Fraccionamiento de Membranas Cerebrales: Un<em> Ex Vivo</em> Enfoque para evaluar la localización de proteínas subsinápticas
Summary
Aquí, presentamos un protocolo de fraccionamiento de membrana cerebral que representa un procedimiento robusto para aislar proteínas pertenecientes a diferentes compartimentos sinápticos.
Abstract
La evaluación de la composición y función de las proteínas sinápticas constituye un desafío importante en la neurociencia. Sin embargo, no es fácil evaluar la neurotransmisión que ocurre dentro de las sinapsis porque está altamente regulada por interacciones proteína-proteína dinámicas y eventos de fosforilación. Por consiguiente, cuando se utiliza cualquier método para estudiar la transmisión sináptica, un objetivo principal es preservar estas modificaciones fisiológicas transitorias. Aquí, presentamos un protocolo de fraccionamiento de membrana cerebral que representa un procedimiento robusto para aislar proteínas pertenecientes a diferentes compartimentos sinápticos. En otras palabras, el protocolo describe una metodología bioquímica para llevar a cabo el enriquecimiento de proteínas de los compartimentos presinápticos, postsinápticos y extrasinápticos. En primer lugar, los sinaptosomas, o terminales sinápticas, se obtienen a partir de neuronas que contienen todos los compartimentos sinápticos por medio de un gradiente discontinuo de sacarosa. De la nota, la calidad de esta preparación inicial de la membrana sináptica es cRitical Posteriormente, el aislamiento de los diferentes compartimentos subsinápticos se logra con solubilización ligera usando detergentes suaves a condiciones de pH diferenciales. Esto permite la separación por gradiente y centrifugaciones isopicnicas. Por último, el enriquecimiento de proteínas en los diferentes compartimentos subsinápticos ( es decir, las fracciones de membrana pre, post y extrasináptica) se valida mediante el análisis de inmunotransferencia utilizando marcadores de proteínas sinápticas bien caracterizados (SNAP-25, PSD-95 y sinaptofisina, Respectivamente), lo que permite una evaluación directa de la distribución sináptica de cualquier proteína neuronal en particular.
Introduction
La transmisión sináptica se basa en la integridad física de la sinapsis, concepto que fue concebido ya en 1897 por Foster y Sherrington 1 . Por lo tanto, la comprensión de la distribución de componentes clave de neurotransmisión ( por ejemplo, canales iónicos, receptores, etc. ) es esencial para elucidar la función sináptica, tanto en condiciones normales como patológicas. La microscopía electrónica (EM) ha contribuido enormemente a la noción ultraestructural actual de las sinapsis prototípicas del sistema nervioso central (SNC). De esta manera, EM ha establecido finamente las diferencias entre densidades pre y postsinápticas, que están separadas por una hendidura de una distancia bastante uniforme (~ 25 nm) 2 . Curiosamente, el aparato postsináptico exhibe un espesamiento denso de electrones relativamente continuo por debajo de su membrana plasmática, la denominada densidad postsináptica, o PSD2. Por el contrario, en el aparato presináptico,La red cytomatrix discontinua se dispone justo debajo de la membrana plasmática, que es esencial para la alineación y acoplamiento de las vesículas sinápticas a la zona activa 3 de la membrana plasmática. Por lo tanto, EM constituye el método experimental dorado para examinar la distribución de proteínas dentro de las sinapsis estructuralmente preservadas del SNC. Sin embargo, la información proporcionada por las micrografías electrónicas es estática. De hecho, las evidencias acumuladas muestran que las sinapsis in vivo son extremadamente dinámicas, experimentando cambios estructurales dramáticos tras la transmisión sináptica sostenida. Además, la morfología y composición de las sinapsis puede cambiar a lo largo de diferentes regiones del SNC y al desarrollo, maduración, envejecimiento y el desarrollo de condiciones neuropatológicas. En general, un protocolo centrado en el aislamiento de proteínas pertenecientes a diferentes compartimentos sinápticos en condiciones fisiológicas representa una herramienta valiosa para un estudio más completo del funcionamiento sináptico.
<p cAquí, describimos este tipo de enfoque experimental complementario, que permite el enriquecimiento bioquímico preparativo de los diferentes compartimentos de la membrana sináptica, a saber, los dominios de membrana extra, pre y postsináptica. Este método de fraccionamiento de membrana, descrito por primera vez por Philips et al . (2001) 4 , se basa en un cambio de pH que debilita las interacciones adhesivas que ocurren dentro del aparato pre y postsináptico. En primer lugar, utilizando detergentes suaves a pH 6,0, es posible discernir la unión adherente que sostiene el aparato pre y postsináptico y que se mantiene desde el dominio de la membrana extrasináptica, que se solubiliza y por lo tanto se puede extraer de los contactos sinápticos. Posteriormente, elevar el pH de 6,0 a 8,0 en presencia de detergentes suaves debilita la resistencia de la unión de adherentes que mantiene la zona presináptica activa estrechamente unida a la densidad postsináptica. Por lo tanto, el compartimiento presináptico es tanLubilizado y se puede separar de la densidad postsináptica, que se conserva en su mayor parte porque la concentración de detergente utilizado no favorece su solubilización 4 . Curiosamente, la eficiencia de fraccionamiento, eventualmente superior al 90%, puede ser confirmada por diferentes marcadores subsinápticos: i ) la proteína 25 asociada sinaptosomal (SNAP-25), de la zona activa presináptica; Ii ) sinaptofisina, de la fracción extrasináptica ( es decir, fuera de la zona activa e incluyendo microsomas); Y iii ) proteína de densidad postsináptica 95 (PSD-95), a partir de la densidad postsináptica. En particular, este método de fraccionamiento de membrana cerebral se ha utilizado con éxito. En consecuencia, se ha podido determinar con precisión la localización subsináptica de diferentes receptores, tales como los receptores 5 de ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA), el receptor A1 de adenosina (A 1 R) 6 ,Receptor A 2A de adenosina (A 2A R) 7 , receptores P2 de trifosfato de adenosina (ATP) 8 , subunidades nicotínicas de receptor de acetilcolina 9 y receptor GPR37 asociado con la enfermedad de Parkinson 10 . Sin embargo, una serie de limitaciones pueden impedir la evaluación adecuada de la distribución sináptica de una proteína neuronal particular. Por lo tanto, en este procedimiento, no sólo describimos completamente el protocolo completo, sino que también destacamos algunos puntos críticos a considerar, como la cantidad bastante grande de tejido necesario, el bajo rendimiento proteínico y el requisito obligatorio para validar la eficiencia de Cada separación antes de realizar el experimento definido.Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo del Ministerio de Economía y Competitividad, Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 y PIE14 / 00034), Instituciò Catalana de Recerca i Estudis Avançats ), Y FC pertenecen al grupo de investigación acreditado "Neurofarmacología y Dolor" (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251), y el Grupo de Investigación acreditado Neurofarmacología y Dolor (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) . El trabajo también contó con el apoyo del Programa de Visitantes Especiales-Ciência sem Fronteiras de CAPES (Brasil) a FC
Materials
| Sucrose | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,211,211 | |
| CaCl2 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 2,112,211,210 | |
| MgCl2·6H2O | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,313,961,210 | |
| Protease inhibitor cocktail Set III | Millipore, Darmstadt, Germany | 535140 | |
| Trizma Base | Sigma, St. Louis, MO, USA | T1503 | |
| Tris-HCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,236,541,209 | |
| Triton X-100 | Sigma, St. Louis, MO, USA | X100 | |
| SDS | Sigma, St. Louis, MO, USA | L3771 | |
| Glycerol | Sigma, St. Louis, MO, USA | G5516 | |
| Bromophenol Blue | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,311,651,604 | |
| Dithiothreitol | Sigma, St. Louis, MO, USA | D0632 | |
| Tween 20 | Sigma, St. Louis, MO, USA | P2287 | |
| Non fat dry milk | |||
| NaCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,216,591,211 | |
| KCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,314,941,210 | |
| KH2PO4 | Merck | 4873 | |
| Na2HPO4 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,781,211 | |
| Basic 20 pH | Crison, Alella, Spain | ||
| Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer | VWR, Radnor, PA, USA. | ||
| Ultra-Clear Tubes (14x89mm) | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | 344059 | Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | UFC901008 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf, Hamburgo, Germany | ||
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | ||
| Sonifier 250 | Branson, Danbury, Connecticut | ||
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain | ||
| Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm | VWR, Radnor, PA, USA | 612-1702 | |
| Compact Balance EK-610 | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA | ||
| SuperSignal west pico chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | ||
| GR 200 Precision Balance | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Anti-GPR37 | Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory. | Primary antibodies used at a final concentration of 0.250ug/ml | |
| Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin | Abcam, Cambridge, United Kingdom | Primary antibodies diluted 1:10000 | |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:10000 | |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:30000 |
Referências
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