뇌막 분획 화 :<em> Ex Vivo</em> Subsynaptic Protein Localization 평가 방법
Summary
여기, 우리는 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 강력한 절차를 나타내는 뇌막 분화 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
시냅스 단백질의 구성과 기능을 평가하는 것은 신경 과학에서 중요한 과제입니다. 그러나 동적 인 단백질 – 단백질 상호 작용과 인산화 반응에 의해 조절되기 때문에 시냅스에서 발생하는 신경 전달을 평가하는 것은 쉽지 않습니다. 따라서, 어떤 방법이 시냅스 전달을 연구하는데 사용될 때, 주요 목표는 이러한 일시적인 생리 학적 변형을 보존하는 것이다. 여기, 우리는 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 강력한 절차를 나타내는 뇌막 분화 프로토콜을 제시합니다. 즉, 프로토콜은 presynaptic, postsynaptic, 그리고 extrasynaptic 구획에서 단백질 농축을 수행하는 생화학 방법론을 설명합니다. 첫째, synaptosomes, 또는 시냅스 터미널, 불연속 자당 그라디언트를 통해 모든 시냅스 구획을 포함하는 뉴런에서 얻은 것입니다. 참고로,이 초기 시냅스 막 준비의 품질은 c의복. 결과적으로, 다른 subsynaptic 구획의 분리는 차별적 인 pH 조건에서 순한 세제를 사용하여 가벼운 solubilization과 달성됩니다. 이것은 그래디언트 및 등 원심 원심 분리에 의한 분리를 허용합니다. 마지막으로, 다른 subsynaptic 구획 ( 즉, 사전, 사후 및 extrasynaptic 막 분수)에서 단백질 농축은 잘 특성화 된 시냅스 단백질 마커 ( 즉, SNAP – 25, PSD – 95, 그리고 synaptophysin을 사용하여 immunoblot 분석의 수단으로 유효성 검사, 각각의 신경 세포 단백질의 시냅스 분포를 직접 평가할 수있다.
Introduction
시냅스 전달은 시냅스의 물리적 무결성에 달려 있는데, 이것은 포스터 (Foster)와 셔링턴 (Sherrington)에 의해 1897 년에 상상 된 개념이다. 따라서 정상 신경계와 병리학 적 상태 모두에서 중요한 신경 전달 요소 ( 예 : 이온 채널, 수용체 등 )의 분포를 이해하는 것이 시냅스 기능을 해명하는 데 필수적입니다. 전자 현미경 (EM)은 프로토 타입 중추 신경계 (CNS) 시냅스의 현재의 미세 구조 개념에 엄청난 공헌을했습니다. 이러한 방식으로 EM은 사전 및 후기 시냅스 밀도의 차이를 정교하게 정의했으며, 이는 일정한 거리 (~ 25 nm)의 틈으로 구분됩니다. 흥미롭게도, postsynaptic 장치는 소위 postsynaptic 밀도, 또는 PSD 2 라는 자사의 원형 막 아래 상대적으로 지속적인, 전자 밀도 농축을 보여줍니다. 반대로, presynaptic 장치에서, noticeabl불연속 cytomatrix 네트워크는 원형 막 바로 아래에 배치되어 있으며, 이것은 시냅스 소포를 원형 막 멤브레인 활성 영역 3에 정렬 및 도킹하는 데 필수적입니다. 따라서 EM은 구조적으로 보존 된 CNS 시냅스 내에서 단백질 분포를 조사하기위한 황금 실험 접근법을 구성합니다. 그러나 전자 현미경 사진에서 제공하는 정보는 정적입니다. 사실, 축적 된 증거는 생체 내 시냅스가 극도로 역동적이어서 지속적인 시냅스 전달에서 극적인 구조 변화를 경험한다는 것을 보여줍니다. 또한, 시냅스의 형태와 구성은 다양한 CNS 지역에서 발달, 성숙, 노화 및 신경 병리학 적 상태의 발달에 따라 변할 수있다. 전반적으로 생리 조건에서 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 데 초점을 맞춘 프로토콜은 시냅스 기능에 대한보다 포괄적 인 연구를위한 유용한 도구입니다.
<p c여기, 우리는 다른 종류의 시냅스 멤브레인 컴 파트먼트, 즉 extra-pre-and postsynaptic membrane domains의 준비적인 생화학 적 농축을 가능하게하는 이런 종류의 상보 적 실험 접근법을 설명합니다. 필립스 (Philips) 등에 의해 처음으로 기술 된이 막 분획 화 방법은, (2001) 4 는 사전 및 사후의 시냅스 장치 내에서 발생하는 접착 상호 작용을 약화시키는 pH 변화에 기초한다. 첫째, pH 6.0에서 약한 세제를 사용하여 사전 및 사후 시냅스 장치를 보유하고 가용화되어 시냅스 접촉에서 추출 할 수있는 비회원 막 영역에서 유지되는 접착 접합을 식별 할 수 있습니다. 결과적으로, 중성 세제의 존재하에 pH를 6.0에서 8.0으로 올리는 것은 접합체 접합부의 강도를 약화시켜 접합 전 활성 영역이 접합 후 밀도에 단단히 결합되도록합니다. 따라서, presynaptic 구획은 너무윤활유는 후자 농도에서 분리 될 수 있는데, 이는 사용 된 세제의 농도가 그 가용화를 촉진시키지 않기 때문에 대부분 보존된다. 흥미롭게도, 분할 효율은 결국 90 % 이상으로, 다른 subsynaptic 마커에 의해 확인할 수 있습니다 : i ) synaptosomal 관련 단백질 25 (SNAP – 25), presynaptic 활성 영역에서; ii ) synaptophysin, extrasynaptic 분수에서 ( 즉, 활성 영역 외부 및 microsomes 포함); 그리고 ⅲ ) postsynaptic density 단백질 95 (PSD-95). 특히,이 뇌막 분화 방법은 성공적으로 사용되었습니다. 따라서, 알파 – 아미노 -3- 하이드 록시 -5- 메틸 -4- 이속 사졸 프로피온산 (AMPA) 수용체 5 , 아데노신 A1 수용체 (A1R) 6 및 아데노신 A1 수용체와 같은 상이한 수용체의 부갑상선의 국소화를 정확하게 결정할 수 있었다. ,아데노신 A 2A 수용체 (A 2A R) 7 , 아데노신 트리 포스페이트 (ATP) P2 수용체 8 , 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 서브 유닛 9 및 파킨슨 병 관련 수용체 GPR37 10 . 그러나, 여러 가지 제한 사항은 특정 연결 단백질의 시냅스 분포의 적절한 평가를 방해 할 수 있습니다. 따라서이 과정에서 우리는 전체 프로토콜을 완전하게 기술 할뿐만 아니라, 필요한 많은 양의 조직, 낮은 단백질 수율 및 단백질의 효율을 검증하기위한 필수 요구 사항과 같은 고려해야 할 중요한 포인트를 강조합니다. 명확한 실험을하기 전에 각 분리.Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 뇌 영역 내의 특정 단백질의 부갑상선 분포 연구에 대한 강력한 생화학 도구를 구성합니다. 그러나 여기서 강조해야 할 기술에 내재 된 몇 가지 단점이 있습니다. 예를 들어, 주요 제한 사항 중 하나는 모든 subsynaptic 분수의 immunoblot 분석을 수행하기 위해 합리적인 금액의 단백질을 정화하는 데 필요한 조직의 상대적으로 큰 금액입니다. 이 문제는 시냅스 ( 즉, 시?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 ICELA Academia-2010 (ICREA Academia-2010)의 Catalina de Recerca / Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 및 PIE14 / 00034) ), FC에 대한 Wenenschap en Technologie (SBO-140028)의 이그 제 큐 티브 (AGENTCHAP VOR Innovatie) 기술 연구소 (SBM-140028) 또한 X, M, VF-D. 및 FC는 "Neuropharmacology and Pain" . 이 작품은 CAPES (브라질)에서 FC까지 "Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras"
Materials
| Sucrose | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,211,211 | |
| CaCl2 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 2,112,211,210 | |
| MgCl2·6H2O | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,313,961,210 | |
| Protease inhibitor cocktail Set III | Millipore, Darmstadt, Germany | 535140 | |
| Trizma Base | Sigma, St. Louis, MO, USA | T1503 | |
| Tris-HCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,236,541,209 | |
| Triton X-100 | Sigma, St. Louis, MO, USA | X100 | |
| SDS | Sigma, St. Louis, MO, USA | L3771 | |
| Glycerol | Sigma, St. Louis, MO, USA | G5516 | |
| Bromophenol Blue | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,311,651,604 | |
| Dithiothreitol | Sigma, St. Louis, MO, USA | D0632 | |
| Tween 20 | Sigma, St. Louis, MO, USA | P2287 | |
| Non fat dry milk | |||
| NaCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,216,591,211 | |
| KCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,314,941,210 | |
| KH2PO4 | Merck | 4873 | |
| Na2HPO4 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,781,211 | |
| Basic 20 pH | Crison, Alella, Spain | ||
| Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer | VWR, Radnor, PA, USA. | ||
| Ultra-Clear Tubes (14x89mm) | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | 344059 | Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | UFC901008 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf, Hamburgo, Germany | ||
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | ||
| Sonifier 250 | Branson, Danbury, Connecticut | ||
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain | ||
| Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm | VWR, Radnor, PA, USA | 612-1702 | |
| Compact Balance EK-610 | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA | ||
| SuperSignal west pico chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | ||
| GR 200 Precision Balance | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Anti-GPR37 | Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory. | Primary antibodies used at a final concentration of 0.250ug/ml | |
| Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin | Abcam, Cambridge, United Kingdom | Primary antibodies diluted 1:10000 | |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:10000 | |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:30000 |
Referências
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