غشاء الدماغ تجزئة: أ<em> إكس فيفو</em> نهج لتقييم توطين البروتين سوبسينابتيك
Summary
هنا، نقدم بروتوكول غشاء الدماغ الدماغ الذي يمثل إجراء قوي لعزل البروتينات التي تنتمي إلى مقصورات متشابك مختلفة.
Abstract
تقييم تكوين البروتين متشابك وظيفة تشكل تحديا هاما في علم الأعصاب. ومع ذلك، فإنه ليس من السهل لتقييم العصبي الذي يحدث داخل المشابك لأنه ينظم للغاية من التفاعلات البروتين البروتين الحيوي والأحداث الفسفرة. وبالتالي، عندما يتم استخدام أي طريقة لدراسة انتقال متشابك، والهدف الرئيسي هو الحفاظ على هذه التعديلات الفسيولوجية عابرة. هنا، نقدم بروتوكول غشاء الدماغ الدماغ الذي يمثل إجراء قوي لعزل البروتينات التي تنتمي إلى مقصورات متشابك مختلفة. وبعبارة أخرى، يصف البروتوكول منهجية الكيمياء الحيوية لتنفيذ تخصيب البروتين من المشابك قبل المشبكي، بعد المشبكي، ومقصورات إكستراسينابتيك. أولا، يتم الحصول على سينابتوسوميس، أو محطات متشابك، من الخلايا العصبية التي تحتوي على جميع المقصورات متشابك عن طريق التدرج السكروز متقطع. من الجدير بالذكر، ونوعية هذا الإعداد الغشاء سنابتيك الأولي هو جritical. وفي وقت لاحق، يتم تحقيق العزلة من المقصورات سوبسينابتيك مختلفة مع ذوبان الضوء باستخدام المنظفات معتدلة في ظروف درجة الحموضة التفاضلية. هذا يسمح للفصل بواسطة التدرج و إيسوبيكنيك الطرد المركزي. وأخيرا، يتم التحقق من صحة تخصيب البروتين في المقصورات سوبسينابتيك مختلفة ( أي ما قبل ، وبعد و إكستراسينابتيك الكسور الغشاء) عن طريق تحليل إمونوبلوت باستخدام علامات البروتين متشابك تتميز جيدا ( أي سناب -25، بسد-95، و سينابتوبهيسين، على التوالي)، وبالتالي تمكين تقييم مباشر للتوزيع متشابك من أي بروتين الخلايا العصبية معينة.
Introduction
ويعتمد انتقال متشابك على السلامة الجسدية للالمشبك، وهو المفهوم الذي كان من المتوخى في وقت مبكر من عام 1897 من قبل فوستر و شيرينغتون 1 . وبالتالي، فهم توزيع المكونات العصبية الرئيسية (على سبيل المثال، القنوات الأيونية، ومستقبلات، وما إلى ذلك ) ضروري لتوضيح وظيفة متشابك، سواء في الظروف الطبيعية والمرضية. وقد ساهم المجهر الإلكتروني (إم) بشكل كبير في فكرة التركيبية الحالية للنماذج العصبية المركزية الجهاز العصبي المركزي (نس). في مثل هذه الطريقة، وقد حددت إم بدقة الاختلافات بين كثافة ما قبل وبعد المشبكي، والتي يتم فصلها عن طريق شق من مسافة موحدة بدلا (~ 25 نانومتر) 2 . ومن المثير للاهتمام، فإن الجهاز بعد المشبكي يظهر سماكة مستمرة نسبيا، والإلكترون الكثيفة تحت غشاء البلازما، ما يسمى كثافة بوستسينابتيك، أو بسد 2 . على العكس من ذلك، في جهاز بريسينابتيك، نوتيسابل يتم ترتيب شبكة سيتوماتريكس متقطع فقط تحت غشاء البلازما، وهو أمر ضروري لمحاذاة والالتحام من الحويصلات متشابك لغشاء البلازما منطقة نشطة 3 . وبالتالي، إم يشكل النهج التجريبي الذهبي لمسح توزيع البروتينات ضمن مشابك سنابسس المحفوظة هيكليا. ومع ذلك، فإن المعلومات التي تقدمها ميكروغرافس الإلكترون هو ثابت. في الواقع، وتراكم الأدلة تبين أن في المشابك العصبية الحيوية ديناميكية للغاية، وبالتالي تشهد تغييرات هيكلية دراماتيكية على انتقال متشابك المستدام. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التشكل وتكوين نقاط الاشتباك العصبي يمكن أن تتغير في مختلف مناطق الجهاز العصبي المركزي وعلى التنمية، والنضج، والشيخوخة، وتطوير الظروف العصبية. عموما، بروتوكول يركز على عزل البروتينات التي تنتمي إلى مقصورات متشابك مختلفة في الظروف الفسيولوجية يمثل أداة قيمة لدراسة أكثر شمولا من عمل متشابك.
<p cلاس = "jove_content"> هنا، نحن تصف هذا النوع من النهج التجريبي التكميلي، والذي يسمح للإثراء البيوكيميائي التحضيري للمقصورات غشاء متشابك مختلفة، وهي مجالات غشاء خارج، قبل و بعد المشبكي. هذه الطريقة غشاء تجزئة، وصفها أولا فيليبس وآخرون . (2001) 4 ، على التحول الحموضة الذي يضعف التفاعلات اللاصقة التي تحدث داخل الجهاز قبل وبعد المشبكي. أولا، باستخدام المنظفات معتدلة في الرقم الهيدروجيني 6.0، فمن الممكن تمييز مفترق الملتصقة التي تحمل الجهاز قبل وبعد المشبكي والتي يتم الحفاظ عليها من المجال غشاء إكستراسينابتيك، الذي هو سولوبيليزد، وبالتالي يمكن استخراجها من الاتصالات متشابك. في وقت لاحق، ورفع الرقم الهيدروجيني من 6.0 إلى 8.0 في وجود المنظفات معتدل يضعف قوة تقاطع الملتصقة التي تحافظ على منطقة نشطة قبل المشبكية ملزمة بشدة إلى كثافة ما بعد المشبكي. وبالتالي، فإن حجرة بريسينابتيك هو ذلكلوبيليزد ويمكن فصلها عن كثافة ما بعد المشبكي، والتي يتم الحفاظ عليها في الغالب لأن تركيز المنظفات المستخدمة لا يعزز لها الانحلال 4 . ومن المثير للاهتمام، وكفاءة تجزئة، في نهاية المطاف أعلى من 90٪، ويمكن التأكد من علامات مختلفة سوبسينابتيك: ط ) سينابتوسومال المرتبطة البروتين 25 (سناب -25)، من منطقة نشطة قبل المشبكي. إي) سينابتوفيسين، من جزء إكستراسينابتيك ( أي خارج المنطقة النشطة بما في ذلك ميكروسوميس). و 3 ) بروتين كثافة بعد المشبكي 95 (بسد-95)، من كثافة ما بعد المشبكي. والجدير بالذكر أن هذا الأسلوب تجزئة غشاء الدماغ قد استخدمت بنجاح. وفقا لذلك، كان من الممكن تحديد بدقة توطين المشبكي لمستقبلات مختلفة، مثل مستقبلات ألفا أمينو 3-هيدروكسي -5-ميثيل -4-إيزوكسازوليبروبيونيك (أمبا) 5 ، مستقبلات أدينوسين A 1 (A 1 R) 6 ،أدينوسين مستقبلات 2A (A 2A R) 7 ، أدينوسين ثلاثي الفوسفات (أتب) P2 مستقبلات 8 ، النيكوتينيك أسيتيل كوليني مستقبلات 9 ، ومستقبلات باركنسون المرتبطة GPR37 10 . ومع ذلك، فإن عددا من القيود قد تعيق التقييم الصحيح للتوزيع متشابك لبروتين الخلايا العصبية معينة. وهكذا، في هذا الإجراء، ونحن ليس فقط وصف كامل للبروتوكول بأكمله، ولكن نحن أيضا تسليط الضوء على بعض النقاط الحرجة التي ينبغي النظر فيها، مثل كمية كبيرة نوعا ما من الأنسجة اللازمة، وانخفاض العائد البروتين، والشرط الإلزامي للتحقق من كفاءة كل فصل قبل تنفيذ التجربة المحددة.Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظي هذا العمل بدعم من وزارة الاقتصاد والتجارة في كارلوس الثالث (SAF2014-55700-P، و PCIN- 2013-019-C03-03، و PIE14 / 00034)، و المعهد الدولي للثقافة والفنون (أكرا-أكاديميا-2010) )، و أجنتشاب فور إنوفاتي باب ويتنشاب إن تيشنولوجي (سبو-140028) إلى فك أيضا، X. M، ف-D، و فك تنتمي إلى "نيوروفارماكولوغي آند ألم" مجموعة أبحاث معتمدة (جينيراليتات دي كاتالونيا، 2014 سغر 1251) . وأيد العمل أيضا من قبل "برنامج بيسكيسادور فيسيتانت إسبيسيال-سينسيا سيم فرونتيراس" من كابيس (البرازيل) إلى فك
Materials
| Sucrose | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,211,211 | |
| CaCl2 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 2,112,211,210 | |
| MgCl2·6H2O | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,313,961,210 | |
| Protease inhibitor cocktail Set III | Millipore, Darmstadt, Germany | 535140 | |
| Trizma Base | Sigma, St. Louis, MO, USA | T1503 | |
| Tris-HCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,236,541,209 | |
| Triton X-100 | Sigma, St. Louis, MO, USA | X100 | |
| SDS | Sigma, St. Louis, MO, USA | L3771 | |
| Glycerol | Sigma, St. Louis, MO, USA | G5516 | |
| Bromophenol Blue | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,311,651,604 | |
| Dithiothreitol | Sigma, St. Louis, MO, USA | D0632 | |
| Tween 20 | Sigma, St. Louis, MO, USA | P2287 | |
| Non fat dry milk | |||
| NaCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,216,591,211 | |
| KCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,314,941,210 | |
| KH2PO4 | Merck | 4873 | |
| Na2HPO4 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,781,211 | |
| Basic 20 pH | Crison, Alella, Spain | ||
| Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer | VWR, Radnor, PA, USA. | ||
| Ultra-Clear Tubes (14x89mm) | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | 344059 | Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | UFC901008 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf, Hamburgo, Germany | ||
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | ||
| Sonifier 250 | Branson, Danbury, Connecticut | ||
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain | ||
| Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm | VWR, Radnor, PA, USA | 612-1702 | |
| Compact Balance EK-610 | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA | ||
| SuperSignal west pico chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | ||
| GR 200 Precision Balance | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Anti-GPR37 | Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory. | Primary antibodies used at a final concentration of 0.250ug/ml | |
| Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin | Abcam, Cambridge, United Kingdom | Primary antibodies diluted 1:10000 | |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:10000 | |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:30000 |
Referências
- Foster, M., Sherrington, C. S. Part III: The Central Nervous System. A Text Book of Physiology. , (1897).
- Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. . The fine structure of the nervous system. , (1991).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).
- Phillips, G. R., et al. The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution. Neuron. 32, 63-77 (2001).
- Pinheiro, P. S., et al. Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus. Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).
- Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus. Brain Res. 987, 49-58 (2003).
- Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat. Neurociência. 132, 893-903 (2005).
- Rodrigues, R. J. Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat. J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).
- Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum. Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).
- Lopes, J. P., et al. The role of parkinson’s disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system. J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR J. 38, 41-48 (1997).
- Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications. Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).
- Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).
- Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization. EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).
- Rezgaoui, M., et al. The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37. J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).
- Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. The Parkinson’s disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain. J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).
- Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).
- Takahashi, R., Imai, Y. Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson’s disease. J. Neurol. 250, 9 (2003).
