קרום המוח Fractation: An<em> אקס ויוו</em> גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול קרום המוח פרוקציה המייצג תהליך חסון לבודד חלבונים השייכים תאים סינפטית שונים.
Abstract
הערכת הרכב החלבון הסינפטי ותפקודו מהווה אתגר חשוב בתחום מדעי המוח. עם זאת, לא קל להעריך נוירוטרנסמינציה המתרחשת בתוך סינפסות כי זה מוסדר מאוד על ידי אינטראקציות חלבונים דינמי דינמי ואירועים זרחן. לפיכך, כאשר כל שיטה משמשת כדי ללמוד שידור סינפטית, המטרה העיקרית היא לשמור על שינויים אלה פיזיולוגיים חולף. כאן, אנו מציגים פרוטוקול קרום המוח פרוקציה המייצג תהליך חסון לבודד חלבונים השייכים תאים סינפטית שונים. במילים אחרות, פרוטוקול מתאר מתודולוגיה ביוכימי לבצע העשרת חלבון מ presynaptic, postsynaptic, ו extrasynaptic תאים. ראשית, synaptosomes, או מסופים סינפטי, מתקבלים נוירונים המכילים את כל תאים סינפטיים באמצעות שיפוע סוכרוז רציפה. ראוי לציין, את האיכות של ההכנה הראשונית הממברנה הסינפטי הזה הוא גקריטי. לאחר מכן, בידוד של תאים subsynaptic שונים מושגת עם solubilization קל באמצעות דטרגנטים מתונים בתנאים pH דיפרנציאלי. זה מאפשר הפרדה לפי צנטריפוגה ו צנטריפוגות isopycnic. לבסוף, העשרת החלבון בתאים הסובסינפטיים השונים ( כלומר, שברי קרום לפני ואחרי) נבדקה באמצעות ניתוח אימונובלוט תוך שימוש בסמנים חלבונים סינפטיים המאופיינים היטב ( כלומר, SNAP-25, PSD-95 ו- synaptophysin, בהתאמה), ובכך מאפשר הערכה ישירה של התפלגות הסינפטי של כל חלבון נוירונים מסוים.
Introduction
שידור סינפטית מסתמך על השלמות הפיזית של הסינפסה, מושג שנחזה כבר בתחילת 1897 על ידי פוסטר ו Sherrington 1 . לכן, הבנת התפלגות של מרכיבים ניירוטרנסמיים מרכזיים ( למשל, תעלות יונים, קולטנים וכו ' ) חיונית להבהרת הפונקציה הסינפטית, הן בתנאים הנורמליים והן בפתולוגים. מיקרוסקופית אלקטרונים (EM) תרמה רבות לרעיון ultrastructural הנוכחי של סינפסות מערכת העצבים המרכזית (CNS). בדרך זו, EM הקימה היטב את ההבדלים בין צפיפות טרום-פוסטינפטית, אשר מופרדים על ידי סדק של מרחק אחיד למדי (~ 25 ננומטר) 2 . מעניין, את מנגנון postsynaptic מציגה רציפה יחסית, עיבוי צפוף אלקטרונים מתחת קרום הפלזמה שלה, שנקרא צפיפות postsynaptic, או PSD 2 . לעומת זאת, במנגנון presynaptic, הודעה E רשת רציפה cytomatrix מסודרת בדיוק מתחת קרום פלזמה, אשר חיוני היישור ואת עגינה של שלפוחית סינפטי לאזור קרום פלזמה פעיל 3 . לפיכך, EM מהווה את הגישה הניסויית הזהב לסקור את החלוקה של חלבונים בתוך סינפסה CNS נשמר מבנית. עם זאת, המידע שסופק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הוא סטטי. ואכן, הצטברות הראיות עולה כי סינפסות vivo הם דינמיים מאוד, ובכך חווים שינויים מבניים דרמטי על שידור סינפטי מתמשכת. בנוסף, המורפולוגיה ואת הרכב הסינפסות יכול להשתנות בכל אזורי CNS שונים על התפתחות, התבגרות, הזדקנות, ופיתוח של תנאים נוירופתולוגי. בסך הכל, פרוטוקול התמקד בידוד חלבונים השייכים תאים סינפטי שונים בתנאים פיזיולוגיים מייצג כלי רב ערך עבור מחקר מקיף יותר של תפקוד סינפטי.
<p clace = "jove_content"> כאן, אנו מתארים סוג זה של גישה ניסויית משלימה, המאפשרת העשרה ביוכימית הכנה של תאים שונים קרום סינפטי, כלומר, תוספת, מראש ו-דפוסי postsynaptic הממברנה. שיטה זו שברירית הממברנה, שתוארה לראשונה על ידי Philips et al . (2001) 4 , מבוסס על שינוי pH כי מחלישה את אינטראקציות דבק המתרחשים בתוך מראש ו postsynaptic המנגנון. ראשית, באמצעות דטרגנטים מתונה ב pH 6.0, ניתן להבחין צומת adherers המחזיקה מראש ו postsynaptic המנגנון וכי נשמר מן תחום קרום extrasynaptic, אשר solubilized ולכן ניתן לחלץ מן אנשי הקשר הסינפטי. לאחר מכן, העלאת ה- pH מ 6.0 ל 8.0 בנוכחות דטרגנטים מתון מחליש את כוח צומת adherens שמחזיק את אזור פעיל presynaptic בחוזקה הצפיפות postsynaptic. לפיכך, התא presynaptic הוא כל כךLubilized ויכול להיות מופרדים צפיפות postsynaptic, אשר נשמר בעיקר בגלל ריכוז של חומר ניקוי בשימוש לא לקדם solubilization שלה 4 . מעניין, יעילות הפיצול, בסופו של דבר גבוה מ -90%, ניתן לאשר על ידי סמנים subsynaptic שונים: i ) synaptosomal הקשורים חלבון 25 (SNAP-25), מן אזור פעיל presynaptic; Ii ) synaptophysin, מן חלק extrasynaptic ( כלומר, מחוץ לאזור פעיל כולל microsomes); ו iii ) postsynaptic צפיפות חלבון 95 (PSD-95), מן צפיפות postsynaptic. יש לציין, שיטה זו שבירת המוח קרום שימש בהצלחה. לפיכך, ניתן היה לקבוע במדויק את לוקליזציה subynaptic של קולטנים שונים, כגון קולטנים שונים של אלפא-אמינו-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) 5 , אדנוזין קולטן A 1 (A 1 R) 6 ,אדנוזין קולטן 2A (A 2A R) 7 , אדנוזין טריפוספט (ATP) קולטנים P2 8 , קולטן אצטילכולין ניקוטין 9 , ו קולטן מחלת פרקינסון הקשורים GPR37 10 . עם זאת, מספר מגבלות עלול לעכב את הערכה נכונה של התפלגות הסינפטי של חלבון עצבי מסוים. לכן, בהליך זה, אנו לא רק לתאר באופן מלא את הפרוטוקול כולו, אבל אנחנו גם להדגיש כמה נקודות קריטיות להיחשב, כגון כמות גדולה למדי של רקמות הצורך, התשואה חלבון נמוך, ואת הדרישה המנדטורית כדי לאמת את היעילות של כל הפרדה לפני ביצוע הניסוי מוגדר.Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי Ministerio de Economà ¢ â, ¬ â "¢ â, ¬ â" ¢ DE / Salud קרלוס השלישי (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 ו- PIE14 / 00034), המכון לאקדמיה של אוניברסיטת אקרה ), ובדוקטורט ו – FC שייכים לקבוצת המחקר "נוירופרמקולוגיה וכאב" (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251). . היצירה נתמכה גם על ידי "תוכנית הפיסכיאדאריות ביקור בקרנות מיוחדות" מ – CAPES (ברזיל) ל FC
Materials
| Sucrose | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,211,211 | |
| CaCl2 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 2,112,211,210 | |
| MgCl2·6H2O | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,313,961,210 | |
| Protease inhibitor cocktail Set III | Millipore, Darmstadt, Germany | 535140 | |
| Trizma Base | Sigma, St. Louis, MO, USA | T1503 | |
| Tris-HCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,236,541,209 | |
| Triton X-100 | Sigma, St. Louis, MO, USA | X100 | |
| SDS | Sigma, St. Louis, MO, USA | L3771 | |
| Glycerol | Sigma, St. Louis, MO, USA | G5516 | |
| Bromophenol Blue | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,311,651,604 | |
| Dithiothreitol | Sigma, St. Louis, MO, USA | D0632 | |
| Tween 20 | Sigma, St. Louis, MO, USA | P2287 | |
| Non fat dry milk | |||
| NaCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,216,591,211 | |
| KCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,314,941,210 | |
| KH2PO4 | Merck | 4873 | |
| Na2HPO4 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,781,211 | |
| Basic 20 pH | Crison, Alella, Spain | ||
| Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer | VWR, Radnor, PA, USA. | ||
| Ultra-Clear Tubes (14x89mm) | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | 344059 | Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | UFC901008 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf, Hamburgo, Germany | ||
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | ||
| Sonifier 250 | Branson, Danbury, Connecticut | ||
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain | ||
| Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm | VWR, Radnor, PA, USA | 612-1702 | |
| Compact Balance EK-610 | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA | ||
| SuperSignal west pico chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | ||
| GR 200 Precision Balance | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Anti-GPR37 | Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory. | Primary antibodies used at a final concentration of 0.250ug/ml | |
| Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin | Abcam, Cambridge, United Kingdom | Primary antibodies diluted 1:10000 | |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:10000 | |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:30000 |
Referências
- Foster, M., Sherrington, C. S. Part III: The Central Nervous System. A Text Book of Physiology. , (1897).
- Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. . The fine structure of the nervous system. , (1991).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).
- Phillips, G. R., et al. The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution. Neuron. 32, 63-77 (2001).
- Pinheiro, P. S., et al. Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus. Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).
- Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus. Brain Res. 987, 49-58 (2003).
- Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat. Neurociência. 132, 893-903 (2005).
- Rodrigues, R. J. Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat. J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).
- Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum. Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).
- Lopes, J. P., et al. The role of parkinson’s disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system. J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR J. 38, 41-48 (1997).
- Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications. Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).
- Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).
- Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization. EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).
- Rezgaoui, M., et al. The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37. J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).
- Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. The Parkinson’s disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain. J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).
- Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).
- Takahashi, R., Imai, Y. Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson’s disease. J. Neurol. 250, 9 (2003).
