitol | Sigma, St. Louis, MO, USA | D0632 | |
| Tween 20 | Sigma, St. Louis, MO, USA | P2287 | |
| Non fat dry milk | |||
| NaCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,216,591,211 | |
| KCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,314,941,210 | |
| KH2PO4 | Merck | 4873 | |
| Na2HPO4 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,781,211 | |
| Basic 20 pH | Crison, Alella, Spain | ||
| Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer | VWR, Radnor, PA, USA. | ||
| Ultra-Clear Tubes (14x89mm) | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | 344059 | Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | UFC901008 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf, Hamburgo, Germany | ||
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | ||
| Sonifier 250 | Branson, Danbury, Connecticut | ||
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain | ||
| Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm | VWR, Radnor, PA, USA | 612-1702 | |
| Compact Balance EK-610 | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA | ||
| SuperSignal west pico chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | ||
| GR 200 Precision Balance | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Anti-GPR37 | Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory. | Primary antibodies used at a final concentration of 0.250ug/ml | |
| Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin | Abcam, Cambridge, United Kingdom | Primary antibodies diluted 1:10000 | |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:10000 | |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:30000 |
Referências
- Foster, M., Sherrington, C. S. Part III: The Central Nervous System. A Text Book of Physiology. , (1897).
- Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. . The fine structure of the nervous system. , (1991).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).
- Phillips, G. R., et al. The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution. Neuron. 32, 63-77 (2001).
- Pinheiro, P. S., et al. Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus. Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).
- Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus. Brain Res. 987, 49-58 (2003).
- Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat. Neurociência. 132, 893-903 (2005).
- Rodrigues, R. J. Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat. J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).
- Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum. Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).
- Lopes, J. P., et al. The role of parkinson’s disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system. J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR J. 38, 41-48 (1997).
- Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications. Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).
- Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).
- Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization. EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).
- Rezgaoui, M., et al. The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37. J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).
- Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. The Parkinson’s disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain. J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).
- Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).
- Takahashi, R., Imai, Y. Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson’s disease. J. Neurol. 250, 9 (2003).
